T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞的臨床應(yīng)用及腫瘤特異性抗原和T細(xì)胞受體的篩選策略

黃倩茹，朱一成，李揚揚，李斌

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025）

惡性腫瘤已成為許多國家70歲以下人群的第一大死亡原因。由于人口老齡化的加劇，全球癌癥負(fù)擔(dān)在20年后將增加近50%[1]。同時，由于中國巨大的人口基數(shù)，2020年全國新發(fā)癌癥人數(shù)和癌癥死亡人數(shù)均居全球第一。近數(shù)十年來，雖然早期檢測的落實和免疫治療的突破在一定程度上延長了癌癥患者的生存期，但免疫治療領(lǐng)域仍然存在著許多有待攻克的難題，如靶向藥物難以避免的耐藥性，免疫檢查點抑制劑有限的反應(yīng)率和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）療法對實體瘤效果較差等。T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）利用基因工程技術(shù)在T細(xì)胞上表達(dá)特異性識別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR），使之能特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，清除腫瘤，被認(rèn)為有機(jī)會突破實體瘤的細(xì)胞治療困境，并通過個性化設(shè)計避免耐藥、提高反應(yīng)率。

腫瘤抗原，包括腫瘤中過表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA），被主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）遞呈后可選擇性地增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)從而控制腫瘤生長。目前，TCR-T的臨床應(yīng)用?；诟咄繙y序獲得腫瘤細(xì)胞非同義突變的信息，結(jié)合預(yù)測算法識別潛在的腫瘤抗原，并對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得反應(yīng)性TCR序列，之后利用慢病毒載體在患者自體T細(xì)胞中過表達(dá)反應(yīng)性TCR序列，再將能靶向腫瘤抗原的工程化T細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w中啟動抗腫瘤免疫（見圖1）。近期的臨床研究展示了TCR-T富有希望的治療效果，但由于腫瘤抗原的個體特異性及TCR庫的豐富性，識別新的腫瘤抗原和與之配對的抗原特異性TCR極具挑戰(zhàn)性，而這將十分有助于拓展TCR-T的臨床應(yīng)用范圍。本文將綜述近年來開展臨床應(yīng)用的TCR-T類型，總結(jié)當(dāng)前的一些富有新意的篩選策略，并對TCR-T的未來發(fā)展進(jìn)行展望。

圖1 腫瘤特異性抗原反應(yīng)性T細(xì)胞免疫治療的基本步驟Figure 1 The basic steps of tumor-specific antigen-reactive T cell immunotherapy

1 T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞的臨床應(yīng)用

早在2002年，Dudley等[2]報道在體外多輪篩選腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs），得到攜帶特異性TCR的T細(xì)胞進(jìn)行回輸治療；其進(jìn)一步的臨床研究篩選了靶向人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A*02限制性的MART-126-35（MART-1: melanoma antigen recognized by T cells 1，T細(xì)胞識別黑色素瘤抗原1）和gp100209-217（gp100: glycoprotein 100，糖蛋白100）的細(xì)胞回輸治療后，35名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中18人（51%）出現(xiàn)客觀臨床治療反應(yīng)[3]。然而這種多輪富集篩選得到的腫瘤特異性淋巴細(xì)胞通常數(shù)量較少且屬于雞尾酒療法，所含細(xì)胞的背景信息了解不透徹。2006年，該研究團(tuán)隊利用基因工程改造T細(xì)胞使之具有專一靶向HLA-A*02:01限制性MART-1抗原的TCR，對17名黑色素瘤患者的回輸治療中有2人出現(xiàn)了完全的疾病消退[4]。

