T細胞受體基因工程T細胞治療的現(xiàn)狀與未來

王丹陽，熊昕昕，劉海平，周鵬輝*

（1. 華南腫瘤學國家重點實驗室 中山大學腫瘤防治中心，廣東 廣州 510060；2. 廣東省人民醫(yī)院 廣東醫(yī)學科學院，廣東 廣州 510055；3. 廣州泛恩生物科技有限公司，廣東 廣州 510535）

根據(jù)GLOBOCAN 2020最新數(shù)據(jù)，2020年全球新增癌癥病例達1 930萬，并且有將近1 000萬人死于癌癥[1]。手術(shù)、傳統(tǒng)化療、放射治療等傳統(tǒng)治療方法在癌癥治療中一直起著主導作用，然而這些方法的治療效果較為局限，尤其是晚期患者很難從這些治療方法中長期獲益。近年來以基因修飾T細胞為中心的過繼細胞治療（adoptive cell therapy，ACT），包括嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）和T細 胞 受 體 基因 工 程T細 胞（T cell receptor-engineered T cell，TCR-T）療法[2]，引起全世界廣泛的關(guān)注，各種研究及臨床試驗數(shù)量呈指數(shù)級增長。其中，CAR-T療法在血液腫瘤中取得了卓越的療效[3-4]，但是部分研究認為其在實體腫瘤上的治療效果并不令人滿意[5]。TCR-T治療在實體腫瘤的治療中具有非常大的發(fā)展?jié)摿?，本文闡述TCR-T治療的優(yōu)勢、目前的研究現(xiàn)狀以及現(xiàn)存的問題和挑戰(zhàn)，并將討論未來TCR-T治療的發(fā)展方向，以期獲得更好的治療效果和更低的毒性或副作用，為實體腫瘤患者帶來更高的獲益。

1 嵌合抗原受體T細胞與T細胞受體基因工程T細胞

T細胞在癌癥患者的適應性免疫應答中發(fā)揮著重要的作用，它通過T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別特異性肽表位與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）形成的復合物而被激活，這些肽表位主要來源于腫瘤細胞表達的內(nèi)源性蛋白[6]。CAR-T是人工制造的可表達靶向腫瘤的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細胞，CAR是由單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的單鏈可變片段（single chain variable fragment，scFv）與CD3 ζ鏈和1或2個共刺激信號基因融合而成的抗原受體[7]。TCR-T則是指將具有腫瘤抗原特異性的TCR通過基因工程技術(shù)導入到T細胞中，使T細胞獲得識別和殺傷腫瘤細胞的功能[8]。CAR-T與TCR-T結(jié)構(gòu)如圖1所示。盡管CAR-T治療對血液系統(tǒng)惡性腫瘤顯示出良好的效果，但對實體腫瘤的效果并不令人滿意[9]。

圖1 T細胞受體基因工程T細胞與嵌合抗原受體T細胞Figure 1 T cell receptor-engineered T cell and chimeric antigen receptor T cell

與CAR-T相比，TCR-T具有多個優(yōu)勢，有望成為 ACT治療實體瘤的新支柱。在CAR-T治療中，CAR中的scFv識別的抗原通常為表達于細胞膜的蛋白。然而，膜蛋白的數(shù)量較為有限，在腫瘤細胞中特異表達但在正常組織中不表達或低表達者過少。因此，能夠應用于實體瘤的CAR-T治療靶點非常有限。而MHC呈遞的抗原包含了細胞內(nèi)表達的所有蛋白，無論胞內(nèi)抗原、膜抗原還是分泌蛋白抗原，均有可能與MHC分子結(jié)合，從而被細胞的TCR識別，因此TCR-T治療具有更廣的靶標范圍[10]。另外，部分腫瘤是由致癌病毒引起，靶向癌病毒抗原同樣能夠獲得相應的治療效果。而大部分病毒抗原屬于胞內(nèi)蛋白，因此TCR-T治療也是病毒性腫瘤細胞治療中的優(yōu)選方案[11]。此外，每個CAR需要1 000余個抗原來激活，而每個TCR的激活僅需1 ～ 50個抗原，這使得TCR-T能夠識別低豐度的腫瘤抗原[12]。另有研究表明，CAR-T主要分布在腫瘤周圍以獲取表面抗原，而TCR-T可以穿透腫瘤，這使得TCR-T在癌癥治療中更有效率[13]。

