急性缺血性腦卒中患者血清DKK1水平與炎性反應及氧化應激的相關性研究*

劉 冰，霍會永，趙聰慧，劉曉霞，劉佳佳，張文超，劉 超，吳亭亭，李軍濤

河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北邯鄲 056001

急性缺血性腦卒中(AIS)是臨床常見的致死、致殘性腦血管疾病，其發(fā)病機制復雜，涉及炎性反應、氧化應激、神經(jīng)細胞凋亡等[1]，腦缺血時缺血神經(jīng)元可產(chǎn)生大量白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子誘導急性炎性反應。在缺血缺氧刺激下，一氧化氮合酶、氧自由基等大量合成，進一步誘導炎癥介質(zhì)基因表達，加劇炎性反應和局部腦組織損傷[2]。Dickkopf同源物1(DKK1)是Wnt蛋白信號通路拮抗劑，可促進炎癥因子釋放，介導內(nèi)皮細胞損傷，參與動脈粥樣硬化病變過程。臨床研究顯示DKK1是急性冠脈綜合征患者發(fā)生主要不良心血管事件的獨立預測因子[3]；動物研究顯示DKK1表達上調(diào)可加速缺血性神經(jīng)元細胞凋亡，阻斷DKK1可保護神經(jīng)細胞免受損傷[4-5]。DKK1在AIS中的研究報道并不多見，現(xiàn)有的報道顯示AIS患者血清DKK1水平明顯升高，DKK1是AIS潛在的預后生物標志物[6]，但是DKK1在AIS發(fā)病過程中的作用機制尚不清楚，本研究擬通過檢測AIS患者血清DKK1、炎癥因子和氧化應激指標水平，分析它們之間的相關性，旨在初步明確DKKI影響AIS的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年12月本院收治的135例AIS患者作為AIS組。AIS組納入標準：(1)首次AIS發(fā)病，頭顱CT提示局灶性腦實質(zhì)低密度影、大血管高密度征、皮質(zhì)腦溝后島帶消失等AIS征象，符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南(2014)》[7]；(2)年齡18～80周歲；(3)發(fā)病12 h內(nèi)入院。AIS組排除標準：(1)出血性腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)、顱腦腫瘤、顱腦外傷；(2)既往有AIS或腦出血病史；(3)近3個月有顱內(nèi)手術史；(4)合并惡性腫瘤、急慢性感染、免疫性疾病。另選擇71例TIA患者作為TIA組，106例同期于本院門診體檢健康的志愿者作為對照組，TIA診斷參考《英國急性卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的診斷與初始治療指南(第一部分)》[8]。本研究獲本院醫(yī)學倫理委員會批準。3組受試者均知曉本研究且簽署同意書。3組年齡、性別資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩大組基線資料及比較

AIS患者入院后24 h內(nèi)采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分評估患者神經(jīng)缺損程度，NIHSS評分從意識、視野、凝視、面癱、上下肢運動、共濟失調(diào)、感覺、語言、構音障礙進行評分，評分越高，患者神經(jīng)功能缺損越嚴重。根據(jù)NIHSS評分將AIS患者分為3個亞組[9]，輕度損傷組：NIHSS評分≤6分，共39例；中度損傷組：NIHSS評分7～14分，共67例；重度損傷組：NIHSS評分≥15分，共29例。輕度損傷組、中度損傷組、重度損傷組性別、年齡、梗死部位比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但梗死病因差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 AIS組的3個亞組基線資料及比較

1.2方法 AIS組、TIA組患者于入院24 h內(nèi)，對照組于體檢當日，采集外周靜脈血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取血清于-70 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)完成檢測。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清DKK1、炎性反應指標[促炎因子：IL-6、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)；抗炎因子：IL-4、IL-10、IL-13]、氧化應激指標[氧化指標：活性氧(ROS)、晚期蛋白氧化產(chǎn)物(AOPP)；抗氧化指標：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]水平，儀器為瑞士Hamilton FAME全自動酶聯(lián)免疫分析儀，試劑盒購自美國R&D公司。本研究實驗室檢測項目均由本院檢驗中心完成，板內(nèi)、板間變異系數(shù)<10.00%，所有步驟均嚴格按說明書要求進行操作。

2 結(jié) 果

2.1血清DKK1水平比較 AIS組、TIA組、對照組的血清DKK1水平分別為(640.50±35.49)、(381.15±31.52)、(356.50±32.49)pg/mL，3組血清DKK1水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，AIS組血清DKK1水平高于TIA組和對照組(P<0.05)，TIA組血清DKK1水平高于對照組(P<0.05)。