TCR-T作為當(dāng)前免疫治療的研究熱點，臨床研究的試驗數(shù)量逐年增加。根據(jù)美國 ClinicalTrials.gov 網(wǎng)站的數(shù)據(jù)（截至2021年3月31日），筆者總結(jié)了臨床研究中登記收錄的靶向腫瘤抗原類型（見圖2A），可主要分為三大類：腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA），TSA和 病 毒編碼的抗原（oncoviral antigen）。其中，紐約食管鱗狀細(xì)胞癌-1（New York esophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）、黑色素瘤抗原基因（the melanoma antigen gene，MAGE）家 族 和EB病 毒（Epstein Barr virus，EBV）是這三大類抗原中的熱點靶標(biāo)。從圖2B中可以看出，TCR-T在實體瘤領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，黑色素瘤、頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌和肝癌等實體瘤中已有多項臨床研究開展。由于TCR識別抗原受MHC限制性的影響，HLA-A*02:01，HLA-A*02:06，HLA-A*02:05和HLA-A*11:01是目前開展研究最多的前4種HLA類型。雖然目前的研究集中在HLA-I類分子，但針對HLA-DP*04:01這一HLA-II類分子也有3項研究在開展，表明CD4+T細(xì)胞在該領(lǐng)域也極富潛力（見圖2C）。以下將按照腫瘤抗原類型詳述近年部分具有代表意義的TCR-T臨床研究，了解改造TCR-T以增強(qiáng)其抗腫瘤效果的新策略。

圖2 近年開展的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞治療臨床試驗統(tǒng)計Figure 2 Recent clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy

1.1 靶向腫瘤相關(guān)抗原

TAA是一類在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，但在正常組織（如生殖細(xì)胞）中受限表達(dá)的抗原，其最具代表性的一類抗原家族是癌睪抗原（cancer-testis antigen，CTA），CTA在缺乏MHC-I的睪丸等生殖系統(tǒng)組織中表達(dá)，并在多種上皮來源的腫瘤中高表達(dá)，如黑色素瘤、肺癌、膀胱癌等，目前已被認(rèn)為可誘發(fā)自發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。NYESO-1是該家族中最具免疫原性的成員，目前開展的臨床研究也最為豐富。由于NY-ESO-1與L抗原1（L-antigen 1，LAGE-1）有高達(dá)94%的同源性，2015年的一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗通過慢病毒介導(dǎo)靶向NY-ESO-1/LAGE-1來源的SLLMWITQC 抗原肽（HLA-A*02:01限制性）的NY-ESOc259TCR 在CD3+T 細(xì)胞表達(dá)，回輸治療多發(fā)性骨髓瘤，結(jié)果顯示80%的病人出現(xiàn)了令人鼓舞的疾病緩解（16/20）[6]。近期，有研究在對2例晚期難治性骨髓瘤和1例轉(zhuǎn)移性肉瘤的治療中，結(jié)合成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9，CRISPR-Cas9）敲除內(nèi)源性TCR和程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1），可避免TCR錯配產(chǎn)生靶向分子不確定的TCR，使回輸?shù)襟w內(nèi)靶向NY-ESO-1的工程化T細(xì)胞存在時間延長到9個月以上，并在病人體內(nèi)觀察到腫瘤部位靶抗原的減少[7]。有研究利用HLA-A*02轉(zhuǎn)基因小鼠識別出靶向肝癌生物標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）的TCR序列，并在小鼠模型中顯示出強(qiáng)大的腫瘤清除效果，之后進(jìn)行的一系列體外實驗進(jìn)一步篩選出親和力更強(qiáng)且不存在交叉反應(yīng)的TCR序列，目前基于以上研究的臨床試驗（NCT03971747）正在上海中山醫(yī)院開展[8-9]（見表1）。