CAR-T治療中出現(xiàn)的嚴重不良反應也限制了其發(fā)展，常見的不良反應有細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）、CAR-T相關(guān)腦病綜合征（CAR-T related encephalopathy syndrome，CRES）等[14]。CRS主要由CAR-T與靶細胞結(jié)合后活化產(chǎn)生大量細胞因子和趨化因子，進而導致全身炎癥反應所致，主要表現(xiàn)為高熱，嚴重者可出現(xiàn)肺水腫、低血壓、多器官衰竭和循環(huán)衰竭而死亡。盡管TCR比CAR的敏感性更高，但TCR-T治療中的細胞因子釋放量更少[10,15]。因此，與CAR-T治療相比，TCR-T治療發(fā)生CRS的風險可能更低。

2 腫瘤抗原

腫瘤免疫治療的效果在很大程度上依賴于合適的腫瘤抗原和可特異性識別抗原的T細胞。從1991年首個人類腫瘤抗原——黑色素瘤抗原-A1（melanoma-associated antigen A1，MAGEA1）被鑒定以來[16]，到目前已在各種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了許多不同的腫瘤抗原，大致可分為腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigens，TAAs）、腫瘤相關(guān)病毒抗原（tumor associated viral antigens）、腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigens，TSAs）、非傳統(tǒng)的腫瘤抗原（unconventional tumor antigens，UCAs）4類[17]。

2.1 腫瘤相關(guān)抗原

TAAs是指在某些正常組織中低表達或在免疫豁免器官中表達，但在腫瘤中高表達的抗原，是正?；虻漠a(chǎn)物。如癌睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和組織分化抗原（tissue differentiation antigens，TDAs）等。紐約-食管癌抗原-1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）和MAGE-A屬于在睪丸中特異表達，而在某些腫瘤組織中異常表達的CTA；CEA在胚胎發(fā)育過程中表達，胚胎發(fā)育完成后停止表達，但在一些腫瘤組織中出現(xiàn)異常高表達，目前被認為是結(jié)直腸癌和其他一些腫瘤的重要標志物；TDAs則通常局限于腫瘤和腫瘤來源的組織，例如糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）局限于皮膚、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）局限于前列腺等；另外還有一部分在癌癥中過表達的腫瘤抗原，例如人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和 人 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（human endogenous retroviruses，HERVs）抗原。HERVs是幾百萬年前的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到人類基因組中的殘余物，在正常組織中是表觀遺傳沉默的，但可以通過DNA去甲基化在腫瘤中表達，成為抗原。目前針對TAAs的TCR-T治療已有多個臨床試驗在開展。

2.2 腫瘤相關(guān)病毒抗原

一部分實體瘤因病毒感染而產(chǎn)生，其中病毒基因整合到細胞基因組導致具有致癌特性的病毒蛋白的表達。例如，E6和E7癌蛋白的表達是由感染人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的高危毒株產(chǎn)生，它促進了一些頭頸部癌、宮頸癌和肛門癌亞群的發(fā)生和發(fā)展[18]。此外肝癌的發(fā)生與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒有關(guān)，而鼻咽癌與EB病毒（Epstein-Bar virus，EBV）感染有關(guān)。病毒抗原與正常細胞蛋白顯著不同，能夠引發(fā)高親和力的TCR反應，因此病毒抗原具有較好的特異性和免疫原性，也是TCR-T和CAR-T治療的靶標抗原。

