T細胞受體工程化T細胞療法的臨床研究及動物腫瘤模型的應用

王琨，汪金姣，王皞鵬

（上?？萍即髮W生命科學與技術學院，上海201210）

過繼性細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）在癌癥治療方面具有巨大的應用價值，它通過基因修飾技術對天然T細胞進行改造，使它們能夠特異性識別腫瘤以獲得腫瘤殺傷能力[1]。ACT主要包括腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）療法、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）療法、T細胞受體工程化T細胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）療法和嵌合抗原 受 體T細 胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）療法等。目前，CAR-T和TCR-T療法應用最廣。

CAR-T療法已被證實可用于復發(fā)或難治性B細胞淋巴瘤如急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療[2-4]。目前，美國FDA總共批準了5款CAR-T治療產品，為腫瘤患者帶來了新的希望。盡管CAR-T療法在血液瘤的治療中顯示出卓越的療效，但對于實體瘤的治療效果卻不盡如人意。CAR-T療法通過識別膜表面抗原而發(fā)揮作用，而近90%的惡性實體腫瘤缺乏膜表面特異性抗原，TCR-T療法則能夠識別細胞內來源的腫瘤特異性抗原。這也意味著，TCR-T療法擁有更多的腫瘤潛在靶點選擇，能更好地減少免疫逃逸，最終更有效地實現(xiàn)腫瘤細胞的特異性免疫應答，達到精準治療的目的。因此，目前TCR-T療法是最有可能在實體瘤治療中取得突破的T細胞免疫療法。本文將聚焦于現(xiàn)有TCR-T療法相關的非臨床研究動物模型以及TCR-T療法臨床發(fā)展現(xiàn)狀，并進一步探討了動物模型在克服TCR-T療法當前限制性因素中的相關應用，為提高其臨床治療效果提供高效且廣譜的解決方案。

1 T細胞受體工程化T細胞療法簡述

TCR-T療法是一種通過工程化改造T細胞，從而實現(xiàn)對腫瘤患者進行治療的過繼性免疫療法。TCR-T療法通過直接賦予T細胞特異性識別結合腫瘤抗原的TCR，使得原本無腫瘤識別能力的T細胞能夠有效地識別并殺傷腫瘤細胞，治療的基本步驟為：首先，從患者的外周血中分離純化出T細胞；繼而利用基因工程技術，將識別腫瘤特異抗原的TCR基因序列導入患者自身T細胞中，獲得特異識別腫瘤抗原的TCR-T；之后，將TCR-T通過體外培養(yǎng)進行大量擴增；最后，擴增得到的TCR-T被回輸?shù)交颊唧w內對腫瘤細胞進行殺傷，從而達到治療腫瘤的目的。細胞內在的抗原遞呈機制使TCR-T可針對細胞胞內抗原（占全部抗原的90%）而不局限在細胞表面抗原（僅占10%）。因此，TCR-T可以靶向大部分的腫瘤特異性或相關性抗原，這使其對腫瘤的識別范圍比抗體類藥物以及依靠抗體識別腫瘤的CAR-T的應用范圍更廣。TCR-T依賴天然的TCR發(fā)揮作用，意味著其抗原親和力以及信號強度都要弱于CAR-T，這使得TCR-T的持久性和浸潤性要優(yōu)于CAR-T，從而在實體瘤的治療中優(yōu)于CAR-T療法。

TCR-T療法的出現(xiàn)要早于CAR-T療法。20世紀90年代，來自美國國家癌癥研究所（NCI）和華盛頓大學的研究人員最早提出了T細胞的治療用途，首次從人外周血中分離出抗原特異性T細胞，并過繼性回輸給腫瘤或病毒感染的患者體內，取得了一定的臨床治療效果[5]。多項臨床試驗表明，體外擴增的TILs可用于治療人類癌癥，如惡性黑色素瘤[6-7]或卵巢癌[8]。NCI研究人員對TILs靶向腫瘤的治療潛力進行了驗證，結果顯示該方法在72%的轉移性黑色素瘤患者中產生了客觀反應[9]。然而，TILs對其他惡性腫瘤的治療成功率非常有限，主要原因是大多數(shù)癌癥患者體內很難被分離出腫瘤特異性T細胞，另外獲得足夠數(shù)量T細胞需要相當長的時間。正是這些原因推動了TCR-T技術的發(fā)展，使得產生抗原特異性T細胞成為可能。此后，TCR-T療法在轉移性黑色素瘤、結直腸癌、滑膜肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者中均顯示出良好的臨床效果，表明TCR-T療法在實體瘤的治療中具有很好的應用前景[10-14]。