1.2 靶向腫瘤特異性抗原

腫瘤細(xì)胞基因編碼區(qū)通常存在許多突變會產(chǎn)生變異蛋白，若變異的蛋白可被MHC遞呈激活免疫細(xì)胞殺傷功能，這一被遞呈的肽段便是富有治療潛能的TSA。由于這類抗原在正常組織中不表達(dá)，其特異性T細(xì)胞可以逃避胸腺中的陰性選擇因而儲備豐富，但此類抗原常存在極高的個體特異性。目前的研究主要集中在靶向致癌基因和腫瘤抑制基因突變，即所謂的“熱點”突變。如靶向KRASG12D和KRASG12V突變抗原的TCR逐漸被挖掘并改造以提升親和力[10-11]，在對6例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周記憶T細(xì)胞進(jìn)行高度敏感的體外刺激和細(xì)胞富集后，科研人員在3例患者中鑒定出靶向突變KRASG12D和KRASG12V變異的CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞；在另外2例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，則檢測到針對突變SMAD5和MUC4蛋白的CD8+腫瘤抗原特異性細(xì)胞[12]。在針對1例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的治療中，回輸4種不同的靶向HLA-C*08:02限制性KRASG12D抗原的T細(xì)胞觀察到了肺轉(zhuǎn)移病灶的腫瘤消退，然而在9個月后1個轉(zhuǎn)移病灶中的HLA-C*08:02分子表達(dá)缺失促使了腫瘤免疫逃逸[13]。據(jù)美國ClinicalTrials.gov網(wǎng)站登記顯示，上海長海醫(yī)院自2019年開啟了一項針對攜帶KRASG12V晚期胰腺癌患者的HLA-A*11:01限制性的TCR-T回輸治療臨床試驗（NCT04146298，見表1）。

除了單核苷酸變異外，近年發(fā)現(xiàn)移碼突變、剪接變異、基因融合和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄基因也會產(chǎn)生值得靶向的腫瘤特異性抗原[14]。一些個性化的多靶點治療也在開展，在一項關(guān)于化療難治性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的研究中，利用測序確定腫瘤中的突變蛋白，聯(lián)合使用針對由SLC3A2，KIAA0368，CADPS2和CTSB這4種蛋白的非同義突變形成的新表位的TILs和白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）治療，并進(jìn)行短暫的免疫檢查點治療，實現(xiàn)了超過22個月的腫瘤完全消退。由于不是每個突變表位都能被MCH遞呈并激活T細(xì)胞反應(yīng)，所以如何確定腫瘤抗原和配對的TCR是一大難點，后文將對目前已有的策略展開探討。

1.3 靶向病毒編碼的抗原

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計約13%的癌癥發(fā)生與感染相關(guān)，其中中國占發(fā)生數(shù)的1/3[15]。一些病毒可長期潛伏在細(xì)胞中，甚至將自身遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因中從而誘發(fā)細(xì)胞癌變，同時也會使病毒特異性的蛋白在腫瘤細(xì)胞中組成性表達(dá)。這類蛋白表達(dá)特異，通常免疫原性強(qiáng)，可作為理想的TCR-T靶向抗原，科研人員正在開展相關(guān)臨床研究。例如，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）相關(guān)惡性腫瘤，包括子宮頸、口咽、肛門、外陰、陰道和陰莖部位的腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移后通常對標(biāo)準(zhǔn)治療耐藥，難以治愈。HPV陽性的腫瘤細(xì)胞組成性表達(dá)促癌的HPV E7抗原，該抗原在胞內(nèi)表達(dá)從而難以使用抗體或CAR-T進(jìn)行靶向，實驗人員通過HLA-A*02:01-E711-19四聚體篩選出1個能限制小鼠HPV-16相關(guān)腫瘤生長的高親和力TCR[16]。近期開展的一項臨床研究，使用靶向HPV-16 E7的TCR-T治療轉(zhuǎn)移性HPV相關(guān)的上皮癌，結(jié)果12例患者中有6例出現(xiàn)了腫瘤消退[17]。同時，使用靶向HPV-16 E6的TCR的自體基因工程T細(xì)胞的Ⅰ/Ⅱ期單中心臨床試驗也已開展，結(jié)果顯示12例接受治療的患者大部分都出現(xiàn)了不同程度的腫瘤消退[18]。EBV則與多種淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌的發(fā)展有關(guān)，靶向EBV編碼蛋白LMP2和BMLF1等的研究也在開展中，研究人員使用肽段-MHC四聚體篩選出首個功能性的HLA-A*01:01限制性的EBV-LMP2特異性的TCR，拓展了這一領(lǐng)域的應(yīng)用范圍[19]，而一類針對HLA-A*11:01限制性的EBV-LMP2特異性的TCR已被證明可在小鼠中抑制人鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的生長[20]。據(jù)美國ClinicalTrials.gov網(wǎng)站登記顯示，目前國內(nèi)有3家醫(yī)院正在開展針對復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者或頭頸部腫瘤患者的靶向EBV編碼抗原的TCR-T治療的臨床試驗（見表1）。