AIS患者重度損傷組、中度損傷組、輕度損傷組的血清DKK1水平分別為(803.25±35.73)、(624.45±34.47)、(547.05±36.72)pg/mL，3組血清DKK1水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，重度損傷組血清DKK1水平高于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)，中度損傷組DKK1水平亦高于輕度損傷組(P<0.05)。

2.2血清炎性反應指標比較 AIS組、TIA組和對照組血清IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AIS組血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于TIA組和對照組(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13水平均低于TIA組和對照組(P<0.05)；TIA組血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13水平均低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 AIS組、TIA組和對照組血清炎癥因子水平的比較或M(P25～P75)，pg/mL]

AIS患者輕度損傷組、中度損傷組、重度損傷組血清IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，重度損傷組血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13水平均低于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)；中度損傷組血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平均高于輕度損傷組(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13水平均低于輕度損傷組(P<0.05)。見表4。

表4 AIS患者輕度損傷組、中度損傷組、重度損傷組血清炎癥因子水平的比較或M(P25～P75)，pg/mL]

2.3氧化應激指標比較 AIS組、TIA組和對照組血清ROS、AOPP、SOD、CAT水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AIS組血清ROS、AOPP水平均高于TIA組和對照組(P<0.05)，SOD、CAT水平均低于TIA組和對照組(P<0.05)；TIA組血清ROS、AOPP水平均高于對照組(P<0.05)，SOD、CAT水平均低于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 AIS組、TIA組和對照組血清氧化應激指標水平的比較或M(P25～P75)]

AIS患者輕度損傷組、中度損傷組、重度損傷組血清ROS、AOPP、SOD、CAT水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度損傷組血清ROS、AOPP水平均高于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)，SOD、CAT水平均低于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)；中度損傷組血清ROS、AOPP水平均高于輕度損傷組(P<0.05)， SOD、CAT水平均低于輕度損傷組(P<0.05)。見表6。

表6 AIS患者輕度損傷組、中度損傷組、重度損傷組血清氧化應激指標水平的比較或M(P25～P75)]

2.4AIS患者的血清DKK1水平與炎性反應、氧化應激指標的相關性 Pearson相關分析結(jié)果顯示，AIS患者血清DKK1與IL-6(r=0.612，P<0.001)、TNF-α(r=0.539，P=0.003)、TGF-β(r=0.571，P<0.001)、ROS(r=0.602，P<0.001)、AOPP(r=0.531，P=0.005)呈正相關，與IL-4(r=-0.503，P=0.007)、IL-10(r=-0.498，P=0.009)、IL-13(r=-0.612，P<0.001)、SOD(r=-0.542，P=0.002)、CAT(r=-0.539，P=0.003)呈負相關。

3 討 論

AIS是世界范圍內(nèi)導致人類死亡和殘疾的主要病因，該病由腦動脈系統(tǒng)血管痙攣、閉塞導致，患者可出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)損傷[1]。AIS發(fā)病機制尚未完全闡明，探討與AIS發(fā)病相關的分子機制對于診斷、治療、預后預測均具有重要意義。

DKK1是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，可負性調(diào)控Wnt信號通路，促進神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展，并參與應激誘導的神經(jīng)元凋亡[10]。動物研究顯示腦出血大鼠腦組織DKK1表達增強，抑制DKK1可增加Wnt-1 mRNA轉(zhuǎn)錄，上調(diào)緊密連接蛋白1(ZO-1)表達，減少血腦屏障破壞和腦水腫，減輕神經(jīng)缺陷[4]，DKK1通過抑制Akt表達誘導神經(jīng)元凋亡[5]。臨床報道顯示AIS患者血清DKK1水平顯著升高[11]，血清DKK1水平是AIS患者長期預后不良的獨立預測因子[6]。本研究結(jié)果同樣顯示AIS患者血清DKK1水平升高，高于TIA組和對照組(P<0.05)，且DKK1水平與AIS患者神經(jīng)損傷程度存在一定關系，說明AIS發(fā)病可誘導DKK1生成增加，在AIS病情進展過程中DKK1過度升高可能加重神經(jīng)缺損程度。本研究發(fā)現(xiàn)，TIA組血清DKK1水平較對照組亦增高(P<0.05)，提示腦組織短暫缺血也可引起 DKK1水平出現(xiàn)小幅度的升高，DKK1對腦缺血反應較為敏感。DKK1參與AIS發(fā)病的作用機制：首先，DKK1參與AIS發(fā)病前的動脈粥樣硬化過程。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路可通過抑制脂質(zhì)合成，阻礙巨噬細胞泡沫化和動脈粥樣硬化斑塊壞死和纖維帽破裂，抑制平滑肌細胞增殖、遷移，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[12]。DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路抑制劑，其過度表達可阻斷Wnt/β-catenin信號通路，促進動脈粥樣硬化進程。動物研究也顯示抑制DKK1可減弱血管單核細胞黏附和內(nèi)皮損傷，沉默DKK1基因則限制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生[13]。其次，DKK1參與AIS后神經(jīng)細胞凋亡過程。Wnt通過正向調(diào)節(jié)Akt信號通路，促使細胞存活、增殖生長，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用[14]。DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑，可負向調(diào)控Akt信號通路，誘導神經(jīng)細胞凋亡。

