靶向腫瘤驅(qū)動(dòng)抗原的T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞治療策略

羅凌杰，湯宇翔，張周朝陽(yáng)，梁文華，譚潤(rùn)琳，錢威瑾，王鋒

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025）

近年來，以程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）等免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）免疫療法為代表的腫瘤免疫療法已在臨床上取得了重要進(jìn)展[1-2]。免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體療法以T細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)PD-1/程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associate protein 4，CTLA-4）為靶點(diǎn)，誘導(dǎo)T細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答[3]。免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體療法常伴隨有自身免疫性疾病的發(fā)生，成為臨床治療中的一個(gè)難點(diǎn)，而以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的T細(xì)胞治療可使這一副作用發(fā)生率大大降低。在CAR-T療法中，通過基因工程技術(shù)，將1個(gè)T細(xì)胞激活域[通常包括分化簇-3（cluster of differentiation-3，CD3）復(fù)合物的ζ鏈]和細(xì)胞外免疫球蛋白衍生的重鏈和輕鏈組合形成嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），并通過將其移植于T細(xì)胞使T細(xì)胞獲得不受主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）限制的抗原識(shí)別能力，并通過這一識(shí)別，活化T細(xì)胞，從而發(fā)揮其抗腫瘤的功能。但由于第1代CAR-T活化能力受限，無法長(zhǎng)時(shí)間發(fā)生T細(xì)胞反應(yīng)，所以在第1代CAR-T的基礎(chǔ)上，通過添加共刺激分子胞內(nèi)域及細(xì)胞因子信號(hào)域，發(fā)展出了擁有1個(gè)共刺激分子的第2代CAR-T、擁有2個(gè)甚至更多共刺激分子的第3代CAR-T及具有細(xì)胞因子或趨化因子受體的第4代CAR-T，大大增強(qiáng)了T細(xì)胞的活化和存活[4]。CAR-T識(shí)別抗原不受MHC的限制，并只能識(shí)別細(xì)胞表面抗原，且需要多個(gè)靶點(diǎn)的識(shí)別才能發(fā)揮其抗腫瘤功能，這可能是細(xì)胞因子釋放綜合征這一較為嚴(yán)重的副作用的由來。目前，CAR-T療法在血液腫瘤的治療中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)體瘤的治療中效果尚不明確。同時(shí)，免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體療法在實(shí)體瘤中的有效率也亟需進(jìn)一步提升。而T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）免疫療法識(shí)別的是多肽-MHC復(fù)合體，可精確定位并殺傷呈遞這些多肽的細(xì)胞，且可靶向所有被MHC呈遞的抗原，而不限于細(xì)胞表面抗原，尤其是胞內(nèi)抗原，如腫瘤突變抗原和來源于致癌病毒的抗原。此外，由于TCR-T可識(shí)別多肽-MHC復(fù)合體，相較于CAR-T療法，在回輸入患者體內(nèi)時(shí)，不會(huì)被循環(huán)中的抗原阻斷，大大提高了TCR-T實(shí)體腫瘤歸巢的可能。這些特點(diǎn)均可提升TCR-T的抗實(shí)體腫瘤功能。本文重點(diǎn)介紹以腫瘤驅(qū)動(dòng)突變、T細(xì)胞受體與抗腫瘤免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的TCR-T研究進(jìn)展，同時(shí)介紹驅(qū)動(dòng)突變抗原-TCR驗(yàn)證篩選系統(tǒng)，為更深入的實(shí)體瘤TCR-T臨床治療研究提供新思路。

1 腫瘤驅(qū)動(dòng)突變生物學(xué)特征

腫瘤細(xì)胞基因組中存在多種突變，只有少數(shù)能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的突變被定義為驅(qū)動(dòng)突變，這些驅(qū)動(dòng)突變是腫瘤細(xì)胞的特征性標(biāo)志之一，確定腫瘤細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)突變是腫瘤治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)突變可發(fā)生在原癌基因及抑癌基因中。在原癌基因中發(fā)生的驅(qū)動(dòng)突變進(jìn)一步增強(qiáng)了原癌基因的功能，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖，而驅(qū)動(dòng)突變?cè)谝职┗蛑薪獬似鋵?duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在原癌基因BRAF中最常發(fā)生的V600E突變是包括甲狀腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤發(fā)生的重要誘因[5]。錯(cuò)義突變導(dǎo)致的抑癌基因TP53功能失活也是誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的主要因素[6]。此外，對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的研究證實(shí)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的早期，其信號(hào)失活的突變誘導(dǎo)了早期腫瘤的發(fā)生，而在腫瘤發(fā)生的后期，增強(qiáng)TGF-β信號(hào)的突變驅(qū)動(dòng)了腫瘤的進(jìn)展[7-8]。因此，特定的突變可能只在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的某些階段起驅(qū)動(dòng)作用，而同一基因向不同方向的突變均可能驅(qū)動(dòng)了腫瘤的形成。