表1 國內(nèi)正在開展的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞治療臨床試驗統(tǒng)計△Table 1 Ongoing clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy in China

2 腫瘤抗原和腫瘤抗原特異性T細(xì)胞受體的 篩選策略

雖然目前開展了一系列的TCR-T臨床治療研究，但其靶向的抗原類型和針對的癌癥類型仍有很大局限性，所以篩選富有治療潛力的腫瘤抗原是當(dāng)前的研究熱點之一。隨著癌癥突變、HLA基因型和免疫治療反應(yīng)相關(guān)臨床數(shù)據(jù)集的擴(kuò)增，以及生物信息算法提升和合成生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的努力付諸于識別腫瘤特異性抗原及其配對的TCR（見圖3）。

圖3 針對腫瘤抗原和腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞受體的篩選策略Figure 3 Screening strategies for tumor antigens and tumor-reactive T cell receptors

2.1 針對潛在腫瘤抗原的機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測

識別和選擇病人特異的潛在腫瘤抗原是開展治療的關(guān)鍵。目前的流程大致是：比較腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)（DNA或RNA序列）鑒定出非同義變異；之后使用機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測非同義突變中潛在的腫瘤抗原，這樣有助于降低篩選成本并提高篩選效率。預(yù)測模型的搭建依賴于對肽-MHC結(jié)構(gòu)建模進(jìn)行分子動力學(xué)模擬或利用已知的MHC結(jié)合序列分析氨基酸偏好序列[21]。當(dāng)前使用的大部分模型聚焦于預(yù)測肽-MHC（特別是MHC-I）的結(jié)合親和力，如NetMHCpan 4.0利用質(zhì)譜洗脫數(shù)據(jù)和親和力數(shù)據(jù)訓(xùn)練出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，可預(yù)測親和力和MHC特異性肽長度的結(jié)合偏好[22]。由于腫瘤抗原預(yù)測的重要性，也存在專門運用腫瘤病人數(shù)據(jù)聚焦于腫瘤抗原預(yù)測的算法，如EDGE是利用涉及8種腫瘤類型的74名患者的質(zhì)譜和測序數(shù)據(jù)深度學(xué)習(xí)后構(gòu)建的，在抗PD-1治療后轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的樣本中均能使用EDGE預(yù)測到至少1個T細(xì)胞反應(yīng)性肽段[23]。雖然與MHC的高親和力是肽呈現(xiàn)的最重要的選擇要求，但抗原遞呈的過程還包括蛋白質(zhì)合成、蛋白酶體降解、HLA結(jié)合和轉(zhuǎn)運等，其中許多細(xì)節(jié)的研究尚不清楚。MHCflurry 2.0利用目前積累的質(zhì)譜識別的MHC-I配體數(shù)據(jù)，綜合MHC等位基因依賴效應(yīng)和非等位基因依賴效應(yīng)，訓(xùn)練了2個模型并通過邏輯回歸將二者整合得到遞呈分?jǐn)?shù)，雖然與先前的模型相比，MHCflurry2.0的陽性預(yù)測值（positive predictive value）增加40%以上[24]；但難以模擬抗原遞呈的全過程，常會輸出相對較高的假陽性結(jié)果，且預(yù)測得分與真實的抗原遞呈間會存在顯著偏差。此外，與CD4+T細(xì)胞相關(guān)的MHC-II結(jié)合表位也逐漸受到關(guān)注，專門用于預(yù)測MHC-II抗原表位的MARIA[25]和NetMHCIIpan4.0[22]陸續(xù)被開發(fā)。但由于MHC-II的肽結(jié)合溝相對較淺且兩側(cè)是開放的，所以其結(jié)合肽的長度變化較大（9 ～ 22殘基），因而針對MHC-II的肽結(jié)合預(yù)測更為困難。盡管如此，相信隨著MHC-抗原肽數(shù)據(jù)的積累、抗原遞呈復(fù)合物結(jié)構(gòu)的識別和算法的優(yōu)化，HLA結(jié)合抗原預(yù)測的準(zhǔn)確性有望得到提升。