2.3 腫瘤特異性抗原

TSAs是由腫瘤細胞中的基因突變產(chǎn)生的新抗原，也被稱為新生抗原（neoantigens）。這類抗原在正常組織中不存在，因此針對這類抗原的免疫治療對正常組織的毒性很小。另外，這些抗原也沒有參與胸腺中的T細胞陰性選擇，因此與TAAs相比，體內(nèi)存在識別TSAs的高親和力TCR，更適合進行免疫治療。然而，TSAs來源于基因組中的隨機突變，大部分驅(qū)動基因突變的免疫原性低，因此針對這類抗原的TCR-T只適合個體化治療。另外，TSAs既要有一定的表達量，還必須與MHC分子有效結(jié)合才能夠被呈遞到細胞表面成為抗原，因此只有一部分突變的蛋白能夠成為腫瘤抗原。目前，在新生抗原的預測和鑒定上仍存在較大的問題，預測的準確率較低。同時，篩選和鑒定識別某個抗原的特異TCR也需要較長的時間。以上原因?qū)е掳邢蛱囟ㄐ驴乖腡CR-T治療難以實現(xiàn)，以TSAs為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗則有多個臨床試驗在開展。鑒于患者的免疫系統(tǒng)在抗腫瘤免疫反應中會激活識別TSAs的T細胞，而這些腫瘤抗原特異性T細胞（tumor antigen-specific T cells，Tas）所攜帶的TCR可特異識別TSAs，因此如果能夠特異分離Tas并克隆這些細胞的TCRs，則能夠快速制備出TSAs特異的TCR-T，進行個體化治療，并且無需鑒定TSAs的抗原序列。

2.4 非傳統(tǒng)的腫瘤抗原

UCAs是指通過異常轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾，從基因組的非編碼區(qū)域或編碼區(qū)域產(chǎn)生的抗原。這些過程可能不完全是腫瘤特異性的，也可以發(fā)生在正常組織中。因此，非傳統(tǒng)的抗原可能具有TAAs的性質(zhì)，也可能具有TSAs的性質(zhì)。

3 T細胞受體基因工程T細胞治療的臨床研究進展

目前，有大量針對不同抗原的TCR-T治療進入臨床試驗（見表1）。已有的臨床試驗結(jié)果表明，TCR-T治療是一種有效的腫瘤治療方法。Johnson等[19]的研究顯示，接受T細胞識別黑色素瘤抗原1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）和gp100 TCR-T治療的黑色素瘤患者的客觀有效率分別為30%和19%，并且在細胞回輸1個月后，所有患者的血液中仍保持了高水平的TCR-T。Rapoport等[20]的研究顯示，20例晚期多發(fā)性骨髓瘤患者接受NY-ESO-1 TCR-T治療，其中有16例（80%）觀察到了治療效果。在另外一項NY-ESO-1 TCR-T治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和滑膜細胞肉瘤患者的臨床研究中，患者出現(xiàn)了持久的反應[21-22]。近期的一項NY-ESO-1 TCR-T治療復發(fā)、難治性或高危多發(fā)性骨髓瘤的研究顯示，細胞治療的中位總生存期為35.1個月，其中2例患者在近5年后病情無進展[23]。Tawara等[24]靶向Wilms瘤基因1（Wilms tumor gene 1，WT1）的TCR-T治療研究中，8例患者被分為2個劑量組接受TCR-T治療，結(jié)果均未觀察到靶向正常組織的不良事件；在研究結(jié)束時，5例患者可持續(xù)檢測到TCR-T，并且這5例患者中有4例存活超過12個月。這些結(jié)果均反映了TCR-T治療的有效性。

表1 T細胞受體基因工程T細胞治療臨床試驗Table 1 Clinical trials of T cell receptor-engineered T cell therapy

4 T細胞受體基因工程T細胞治療面臨的挑戰(zhàn)

4.1 腫瘤靶向的瘤外毒性

當TCR-T靶向的抗原不只在腫瘤上表達時，就會產(chǎn)生腫瘤靶向的瘤外毒性（on target off tumor toxicity）。Parkhust等[25]在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中使用了以CEA作為靶點的高親和力TCR-T進行治療，盡管所有接受治療的患者血清中的CEA水平均下降，但有3例患者出現(xiàn)了危及生命的結(jié)腸炎和結(jié)腸出血，試驗被迫終止。一項以MAGE-A3為靶點的TCR-T治療臨床試驗中，9例MAGE-A3高表達的患者（包括轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、滑膜肉瘤和食管癌）中5例患者在治療后獲得了局部反應；2例患者由于腦組織中表達的MAGE-A12含有與MAGE-A3類似的肽序列，導致TCR-T在大腦中產(chǎn)生交叉反應，出現(xiàn)嚴重的腦灰質(zhì)損傷，最后死亡[26]。