通過對(duì)癌癥相關(guān)突變基因的研究發(fā)現(xiàn)，約有90%的癌基因突變發(fā)生于體細(xì)胞中，此外有20%的癌基因突變發(fā)生于生殖細(xì)胞中，而10%的癌基因突變可同時(shí)在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中發(fā)生[9]。這些存在于生殖細(xì)胞中的癌基因突變表明，驅(qū)動(dòng)突變可遺傳給子代，生殖細(xì)胞發(fā)育來的機(jī)體在生命早期攜帶有驅(qū)動(dòng)突變，但絕大部分腫瘤并沒有發(fā)生在生命早期，即在細(xì)胞癌變前數(shù)十年這些細(xì)胞既已攜帶有驅(qū)動(dòng)突變，但并沒有發(fā)生癌變。對(duì)多種癌組織樣本的基因組數(shù)據(jù)研究表明，大多數(shù)樣本攜帶不止1個(gè)突變，其中有一些突變?cè)诓煌陌┙M織樣本中高頻出現(xiàn)，且在其所研究的30種腫瘤中有25種腫瘤存在與年齡因素相關(guān)的標(biāo)志性基因突變[10]。因此，腫瘤細(xì)胞可能并不是由單一驅(qū)動(dòng)突變誘導(dǎo)，需要多種驅(qū)動(dòng)突變同時(shí)存在以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而這些驅(qū)動(dòng)突變隨時(shí)間的推移在細(xì)胞內(nèi)逐漸累積，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。通過對(duì)腫瘤全基因組和腫瘤基因組圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分腫瘤發(fā)展需要平均4 ～ 5個(gè)驅(qū)動(dòng)突變，但在約5%的病例中未檢測(cè)到已知的驅(qū)動(dòng)突變，這意味著可能還有更多潛在的驅(qū)動(dòng)突變有待發(fā)現(xiàn)；在肢端黑色素瘤中，染色體突變性斷裂重組先于大多數(shù)體細(xì)胞點(diǎn)突變，并同時(shí)影響多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，這表明腫瘤的形成很可能是多個(gè)驅(qū)動(dòng)突變協(xié)同作用的結(jié)果，單一的驅(qū)動(dòng)突變可能不足以誘導(dǎo)腫瘤生成，通過對(duì)腫瘤細(xì)胞基因組更為深入的探索，可能發(fā)現(xiàn)不同驅(qū)動(dòng)突變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展中的協(xié)同特性[11]。

2 T細(xì)胞受體腫瘤新抗原的識(shí)別對(duì)抗腫瘤免疫的作用

在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，具有特異性識(shí)別腫瘤抗原的能力。T祖細(xì)胞（pro-T）從胚肝或骨髓中遷出，并在胸腺微環(huán)境中通過T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識(shí)別抗原信號(hào)進(jìn)行胸腺選擇，發(fā)育為成熟T細(xì)胞后隨血液循環(huán)最終定居于外周淋巴系統(tǒng)或組織器官中。經(jīng)過胸腺選擇后，TCR即獲得了對(duì)MHC分子呈遞的外源或突變抗原識(shí)別的能力，又可以排除對(duì)自身抗原的識(shí)別，從而獲得免疫耐受能力。由此形成的每一T細(xì)胞克隆均攜帶有獨(dú)特的TCR序列，可特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原多肽，數(shù)量眾多的T細(xì)胞表達(dá)不同的TCR，從而形成具有豐富多樣性的TCR組庫(kù)。TCR組庫(kù)的多樣性是其抗原特異免疫應(yīng)答的分子基礎(chǔ)，決定了T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)。

2.1 T細(xì)胞與T細(xì)胞受體信號(hào)

TCR是由多個(gè)跨膜蛋白組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體，其包含了由TCRα與TCRβ鏈或TCRγ與TCRδ鏈組成的二聚體以及由4種CD3蛋白組成的3個(gè)二聚體(分別為CD3εδ，CD3εγ和CD3ζζ)。外周血中具有TCRα鏈及TCRβ鏈組成的T細(xì)胞（后文簡(jiǎn)稱：TCRαβ二聚體或αβ T細(xì)胞）占總T細(xì)胞的90%以上，而具有TCRγ鏈及TCRδ鏈TCR組成的T細(xì)胞（后文簡(jiǎn)稱：TCRγδ二聚體或γδ T細(xì)胞）僅占不到10%[12]。與γδ T細(xì)胞不同的是，αβ T細(xì)胞與抗原的識(shí)別受MHC的限制，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。αβ T細(xì)胞的TCR二聚體主要以胞外區(qū)為主，負(fù)責(zé)識(shí)別其他細(xì)胞表面的肽段-主要組織相容性復(fù)合體（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）。因此，TCRαβ-CD3復(fù)合體可通過TCR胞外區(qū)與抗原-MHC結(jié)合，又可通過CD3二聚體將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。