TCR識別抗原的預(yù)測主要基于保守基序進(jìn)行判斷，逐漸出現(xiàn)一些基于深度學(xué)習(xí)的模型如ERGO[26]。同一TCR可以識別不同肽段，而不同的TCR也可以識別相同肽段，基于后者利用聚類來尋找識別共享抗原的TCR也取得了一些進(jìn)展，如基于深度學(xué)習(xí)構(gòu)建的DeepTCR可以分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)，揭示TCR抗原性的決定序列[27]。近期，GLIPH2幫助在178例非小細(xì)胞肺癌患者中實現(xiàn)了對435個腫瘤富集的抗原表位特異的TCR分組，并結(jié)合酵母展示系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了“S%DGMNTE CDR3β”基序，該基序可識別上皮蛋白TMEM161A產(chǎn)生的病毒和非突變抗原交叉表位[28]。研究表明TCR庫中可能存在1011～ 1012個獨特的TCR，這是強(qiáng)大的腫瘤殺傷武器庫，但這也增大了篩選腫瘤抗原反應(yīng)的TCR的挑戰(zhàn)性[29]。在未來，TCR特異性的表位預(yù)測將是腫瘤抗原表位預(yù)測的主要方向。

2.2 針對腫瘤抗原的篩選策略

將TILs與抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）共培養(yǎng)是檢測抗原反應(yīng)原性最直接的手段。在早期，抗原遞呈是通過將潛在抗原的完整蛋白質(zhì)編碼基因?qū)氡磉_(dá)特定HLA亞型的APC來完成的[30]，該方法可模擬天然的抗原遞呈過程，但對于大規(guī)模篩選則顯得笨拙且耗時。之后，潛在抗原肽以串聯(lián)迷你基因（tandem minigene，TMG）或長肽的方式被導(dǎo)入細(xì)胞，可讓1個細(xì)胞同時遞呈多種候選抗原分子從而極大提升了篩選效率[31]。TMG攜帶多個迷你基因，每個迷你基因存在1個突變核苷酸，可編碼1個新的抗原表位；長肽則是多個潛在抗原肽的串聯(lián)，每個抗原肽中存在1個突變氨基酸。這2種方式目前已成功應(yīng)用于胃腸道癌癥、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和上皮性癌癥的臨床試驗[32-33]。

然而，上述2種方式還存在許多不足之處，首先是跳過了抗原肽的天然加工過程，其次TMG中迷你基因可能受限于翻譯后的三維結(jié)構(gòu)，難以實現(xiàn)均等的蛋白表達(dá)水平，而長肽引發(fā)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)較弱，需經(jīng)過多輪篩選才能確定反應(yīng)性腫瘤抗原。2019年報道的T-scan系統(tǒng)將一個被顆粒酶B（granzyme B，GzB）酶切位點影響完整性的紅外熒光蛋白轉(zhuǎn)到APC中作為報告分子，共培養(yǎng)時，反應(yīng)性T細(xì)胞會分泌GzB到APC中釋放熒光信號，可通過流式細(xì)胞術(shù)分選出被識別的APC并測序確定抗原序列[34]。另一團(tuán)隊則利用被稱為胞啃的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象作為信號，T細(xì)胞會將被N-氨基喹啉-生物素標(biāo)記的膜蛋白轉(zhuǎn)移到遞呈配對抗原的APC上，之后可以通過流式細(xì)胞術(shù)分選出被識別的APC并測序確定抗原序列[35]。此外，還有系統(tǒng)在APC中構(gòu)建信號和抗原遞呈雙功能受體（signaling and antigen-presenting bifunctional receptors，SABRs），該受體胞外段為MHC-抗原肽可遞呈抗原，在與反應(yīng)性TCR作用后，其胞內(nèi)段可產(chǎn)生1個TCR樣信號誘導(dǎo)NFAT啟動子調(diào)控的熒光蛋白表達(dá)用于篩選[36]。類似的方法也在MHC-II的篩選中得以實現(xiàn)，研究人員將小鼠MHCII與TCRαβ的胞內(nèi)段相融合得到pMHC(peptide and major histocompatibility complex)-TCR(MCR)，并用此篩選出gp61的潛在抗原和反應(yīng)性TCR序列[37]。