4.2 T細胞抗原受體α和β鏈的錯配及外源T細胞抗原受體的表達降低

大多數(shù)T細胞表達αβTCR，該TCR由肽鏈α和β組成，少數(shù)T細胞表達γδTCR，該TCR由肽鏈γ和δ組成[27]。目前的TCR-T多為αβTCR。將外源性TCR引入T細胞后，外源性TCR的α和β鏈與內(nèi)源性TCR的α和β鏈同時存在于同一T細胞中，會產(chǎn)生外源與內(nèi)源α和β鏈之間的錯配[28]。對接受TCR-T輸注小鼠的研究表明，這種錯配出現(xiàn)的新型TCR可能會導致嚴重的移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）[29]。此外，外源TCR必須與內(nèi)源TCR以及錯配的TCR競爭在細胞表面的表達，包括與CD3分子的競爭結(jié)合，這可能導致外源TCR在膜表面的表達水平降低，無法形成有效的T細胞激活，降低腫瘤殺傷功能[30]。因此，必須采取措施防止TCR的錯配。

4.3 主要組織相容性抗原復合體限制性

由于每個TCR均有其對應的MHC類型，導致患者既要表達靶向抗原，又要表達相應的MHC分子，才能進行治療。這使得適合TCR-T治療的患者數(shù)量大大減少。人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人類的MHC表達產(chǎn)物，其中HLA-A*0201亞型是白種人中的高頻HLA分子[31]，現(xiàn)有的TCR-T臨床試驗大多數(shù)與此亞型相關(guān)，而針對其他HLA亞型的TCR-T治療很少。

4.4 腫瘤微環(huán)境對T細胞受體基因工程T細胞的抑制

實體瘤微環(huán)境通過多種復雜的機制抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫反應，包括減少T細胞的浸潤、誘導T細胞耗竭等。TCR-T同樣面臨相同的問題。通過靜脈回輸?shù)腡CR-T需要高效進入腫瘤組織才能夠產(chǎn)生較強的抗腫瘤免疫反應，從而獲得治療效果。研究顯示，進入腫瘤的TCR-T長期暴露于腫瘤抗原刺激，同樣會發(fā)生T細胞耗竭，導致TCR-T功能失調(diào)，降低治療效果[32]。

4.5 T細胞受體基因工程T細胞的制備

晚期腫瘤患者的疾病進展迅速，過長的TCR-T制備流程會導致患者無法及時獲得治療，降低治療效果。另外，晚期腫瘤患者的外周免疫細胞功能狀態(tài)較差，影響TCR-T制備的成功率。目前，在較短時間內(nèi)制備出高質(zhì)量的TCR-T是一個挑戰(zhàn)[33]。

5 T細胞受體基因工程T細胞治療的未來

5.1 靶向腫瘤特異性抗原的T細胞受體基因工程T細胞治療

由于TSAs來自腫瘤細胞中的隨機突變，無法提前制備好相應的TCR-T，因此目前TCR-T治療均是靶向TAAs[34]。但是TAAs的數(shù)量非常有限，并且無法克服TAAs在正常組織中表達所引起的毒性和副作用。由于TSAs具有較高的免疫原性，且在正常組織中表達缺乏，因此靶向TSAs在療效和安全性上均具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的TCR-T的研制流程通常是在明確抗原序列后，通過篩選獲得特異識別抗原的TCR，并明確對應的MHC亞型再應用于治療。整個過程耗時長，效率低，不適合TSAs這類個體化的抗原。然而，患者的抗腫瘤免疫反應會激活自身體內(nèi)識別TSAs的T細胞，例如既往已經(jīng)從腫瘤患者中鑒定了識別TP53突變和KRASG12V突變的T細胞和TCR[35-36]。因此，可以從患者自身的腫瘤抗原特異T細胞中快速獲得特異識別TSAs的TCR，用于制備個體化的TCR-T進行治療。筆者團隊通過鑒定腫瘤抗原特異T細胞的分子標志物，實現(xiàn)了從患者的腫瘤組織中準確分離腫瘤抗原特異T細胞，并快速克隆其TCR，建立了個體化TCR-T治療的全套技術(shù)平臺，并開始了Ⅰ期臨床研究（NCT03891706）。