TCRα鏈 和TCRγ鏈由多個(gè)不同的可變區(qū)（variable region，V）、鉸鏈區(qū)（joining region，J）和恒定區(qū)（constant region，C）片段組成，TCRβ鏈和TCRδ鏈則由不同的V區(qū)、多變區(qū)（diversity region，D）、J區(qū)和C區(qū)片段組成，且每個(gè)片段中都有多個(gè)不同的基因片段，這些不同的基因片段在重排的過程中隨機(jī)組合，這是TCR多樣性產(chǎn)生的主要機(jī)制。TCR與抗原的選擇性結(jié)合有賴于TCR高特異性的V區(qū)，V區(qū)有3個(gè)超變區(qū)，亦稱為互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region，CDR），其中CDR3的變異決定了TCR的抗原特異性，結(jié)合TCR的V（D）J基因的重排，使得個(gè)體產(chǎn)生龐大的TCR組庫(kù)。在TCRαβ二聚體對(duì)抗原-MHC復(fù)合體的識(shí)別中，CDR1和CDR2識(shí)別MHC分子抗原結(jié)合槽中由α螺旋組成的側(cè)壁，CDR3則直接識(shí)別MHC所呈遞的抗原。

當(dāng)細(xì)胞外的TCRαβ-CD3復(fù)合物結(jié)合到能與之相互匹配的pMHC，通過胞內(nèi)的CD3復(fù)合物形成抗原特異性信號(hào)即第一信號(hào)傳入，在蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）的作用下，TCR自身的酪氨酸磷酸化，由此激活下游信號(hào)通路。激活的抗原信號(hào)再整合共刺激／共抑制受體產(chǎn)生的第二信號(hào)以及細(xì)胞因子信號(hào)，決定T淋巴細(xì)胞的抗原特異性免疫反應(yīng)或免疫耐受[13]。

2.2 T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答

在T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答中，CD4+T細(xì)胞通過CD40L與樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的表面蛋白CD40相結(jié)合，誘導(dǎo)DC產(chǎn)生如白介素-12（interleukin-12，IL-12）和白介素-15（interleukin-15，IL-15）的細(xì)胞因子，作用于細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)其殺細(xì)胞功能，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。T細(xì)胞抗腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是靶向抗原肽，抗原肽則是由癌細(xì)胞上MHC分子進(jìn)行呈遞。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞由突變誘導(dǎo)生成許多抗原肽，在其釋放后被DC捕獲；DC對(duì)這些捕獲的抗原進(jìn)行加工處理，并經(jīng)MHC分子將抗原呈遞給T細(xì)胞，通過這些腫瘤來源的抗原活化T細(xì)胞；其中活化后形成的效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞經(jīng)循環(huán)進(jìn)入腫瘤組織，通過對(duì)MHC-I類分子呈遞的同源抗原的識(shí)別，殺傷表達(dá)這些同源抗原的腫瘤細(xì)胞；被殺傷的腫瘤細(xì)胞釋放更多的腫瘤抗原，以增強(qiáng)這一T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)[14]。

針對(duì)多肽與不同的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）亞型結(jié)合效率及結(jié)合位點(diǎn)的差異，TCR對(duì)抗原多肽的識(shí)別可產(chǎn)生不同的應(yīng)答效果。只有當(dāng)HLA亞型有效結(jié)合多肽，且被相匹配的TCR識(shí)別后，T淋巴細(xì)胞才能被激活，從而開啟對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。有研究顯示，當(dāng)多肽-MHC與TCR的親和力較低時(shí)，PD-1表達(dá)減少，分泌γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）以及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的CD8+T細(xì) 胞 增 加，從而影響CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷功能[15]；另外，MHC與TCR的持續(xù)結(jié)合使得CD8+T細(xì)胞的共刺激以及共抑制受體在經(jīng)歷短暫的初始上調(diào)后，其表達(dá)水平便開始下降，從而影響了CD8+T的潛在功能[16]，這表明MHC的功能不僅僅只是向T細(xì)胞呈遞抗原，其與TCR的結(jié)合更參與了對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。然而，腫瘤細(xì)胞可通過多種機(jī)制改變多肽-MHC復(fù)合體的表達(dá)，以規(guī)避MHC與T細(xì)胞的結(jié)合，逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷?？乖嚯脑谀[瘤細(xì)胞內(nèi)通過抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體，進(jìn)而被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，MHC-I類分子可選擇性結(jié)合不同序列的多肽，形成多肽-MHC復(fù)合體。在腫瘤組織中抗原加工和呈遞機(jī)制相關(guān)基因和蛋白異常較為常見，可導(dǎo)致一些腫瘤相關(guān)抗原不能被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)并被MHC-I類分子結(jié)合，這大大減少了腫瘤抗原-MHC復(fù)合體在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)[17]。此外，對(duì)乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的研究表明，腫瘤細(xì)胞可下調(diào)甚至完全喪失MHC-I類分子的表達(dá)，使其逃避了腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的識(shí)別和殺傷[17-18]。