2.3 針對腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞受體的篩選策略

針對新抗原特異性TCR的篩選中，peptide-MHC四聚體（pMHC tetramers）最為廣泛應(yīng)用，四聚體上偶聯(lián)的熒光素使得與之結(jié)合的T細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選，目前這項技術(shù)已在多發(fā)性骨髓瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中得以應(yīng)用[38-39]。研究人員進(jìn)一步開發(fā)同位素標(biāo)記四聚體，使用質(zhì)譜流式實現(xiàn)對單個人類樣本中多達(dá)109種pMHC特異性和20 ～ 30種額外的表面和胞內(nèi)標(biāo)記物的同時鑒定[40]。四聚體能同時識別多種抗原特異性T細(xì)胞，但其合成較復(fù)雜且MHC的型別有限，一些研究團(tuán)隊嘗試?yán)米贤廨椪帐顾木垠w中HLA上的配體斷裂以轉(zhuǎn)載新的配體，以期實現(xiàn)四聚體的重復(fù)利用[41]；同時，DNA條形碼、多分子熒光被用來標(biāo)記四聚體以增加一次篩選的抗原種類[42-43]。納米磁性顆粒也被用于標(biāo)記四聚體，以期能更敏感地從病人腫瘤或血液中分離罕見的腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞[42]。此外，基于MHC的酵母展示系統(tǒng)也已被開發(fā)用來擴(kuò)展抗原表位的識別數(shù)目[44]；類似地，有研究將pMHC復(fù)合物融合到桿狀病毒蛋白gp64的跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而錨定在昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞膜上進(jìn)行展示[45]，但這2個展示系統(tǒng)只能用于篩選可溶性的TCR。以上篩選策略的主要缺陷是不能確定T細(xì)胞是被抗原激活還是僅僅與抗原結(jié)合。

基于群體水平上檢測細(xì)胞因子（如γ-干擾素）分泌和細(xì)胞毒性活性被廣泛用于分析T細(xì)胞是否被激活，但它們更適合檢測T細(xì)胞對腫瘤抗原的群體反應(yīng)程度，缺乏單細(xì)胞維度的敏感性。細(xì)胞表面標(biāo)記物能幫助識別激活的T細(xì)胞，目前4-1BB被認(rèn)為是極具潛力的標(biāo)記物，但結(jié)合使用2或3種表面標(biāo)記物可能更能可靠地識別T細(xì)胞的激活[46]。一些專門設(shè)計的感受器也被用于檢測TCR激活后下游信號通路的改變，如使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針檢測蛋白質(zhì)酪氨酸激酶ZAP-70活性的變化、鈣離子探針檢測胞內(nèi)鈣離子的改變和將NFAT-啟動子調(diào)控的熒光信號與組蛋白H2B結(jié)合檢測T細(xì)胞活化[47-49]。但這些篩選信號不僅僅受TCR信號的調(diào)控，篩選特異性值得商榷。近期，F(xiàn)ucoID利用化學(xué)酶法使APC表面錨定上巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)APC與配對的TCR相互作用時可以將底物GDP-Fuc-Biotin上的生物素轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞上，實現(xiàn)對配對T細(xì)胞的標(biāo)記[50]。此外，基于微流控的篩選系統(tǒng)也被建立，科研人員在攜帶NFAT/AP-1調(diào)控的eGFP的Jurkat 細(xì)胞中表達(dá)候選TCR，利用微流控系統(tǒng)將單個TCR-T與靶細(xì)胞包裹起來形成小區(qū)室，當(dāng)TCR-T與表達(dá)配對抗原的靶細(xì)胞相互作用時可以通過顯微鏡觀察熒光變化[51]。這些基于不同原理的策略為篩選腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞提供了富有創(chuàng)造性的新思路。