動脈粥樣硬化是AIS發(fā)病的主要病理基礎，炎性反應貫穿動脈粥樣硬化和不穩(wěn)定斑塊形成、脫落、栓塞等整個過程[15]。IL-6、TNF-α、TGF-β是典型的促炎因子，IL-4、IL-10、IL-13是公認的抗炎因子?，F(xiàn)有研究顯示IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13與腦梗死局部炎性反應密切相關[16]。本研究結(jié)果表明，AIS發(fā)病過程中炎性反應處于激活狀態(tài)，炎癥因子生成顯著增多，炎性反應參與AIS發(fā)病和疾病進展過程。相關性分析結(jié)果顯示，DKK1與IL-6、TNF-α、TGF-β呈正相關，與IL-4、IL-10、IL-13呈負相關，說明AIS患者體內(nèi)過度合成的DKK1對炎性介質(zhì)分泌具有促進作用，對抗炎因子分泌具有抑制作用。DKK1可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控AIS炎性反應，Wnt/β-catenin信號通路可通過抑制巨噬細胞向經(jīng)典激活巨噬細胞分化，抑制CD4+T細胞向Th2和Treg細胞分化，抑制促炎介質(zhì)分泌、促使抗炎因子表達，發(fā)揮抗炎作用[17]。因此DKK1過度表達可能抑制Wnt/β-catenin信號通路，導致促炎因子過度釋放，加劇炎性反應。

局部腦血管堵塞可引起周圍神經(jīng)細胞缺血缺氧，大量ROS、氧自由基、一氧化氮合酶生成，促使脂質(zhì)過氧化，直接損害神經(jīng)細胞，導致神經(jīng)細胞凋亡和神經(jīng)功能異常[18]。氧化物自由基作為炎性反應啟動因子，可促進炎癥因子釋放，加重炎性反應損傷[19]。 ROS、AOPP是典型氧化代謝產(chǎn)物，SOD、CAT是抗氧化物質(zhì)[20]，腦組織缺氧狀態(tài)下氧化代謝產(chǎn)物合成增加，消耗體內(nèi)抗氧化物質(zhì)，引起局部及全身氧化/抗氧化失衡，腦損傷越嚴重，氧化應激反應越強烈[21]。本研究結(jié)果表明，AIS患者發(fā)病過程中氧化/抗氧化失衡，氧化代謝產(chǎn)物生成增多，導致過度氧化應激反應。相關性分析結(jié)果顯示，DKK1與氧化產(chǎn)物ROS、AOPP均呈正相關，與抗氧化因子SOD、CAT呈負相關，說明AIS患者體內(nèi)過度合成的DKK1可導致氧化/抗氧化失衡，引發(fā)局部缺血病灶氧化應激損傷?，F(xiàn)有研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路與缺血再灌注損傷誘導的氧化應激密切相關，氧化應激可抑制Wnt/β-catenin信號通路，Wnt/β-catenin信號通路活化可抑制氧化應激反應，抑制氧化應激誘導的細胞凋亡[22]。推測AIS患者在缺血缺氧應激下發(fā)生過度氧化應激反應，抑制了Wnt/β-catenin信號通路，導致DKK1合成增多，DKK1又進一步抑制Wnt/β-catenin信號通路，引起氧化/抗氧化失衡。

綜上所述，AIS患者血清DKK1水平與TIA人群及健康人群相比明顯升高，且患者的神經(jīng)功能缺損程度越嚴重，其水平越高。DKK1可能通過Wnt/β-catenin信號通路激活炎性反應和氧化應激反應參與AIS的發(fā)病和進展過程，檢查其在血清中的表達水平有助于評估AIS患者的病情。