3 T細(xì)胞靶向腫瘤突變抗原

基于二代測(cè)序技術(shù)的全外顯子測(cè)序和大panel測(cè)序可獲知腫瘤樣本中每百萬(wàn)編碼DNA中體細(xì)胞基因突變的總數(shù)，即腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB），它包括同義突變和非同義突變[19]。較高的TMB值提示腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較多腫瘤抗原的可能及更多的能被T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原。通過對(duì)來源于不同腫瘤類型的多個(gè)腫瘤組織樣本的分析發(fā)現(xiàn)，在突變頻率最為顯著的黑色素瘤中，每百萬(wàn)編碼DNA中有超過10個(gè)非同義突變，等同于腫瘤細(xì)胞基因編碼區(qū)內(nèi)有150個(gè)非同義突變[20]。MC38腫瘤模型的研究表明，只有10%的非同義突變產(chǎn)生的多肽可與MHC-I類分子高親和力結(jié)合，而這10%中也只有很少的一部分能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[21]。目前，所檢測(cè)的絕大部分腫瘤的TMB小于10[20]。因此，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的腫瘤抗原極少。

在早期T細(xì)胞抗腫瘤研究中，對(duì)于目標(biāo)抗原的選擇集中在一些腫瘤中高頻出現(xiàn)的腫瘤抗原中。在難治性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療中，通過對(duì)靶向SLC3A2，KIAA0368，CADPS2和CTSB的 突變蛋白腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，這些T細(xì)胞可以對(duì)突變產(chǎn)生反應(yīng)并有效殺傷腫瘤，且大部分情況下這些T細(xì)胞可以在外周血中持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間[22]。

4 T細(xì)胞靶向致癌病毒抗原

愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、高危的人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）亞型、默克爾細(xì)胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCPyV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi,s sarcomaassociated herpesvirus，KSHV）及人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型（human T-lymphotropic virus type-1，HTLV-1）的感染是部分腫瘤患者的主要致病因素，這些病毒被認(rèn)為是致癌病毒。其中，HPV癌基因蛋白E6和E7特異性地表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞[23]；其通過p53和pRb的降解，E6和E7與p53和pRb結(jié)合的減弱及端粒酶活性的上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的癌變，從而導(dǎo)致HPV相關(guān)惡性腫 瘤 的 發(fā) 生[24-27]。EBV核 抗 原1（Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1）及潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）1和LMP2被 認(rèn) 為 是導(dǎo)致B細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵致癌因素[28]。MCPyV陽(yáng)性的默克爾細(xì)胞癌中，腫瘤細(xì)胞常表達(dá)大T抗原突變體[29-30]。研究表明，MCPyV大T抗原的這一突變體和MCPyV的小T抗原蛋白均顯示了強(qiáng)大的致癌能力[31-32]；它們是MCPyV陽(yáng)性的默克爾細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞存活的必要前提，大T抗原突變體和小T抗原的敲除可誘導(dǎo)MCPyV陽(yáng)性的默克爾腫瘤細(xì)胞的死亡[33-34]。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中，鑒于HBV和HCV感染導(dǎo)致的肝臟慢性炎癥，其編碼的蛋白可能不是通過直接誘導(dǎo)而是間接調(diào)控的方式介導(dǎo)了腫瘤的發(fā)生[35]。這些證據(jù)表明，致癌病毒抗原是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要因素，同時(shí)這些抗原只存在于腫瘤組織中，不存在于正常細(xì)胞，并且由于病毒基因組編碼蛋白序列與人類蛋白序列相似度極低，受淋巴細(xì)胞的中樞耐受影響較小，因此致癌病毒抗原具有很強(qiáng)的免疫抗原性，是TCR-T療法的理想靶點(diǎn)。