3 總結(jié)與展望

TCR-T治療因其具有良好的特異性、顯著的抗腫瘤活性和相對較輕的副作用而受到越來越多的關(guān)注，在早期的多項臨床試驗中已證明了回輸抗原特異性TCR-T能帶來顯著的臨床療效，但其發(fā)展還處于起始階段，仍有許多問題亟待解決。本文對近年TCR-T治療的臨床試驗進(jìn)行了綜述，并對當(dāng)前蓬勃發(fā)展的腫瘤抗原和配對TCR的篩選策略進(jìn)行總結(jié)，但文中只初步觸及TCR-T治療的臨床準(zhǔn)備工作。目前的臨床應(yīng)用也反映出對于TCR-T毒性的臨床前評估還缺乏有力的工具和策略，如MAGE家族是目前研究熱點的靶向抗原，但在一項針對MAGE-A3的TCR-T臨床試驗中，9例患者中有2例在輸注后因出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)副作用而死亡，深入分析揭示該TCR同時靶向MAGE-A12，而后者在腦中存在表達(dá)，這是在之前未被認(rèn)知的[52]。同時TCR-T在體內(nèi)治療的過程中如何克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境及脫靶毒性的影響也是未來發(fā)展的難點。

T細(xì)胞抗原的識別與B細(xì)胞相比更為困難，發(fā)展較為緩慢，主要面臨以下幾個難點：1）抗原以短肽的形式與MHC非共價連接；2）TCR與抗原的親和力相對較低；3）難以判斷抗原結(jié)合是否激活T細(xì)胞信號[34]。早先識別腫瘤特異性抗原的方法依賴于珍稀的臨床標(biāo)本，直接對龐大的多肽庫進(jìn)行篩選，限制了腫瘤特異性抗原的發(fā)現(xiàn)。但令人欣喜的是，許多跨學(xué)科的篩選策略逐漸得到發(fā)展，涉及計算機(jī)算法設(shè)計、合成生物學(xué)及工程系統(tǒng)也被成功搭建，雖然目前還缺乏在臨床水平的試驗驗證，但相信在未來這些篩選策略將有助于拓展TCR-T的應(yīng)用范圍。當(dāng)前，腫瘤抗原的鑒定主要依靠基因組規(guī)模的方法，如全外顯子組測序。而多元組學(xué)和深度學(xué)習(xí)的發(fā)展將助力更多潛在的腫瘤抗原的發(fā)掘，目前也看到了更多關(guān)于全球合作的倡議，如腫瘤新抗原選擇聯(lián)盟（Tumor Neoantigen Selection Alliance，TESLA）比較不同團(tuán)隊對新抗原的預(yù)測方法，發(fā)現(xiàn)單個預(yù)測管道的預(yù)測性能普遍欠佳，總結(jié)提出強(qiáng)結(jié)合親和力、高腫瘤豐度、高結(jié)合穩(wěn)定性和肽識別是與肽免疫原性相關(guān)的關(guān)鍵遞呈相關(guān)參數(shù)，這些關(guān)鍵參數(shù)將有助于改善腫瘤抗原的預(yù)測準(zhǔn)確性[53]。同時，還需要考慮下游臨床應(yīng)用對預(yù)測腫瘤抗原的假陰性和假陽性的耐受性，及無關(guān)的新抗原表位是否會干擾真正的腫瘤抗原靶點從而對臨床療效產(chǎn)生負(fù)面影響[54]。

在未來，腫瘤抗原反應(yīng)性TCR的發(fā)展有著廣闊的空間以待挖掘。腫瘤抗原的概念可以擴(kuò)展到錯誤折疊的蛋白質(zhì)、核酸、外泌體等形式，這為篩選提供了豐富的靶標(biāo)。同時，近年來也有研究將TCR與CAR-T療法相結(jié)合，將識別pMHC的TCR可變域（TCRv）與嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CARs）的胞內(nèi)域相連，使CAR-T的靶向抗原不僅局限于細(xì)胞表面蛋白，也使得TCR的靶向功能可以被用于其他免疫細(xì)胞[55]。因此，盡管TCR-T治療的發(fā)展道路上還存在著許多障礙，但TCR-T療法有望在未來成為治療癌癥的有力武器。