2 T細胞受體工程化T細胞療法非臨床研究 動物模型

為了驗證和優(yōu)化TCR-T療法在臨床應用中的安全性和有效性，研究人員需要建立非臨床研究的動物模型，并對治療效果進行驗證和評估。在利用TCR-T療法進行治療的過程中，存在的安全性問題或不良反應主要包括：靶標毒性（on-target toxicity），指TCR-T攻擊腫瘤細胞的同時也攻擊表達TCR-T靶向抗原的正常細胞，使得健康組織受損；脫靶毒性（off-target toxicity），指TCR-T無法區(qū)分腫瘤細胞表面特異性抗原和正常細胞抗原，損傷了表達與靶點相似抗原表位的健康組織；細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），指工程化的T細胞完成輸注后，使得T細胞被激活并快速增殖，引起細胞因子的過度級聯(lián)釋放，是一種嚴重的過度免疫應答。建立合適的臨床前治療模型，可以加快TCR-T療法的開發(fā)和應用，最大程度避免臨床試驗中可能出現(xiàn)的安全問題。目前，在TCR-T療法的研究中主要使用2種嚙齒類動物模型：一是同基因型小鼠模型，使用小鼠T細胞和小鼠抗原，具有保留著完整免疫系統(tǒng)的優(yōu)點；二是異種移植瘤小鼠模型，使用免疫缺陷型小鼠和人源T細胞及人源腫瘤細胞，具有能夠研究人源細胞的優(yōu)點[15-16]。此外，在CAR-T療法的研究中，靈長類動物模型也被用于評估該療法的有效性和安全性。例如，在分別以ROR1，L1CAM以及CD20等腫瘤抗原為靶點的CAR-T臨床前研究中，均使用了靈長類動物作為模型，它們?yōu)檫@些CAR-T產品的安全性提供了有價值的信息[17-19]。相比小鼠模型，靈長類動物的免疫系統(tǒng)與人類更相似，其模型更接近患者體內的情況。靈長類動物模型在CAR-T療法中的應用對于TCR-T臨床前治療模型的構建具有很大的參考價值，相信未來會有更多種類的動物模型在TCR-T療法臨床前研究中得到應用。

隨著TCR-T療法的不斷發(fā)展，已有多種用于研究的小鼠腫瘤模型被成功構建，包括表達T細胞識別的黑色素瘤抗原1（melanoma-associated antigen recognized by T cells 1，MART-1）的 黑 色素瘤模型[20-21]、表達紐約食管鱗狀細胞癌1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NYESO-1）抗原的小鼠腫瘤模型[22]、表達糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）抗原的小鼠腫瘤模型[23]、表達癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的結腸癌小鼠模型[24]、表達p53抗原的骨肉瘤小鼠模型[25]、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相關的小鼠腫瘤模型[26]、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）相關的頭頸部鱗狀細胞癌小鼠模型[27]、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關的肝癌小鼠模型[28]等。研究人員在構建MART-1，NY-ESO-1，p53等腫瘤模型時，一般先將3×106～ 5×106個腫瘤細胞通過皮下注射的方式種植在免疫缺陷型小鼠皮下，而gp100，CEA，EBV，HPV，HBV等模型的腫瘤細胞種植數(shù)目相對較少，一般在5×105～ 10×105個細胞左右。模型構建的下一步需要根據腫瘤生長狀況選擇合適的時間點，將工程化改造后的腫瘤特異性TCR-T通過尾靜脈注射的方式轉移至小鼠模型體內。MART-1，NY-ESO-1，EBV等模型一般會在移植腫瘤細胞3 ～ 5周后輸入TCR-T，而gp100，CEA，p53，HPV，HBV等模型會在移植腫瘤細胞1 ～ 2周后靜脈注入TCR-T。此外，不同的腫瘤模型需要輸入的TCR-T數(shù)目也會存在差異。MART-1，NY-ESO-1，gp100，HBV等腫瘤模型一般在輸入1×106～ 3×106個TCR-T后，便會達到良好的腫瘤殺傷效果，而CEA，p53，EBV，HPV等模型一般需要靜脈注入5×106～ 10×106個TCR-T才能達到理想的體內抗腫瘤功效。在構建腫瘤模型以及體內試驗的整個過程中，需要對腫瘤的生長狀況進行定期監(jiān)測，最常用的2種監(jiān)測方式是活體成像和游標卡尺測量腫瘤。目前，業(yè)內尚未建立起動物模型和臨床治療之間的TCR-T回輸劑量關系。臨床上在對患者進行TCR-T治療時，回輸細胞數(shù)目主要依據患者的體質量來確定，相較于CAR-T，TCR-T回輸?shù)臄?shù)量要高100 ～ 1 000倍，大多集中在109～ 1010個細胞之間。此外，TCR-T療法的回輸劑量標準尚未建立，并且因細胞回輸劑量過大而引起細胞毒性現(xiàn)象的研究少見。與CAR-T療法相比，TCR-T療法引起CRS的程度更低，但若是過量的T細胞回輸后導致T細胞激活并快速增殖必然會引起細胞因子過度級聯(lián)釋放。因此，未來可以參考CAR-T療法的劑量爬坡試驗評估TCR-T療法的臨床安全性和有效性。