5 T細(xì)胞靶向腫瘤驅(qū)動(dòng)突變抗原

驅(qū)動(dòng)突變是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的決定性突變，在腫瘤細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)突變誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生帶有特異性突變的氨基酸序列，這些突變所致抗原通常是腫瘤所特有的，只表達(dá)于腫瘤組織，因此這些氨基酸序列構(gòu)成的多肽對(duì)于免疫系統(tǒng)是完全陌生的，且不在胸腺表達(dá)，不會(huì)在胸腺T細(xì)胞陰性選擇過程中被清除。這保證了免疫系統(tǒng)對(duì)其具有應(yīng)答能力，且不會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞在中樞免疫過程中對(duì)其產(chǎn)生耐受，因此可以產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，由于驅(qū)動(dòng)突變抗原的腫瘤限制性表達(dá)，由其引起的免疫應(yīng)答作用于腫瘤組織，不影響正常的自身組織，可大大降低由其引起自身免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)性[36]。

在黑色素瘤的過繼T細(xì)胞治療中，腫瘤細(xì)胞通過減少抗原表達(dá)或等位基因突變，導(dǎo)致原T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤抗原在細(xì)胞中選擇性地丟失，表明T細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中對(duì)腫瘤抗原的產(chǎn)生和編輯施加了選擇壓力[37]。這一選擇壓力在腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步變異中干預(yù)了腫瘤抗原的突變，使其逃避了T細(xì)胞的殺傷。在TCR腫瘤抗原識(shí)別中，以乘客突變（passenger mutation）所致腫瘤抗原為靶標(biāo)時(shí)，隨著其突變的持續(xù)發(fā)生可造成T細(xì)胞識(shí)別的脫靶。鑒于驅(qū)動(dòng)突變是成為腫瘤的決定性因素，因此以驅(qū)動(dòng)突變抗原為靶標(biāo)時(shí)，TCR識(shí)別脫靶的概率遠(yuǎn)低于乘客突變，這也使得驅(qū)動(dòng)突變成為較為穩(wěn)定的T細(xì)胞識(shí)別靶標(biāo)，有效降低了腫瘤治療中免疫逃逸的概率。

腫瘤細(xì)胞突變所產(chǎn)生的多肽在胞內(nèi)被蛋白酶體處理后可與MHC結(jié)合，這些突變所產(chǎn)生的多肽均可呈遞給T細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中，乘客突變等非決定性的突變所產(chǎn)生的多肽占腫瘤細(xì)胞表面MHC呈遞抗原的絕大多數(shù)，雖然驅(qū)動(dòng)突變多肽占比較少，但一旦其與MHC結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面，即可被T細(xì)胞識(shí)別，這是由TCR的特異性決定的。通過對(duì)P53的驅(qū)動(dòng)突變來源表位的研究發(fā)現(xiàn)，特異性識(shí)別該表位的TCR足以介導(dǎo)對(duì)表達(dá)該驅(qū)動(dòng)突變抗原的腫瘤細(xì)胞的殺傷[38]。而在攜帶有KRASG12D突變的結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的患者中，通過從肺轉(zhuǎn)移灶中分離出針對(duì)KRASG12D突變的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增回輸入患者體內(nèi)后，可引起10個(gè)肺轉(zhuǎn)移灶中的9個(gè)病灶的消退[39]。這些都表明，P53和KRAS的驅(qū)動(dòng)突變產(chǎn)生的腫瘤抗原可作為腫瘤治療的有效作用靶點(diǎn)。

6 驅(qū)動(dòng)突變抗原特異性T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞的腫瘤臨床研究進(jìn)展

目前，基于T細(xì)胞的免疫療法已成功用于臨床治療人類實(shí)體瘤，TCR-T療法正處于蓬勃發(fā)展中[40-45]。2006年，Science報(bào)道了一項(xiàng)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)編碼T細(xì)胞識(shí)別黑色素瘤抗原1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）的特異性TCR，使來自外周血的自體T細(xì)胞獲得了識(shí)別腫瘤的能力，進(jìn)而讓轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病變成功消退的臨床研究[46]。然而，少數(shù)靶向腫瘤相關(guān)抗原的TCR-T治療可引發(fā)嚴(yán)重甚至致死性的并發(fā)癥，如結(jié)直腸癌TCR-T靶向癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）的臨床治療研究中并發(fā)了嚴(yán)重的炎性腸病而終止了研究[47]。靶向MART-1，糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）和黑色素瘤相關(guān)抗原A3（melanomaassociated antigen-A3，MAGE-A3）的黑色素瘤TCR-T治療引起了正常組織的嚴(yán)重破壞[48]和嚴(yán)重的神經(jīng)毒性反應(yīng)致受試者死亡[49]，以及心源性休克死亡的發(fā)生[50]。TCR-T療法需要腫瘤特異性更強(qiáng)的抗原靶標(biāo)，而針對(duì)驅(qū)動(dòng)突變的TCR-T療法由于驅(qū)動(dòng)突變抗原的腫瘤專一表達(dá)，其可以有效降低腫瘤免疫治療過程中的脫靶及細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性的發(fā)生[51]。KRAS驅(qū)動(dòng)突變是腫瘤的常見誘因，25%的非小細(xì)胞肺癌患者中發(fā)現(xiàn)存在KRAS第12和第13號(hào)密碼子上的基因突變，而這些突變?cè)诮Y(jié)直腸癌患者中的發(fā)生率可達(dá)39%，在胰腺癌患者中的發(fā)生率更是高達(dá)95%[52]。Tran等[39]的發(fā)現(xiàn)表明KRAS驅(qū)動(dòng)突變腫瘤新抗原可以在臨床上有效誘導(dǎo)出T細(xì)胞免疫應(yīng)答；而通過從腫瘤患者體內(nèi)分離出的HLA亞型有效結(jié)合的腫瘤致癌突變抗原特異性T細(xì)胞，已篩選出多個(gè)識(shí)別KRAS驅(qū)動(dòng)突變蛋白的特異性TCR序列。表1為截至2021年5月4日“https://clinicaltrials.gov”網(wǎng)站上已申報(bào)的關(guān)于驅(qū)動(dòng)突變抗原及致癌病毒抗原腫瘤TCR-T療法臨床試驗(yàn)項(xiàng)目匯總，可見以特異性TCR為基礎(chǔ)針對(duì)相應(yīng)的腫瘤抗原開發(fā)TCR-T療法在臨床前和臨床研究中顯示出巨大的潛力。