5.2 避免T細胞抗原受體的錯配

Morton等[37]通過規(guī)律成簇的間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/CRISPR相關(guān)核酸酶9（CRISPRassociated nuclease 9，Cas9）編輯TRAC和TRBC基因位點，實現(xiàn)了內(nèi)源性TCR的α和β鏈的基因敲除，從而增加了外源TCR的表達和功能，并在多發(fā)性骨髓瘤的臨床前模型中證實，增加外源TCR的表達可以增強TCR-T對目標抗原的識別，延長對腫瘤生長的抑制。另有研究顯示，將αβTCR導入到γδT細胞中能夠顯著減少TCR的配對錯誤[38]。而將γδTCR轉(zhuǎn)導到αβT細胞同樣不會出現(xiàn)2種TCR之間的錯配。He等[39]制作了表達TCRγ4δ1的αβT細胞，發(fā)現(xiàn)這類T細胞不表達混合的TCR二聚體，也不結(jié)合或殺傷正常細胞，并在人源肝癌腫瘤細胞HepG2裸鼠模型中顯著抑制了腫瘤生長。

5.3 通用型T細胞受體基因工程T細胞

通過敲除HLA分子，降低宿主免疫系統(tǒng)的排斥，敲除異體T細胞的內(nèi)源TCR避免對宿主組織的免疫攻擊，可以制備出通用型的T細胞用于TCR-T治療，這不僅可以提高產(chǎn)品的一致性，縮短制備時間，還能夠解決晚期患者自體T細胞質(zhì)量不足的缺點，是未來T細胞治療的重要發(fā)展方向[40]。

5.4 提高T細胞受體基因工程T細胞的腫瘤浸潤效率

在實體瘤中產(chǎn)生療效的前提是有足夠的TCR-T進入到腫瘤組織中發(fā)揮作用。而腫瘤為了逃逸免疫攻擊，其內(nèi)部環(huán)境包括血管結(jié)構(gòu)與狀態(tài)并不適合TCR-T的浸潤，如幫助效應T細胞遷移的趨化因子和黏附分子等的表達水平低，從而降低了TCR-T進入腫瘤組織的效率[41]。在CAR-T中，表達CXCR2等趨化因子受體可以改善T細胞向腫瘤組織的轉(zhuǎn)運遷移[42-43]，類似的方法也可以應用到TCR-T中。

5.5 抵抗腫瘤微環(huán)境抑制

腫瘤微環(huán)境通過多種復雜機制抑制T細胞功能。通過干預T細胞內(nèi)部的抑制信號通路，分泌因子改善腫瘤微環(huán)境等方式，能夠有效提高TCR-T的治療效果。在T細胞中直接敲除抑制性受體如程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）的基因等，可降低T細胞在腫瘤微環(huán)境中的耗竭[44]。另外，臨床前研究結(jié)果顯示，在抗PD-1抗體存在的情況下，HER2 CAR-T對腫瘤的生長抑制有顯著改善，并且該治療效果與PD-1阻斷后HER2 CAR-T功能增加相關(guān)[45]。這或可為TCR-T與免疫檢查點抑制劑的聯(lián)用提供思路和佐證，當然，療效和副作用也需要有更多的臨床前研究和臨床試驗進一步探討。

綜上所述，TCR-T治療目前處于一個早期并快速發(fā)展的階段，其已在臨床中表現(xiàn)出較好的治療效果，是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的重要發(fā)展方向之一。未來隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和瓶頸的突破，以及個體化TCR-T治療技術(shù)的建立，TCR-T治療將成為腫瘤治療的重要手段。