表1 驅(qū)動(dòng)突變抗原及致癌病毒抗原腫瘤T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)項(xiàng)目列表 Table 1 List of clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy for driver mutation and oncogenic viral antigen related tumor

7 驅(qū)動(dòng)突變抗原-T細(xì)胞受體篩選體系

7.1 基于活化T細(xì)胞核因子-綠色熒光蛋白報(bào)告基因的抗原-T細(xì)胞受體篩選系統(tǒng)

利用J76細(xì)胞系無內(nèi)源TCR表達(dá)的特征，將候選功能性腫瘤抗原TCR重組并過表達(dá)于活化T細(xì)胞核因子-綠色熒光蛋白（nuclear factor of activated T cells-green fluorescent protein，NFATGFP）J76細(xì)胞可以構(gòu)建抗原-TCR篩選系統(tǒng)（見圖1A）。將上述報(bào)告細(xì)胞系與腫瘤抗原和DC共孵育，候選TCR若與對(duì)應(yīng)抗原相互識(shí)別，則激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT使其開始轉(zhuǎn)錄，其后的GFP表達(dá)并產(chǎn)生熒光信號(hào)，可通過流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)[53-54]。由此，利用該系統(tǒng)，通過給予DC和不同腫瘤抗原孵育，可以從TCR組庫(kù)中的候選TCR出發(fā)，在體外高效篩選可活化相應(yīng)TCR克隆的腫瘤抗原。此方法相較于體內(nèi)篩選更為簡(jiǎn)便，用時(shí)較少，結(jié)果更為顯著。此功能報(bào)告基因系統(tǒng)也是其他高通量篩選方法的后續(xù)常用驗(yàn)證環(huán)節(jié)。

7.2 基于液滴微流控技術(shù)的功能性T細(xì)胞篩選系統(tǒng)

傳統(tǒng)的單細(xì)胞分析方法依賴于與單細(xì)胞聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和高通量測(cè)序結(jié)合的流式細(xì)胞熒光分選（fluorescence activating cell sorter，F(xiàn)ACS）技術(shù)，通常無法與實(shí)時(shí)的單細(xì)胞功能監(jiān)測(cè)相提并論，并且受限于取樣的細(xì)胞數(shù)而降低獲得的T細(xì)胞的多樣性。微流體領(lǐng)域的飛速發(fā)展為單細(xì)胞生物學(xué)的高通量研究提供了新的工具。其中，液滴微流控技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞分離入極小體積的油滴，對(duì)單個(gè)細(xì)胞水平上細(xì)胞間的相互作用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并對(duì)其TCR序列進(jìn)行下游識(shí)別，從而對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行功能篩選（見圖1B）。這一液滴微流控平臺(tái)包括針對(duì)每個(gè)單獨(dú)克隆TCR的跟蹤系統(tǒng)以及用于回收目標(biāo)克隆以進(jìn)行下游分析的分類程序。以識(shí)別NY-ESO-1抗原的T細(xì)胞為例，將T細(xì)胞與表達(dá)復(fù)雜HLA/NYESO-1抗原肽的靶細(xì)胞一起封裝為單個(gè)液滴，非特異性T細(xì)胞（MART-1 T細(xì)胞）不識(shí)別表達(dá)NY-ESO-1抗原的靶細(xì)胞，而特異性T細(xì)胞（NY-ESO-1 T細(xì)胞）在識(shí)別其相關(guān)抗原后被激活，從而觸發(fā)增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）的表達(dá)，經(jīng)過液滴捕獲、孵育和成像，觀察eGFP的表達(dá)強(qiáng)弱，從而實(shí)現(xiàn)特異性T細(xì)胞的功能篩選[55]。該技術(shù)只需很少的細(xì)胞輸入且整個(gè)樣品被封裝，從而大大減少了操作中的細(xì)胞損失，適用于珍貴且細(xì)胞數(shù)目有限的樣品。此外，極小的液滴體積可有效提高靈敏度，從而減少分析時(shí)間；同時(shí)，其可對(duì)液滴中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)和多功能篩選。

7.3 基于信號(hào)傳導(dǎo)和抗原呈遞雙功能受體文庫(kù)的抗原-T細(xì)胞受體篩選系統(tǒng)

T細(xì)胞識(shí)別靶抗原后被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)表達(dá)了可被檢測(cè)到的基因，然而由于MHC分子缺乏信號(hào)結(jié)構(gòu)域，對(duì)相應(yīng)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）所提呈抗原的檢測(cè)有一定挑戰(zhàn)性。相關(guān)研究表明，采用信號(hào)傳導(dǎo)和抗原呈遞雙功能受體（signaling and antigen-presenting bifunctional receptor，SABR）文庫(kù)，可以高效識(shí)別與給定TCR相互作用的APC所呈遞的抗原表位，對(duì)TCR靶向抗原的發(fā)現(xiàn)十分有效[56]（見圖1C）。SABR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是共價(jià)連接的抗原肽-β2微球蛋白-MHC三聚體，參與提呈抗原，其與細(xì)胞內(nèi)CD3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD28共刺激結(jié)構(gòu)域融合，可在遞呈靶向抗原與TCR結(jié)合時(shí)向APC轉(zhuǎn)導(dǎo)類似TCR的下游信號(hào)。在APC中導(dǎo)入NFAT-GFP報(bào)告基因即可獲得具有抗原呈遞報(bào)告功能的細(xì)胞系?；赟ABR文庫(kù)進(jìn)行TCR-抗原篩選時(shí)，首先需生成由免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)的所有已知HLA-A*0201限制性表位組成的目標(biāo)表位列表，以編碼抗原表位-SABR文庫(kù)（A2-SABR文庫(kù)），通過表位的蛋白質(zhì)序列合成SABR文庫(kù)的全部寡核苷酸；然后用免連接法將文庫(kù)擴(kuò)增并克隆至SABR載體質(zhì)粒，通過慢病毒將后者轉(zhuǎn)導(dǎo)至具有NFAT-GFP報(bào)告基因的JURKAT細(xì)胞的APC中，使其表達(dá)SABR。將此APC與具有可識(shí)別特定抗原TCR的JURKAT細(xì)胞共孵育，再利用流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽(yáng)性的NFAT-GFP-JURKAT APC，并對(duì)所分選細(xì)胞的SABR抗原表位部分進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，與A2-SABR文庫(kù)比對(duì)篩選獲得確切抗原表位序列信息，由此成功進(jìn)行特定TCR靶向抗原的高通量篩選。

7.4 基于T-Scan報(bào)告基因的高通量抗原-T細(xì)胞受體篩選系統(tǒng)

T-Scan采用基于細(xì)胞的聯(lián)合篩選方法來高通量鑒定TCR有效識(shí)別的抗原（見圖1D）。在T-Scan系統(tǒng)中，候選抗原文庫(kù)通過慢病毒在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，靶細(xì)胞加工后荷載到MHC分子上，在細(xì)胞表面通過MHC分子呈遞出來。將這些帶有抗原庫(kù)的靶細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)，TCR與抗原相互識(shí)別后，CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性顆粒至帶有相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞。顆粒酶B（granzyme B，GzB）是一種存在于細(xì)胞毒性顆粒中的絲氨酸蛋白酶。靶細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞成功識(shí)別后，分泌的GzB通過剪切連接紅外熒光蛋白（infrared fluorescent protein，IFP）2個(gè)結(jié)構(gòu)域間的GzB特異性剪切序列，激活靶細(xì)胞中的IFP，從而可以通過FACS分離出這些靶細(xì)胞。最后，使用PCR和二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)來鑒定這些靶細(xì)胞表達(dá)的抗原[57]。T-Scan不直接測(cè)量反應(yīng)性T細(xì)胞，而是基于GzB檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)候選抗原庫(kù)的聚焦作用，其允許從候選抗原庫(kù)中富集具有高靈敏性和特異性的稀有同源靶細(xì)胞。T-Scan可以從蛋白質(zhì)組中識(shí)別病毒和自身反應(yīng)性TCR的已知肽表位，并繼續(xù)利用該方法生成高分辨率的TCR特異性圖譜，識(shí)別多個(gè)孤立TCR的對(duì)應(yīng)表位。這種方法能夠在高通量篩選中獲得高度復(fù)雜的候選抗原組。

圖1 抗原-T細(xì)胞受體篩選系統(tǒng)組圖Figure 1 Charts of antigen-T cell receptor screening system

7.5 基于細(xì)胞接觸和表面修飾的抗原-T細(xì)胞受體篩選系統(tǒng)

以細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用為基礎(chǔ)，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行巖藻糖基-生物素化標(biāo)記的抗原-TCR篩選系統(tǒng)可以檢測(cè)并從旁觀者T細(xì)胞中分離出針對(duì)腫瘤特異性抗原的反應(yīng)性T細(xì)胞（見圖1E）。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)T）是一種能快速定量地將與其天然供體底物鳥苷二磷酸巖藻糖（guanosine diphosphate-fucose，GDP-Fuc）結(jié)合的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到含有N-乙酰-D-乳糖胺（N-acetyl-D-lactosamine，LacNAc）的DC或T細(xì)胞表面的糖基轉(zhuǎn)移酶。DC對(duì)腫瘤裂解物進(jìn)行識(shí)別、加工和提呈表達(dá)腫瘤特異性抗原-MHC復(fù)合體；將人工合成的共軛化合物GDP-Fuc-FT與DC 共孵育，F(xiàn)T可作為自催化劑轉(zhuǎn)移至DC表面；再將此DC與GDP-Fuc-生物素和T細(xì)胞共孵育，T細(xì)胞識(shí)別DC表面的腫瘤特異性抗原-MHC復(fù)合體，其特異性TCR與DC形成細(xì)胞-細(xì)胞間接觸，DC表面的FT催化GDP-Fuc-生物素向T細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移并形成LacNAc-Fuc-生物素標(biāo)記，通過親和素?zé)晒鈽?biāo)記這一生物素化的T細(xì)胞后，可通過熒光顯微成像或流式檢測(cè)特異性識(shí)別腫瘤特異性抗原的T細(xì)胞[58]。此法不依賴遺傳操作，較為簡(jiǎn)便，成本低，周期短，適用于原代細(xì)胞，通常適用于可檢測(cè)到T細(xì)胞浸潤(rùn)的小鼠腫瘤模型。而在人的DC表面導(dǎo)入FT也容易完成，可用于檢測(cè)和分離患者的腫瘤特異性抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，在臨床中有很高的應(yīng)用潛力，有望推動(dòng)個(gè)性化癌癥治療的進(jìn)一步發(fā)展。

8 展望及總結(jié)

在TCR-T治療中，腫瘤特異性抗原及相對(duì)應(yīng)的特異性TCR是腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素，更是免疫應(yīng)答效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。絕大多數(shù)的TCR-T療法的靶標(biāo)抗原特異性程度不足，使得治療相關(guān)的副反應(yīng)嚴(yán)重阻礙了這一療法的發(fā)展。在早期T細(xì)胞靶向腫瘤突變抗原的研究中，所檢測(cè)到的絕大部分腫瘤的突變負(fù)荷值較低，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的腫瘤抗原極少；而致癌病毒抗原具有很強(qiáng)的免疫抗原性，是TCR-T治療的理想靶點(diǎn)；驅(qū)動(dòng)突變抗原是腫瘤細(xì)胞所特有的，并決定了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的腫瘤特異性抗原，這一特性使得腫瘤驅(qū)動(dòng)突變抗原自然而然成為TCR-T治療的最優(yōu)靶標(biāo)，而這些驅(qū)動(dòng)突變抗原及相應(yīng)的TCR還有待進(jìn)一步發(fā)掘，如通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘驅(qū)動(dòng)突變基因，運(yùn)用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)腫瘤驅(qū)動(dòng)突變抗原，通過腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞的單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組和TCR聯(lián)合測(cè)序獲得潛在的功能性TCR信息，并通過TCR-pMHC晶體結(jié)構(gòu)的解析等手段對(duì)驅(qū)動(dòng)突變抗原和功能性TCR進(jìn)行優(yōu)化，還可以應(yīng)用基于NFAT-GFP報(bào)告基因的抗原-TCR篩選系統(tǒng)、基于液滴微流控技術(shù)的功能性T細(xì)胞篩選系統(tǒng)等，這將極大推進(jìn)實(shí)體瘤TCR-T治療的發(fā)展。目前，TCR-T療法正處于蓬勃發(fā)展之中，在臨床前和臨床研究中均展示出巨大的潛力。經(jīng)過十幾年的研究，其對(duì)于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療已被廣泛采納并進(jìn)行了相關(guān)臨床試驗(yàn)，而更多的針對(duì)實(shí)體瘤的TCR-T療法也在積極的開展中。