構建小鼠模型開展臨床前相關研究是實現(xiàn)基礎研究轉化至臨床應用的重要橋梁。臨床數(shù)據顯示，在接受CEA特異性TCR-T治療的患者中觀察到的細胞毒性與在CEA小鼠模型中觀察到的毒性高度相似，TCR-T除了發(fā)揮抗腫瘤功能外，還破壞了正常的結腸組織，類似于自身免疫性結腸炎[29]。在Pmel-1TCR轉基因小鼠模型中，使用gp100特異性TCR-T治療后，引起了小鼠的眼部損傷，這與接受gp100特異性TCR-T治療的黑色素瘤患者中出現(xiàn)的狀況基本相似[30]。以上結果表明，在進行TCR-T療法臨床試驗前，小鼠腫瘤模型構建的必要性。動物模型的構建能夠評估TCR-T療法的治療潛力，預測TCR-T療法的細胞毒性，為臨床試驗的安全有效進行提供保障。

3 T細胞受體工程化T細胞療法臨床研究現(xiàn)狀

2006年，Morgan等[10]首次報道了針對黑色素瘤患者的TCR-T療法。研究人員使用RNA電穿孔的方法給患者的外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）轉 導 了4種編 碼TCR的RNA，它們分別能夠識別MART-1:27-35，gp100:209-217，NY-ESO-1:157-165和p53:264-272肽/人類白細胞抗原A2（human leukocyte antigen A2，HLA-A2）復合物；依據實體瘤反應評估標準（RECIST）評估后，發(fā)現(xiàn)經過治療的17例黑色素瘤患者對TCR-T療法產生了不同程度響應，其中2例表現(xiàn)出轉移性黑色素瘤的持續(xù)客觀消退，1例在接受治療后出現(xiàn)了腋下腫塊的完全消退，肝臟腫塊也減少了89%，治療后第21個月，該患者仍未表現(xiàn)出疾病進展；另1例患者的肺門腫塊出現(xiàn)消退，治療后第20個月仍無疾病進展。Johnson等[11]使用高親和力的MART-1（AAGIGILTV）特異性TCR治療20例轉移性黑色素瘤患者，其中6例（30%）出現(xiàn)了客觀的癌癥消退，肺部、腦部、肝部和皮膚的腫瘤明顯縮小。

Robbins等[13]報道的靶向滑膜細胞肉瘤和黑色素瘤抗原NY-ESO-1的TCR-T療法的臨床試驗結果顯示，4例（67%）滑膜細胞肉瘤患者和11例（45%）黑色素瘤患者均出現(xiàn)了客觀臨床反應，其中有2例黑色素瘤患者表現(xiàn)出完全消退，1例滑膜細胞肉瘤患者表現(xiàn)出持續(xù)18個月的部分反應。2015年，Robbins等[14]報道了一項使用親和力增強的TCR識別NY-ESO-1（SLLMWITQC）的臨床試驗結果：將TCR通過逆轉錄病毒轉導入了18例滑膜細胞肉瘤患者和20例黑色素瘤患者的PBMC中，18例NY-ESO-1陽性滑膜細胞肉瘤患者中的11例（61%）和20例NY-ESO-1陽性黑色素瘤的患者中的11例（55%）表現(xiàn)出了客觀的臨床反應。

Parkhurst等[31]報道了針對結腸癌患者的TCR-T療法臨床試驗結果，該項試驗使用了靶向結腸癌高表達抗原CEA（一種糖基化蛋白，在多種胃腸道癌細胞中高表達）的TCR（IMIGVLVGV），臨床結果顯示，對其他療法無效的3例轉移性結直腸癌患者接受了TCR-T療法后，均檢測到CEA水平的顯著降低，且1例患者肺和肝轉移性腫瘤客觀消退。Kageyama等[32]報道了靶向黑色素瘤抗原家族A4（melanoma antigen family A4，MAGE-A4）（NYKRCFPVI）的TCR-T療法在10例對于常規(guī)治療手段如放療和化療等響應較差或不響應的食管癌復發(fā)患者中的臨床試驗結果，這些患者在接受治療后短期內腫瘤縮小，3例病情最輕微的患者在未接受其他治療的情況下，1年后疾病不再進展。Nagarsheth等[33]報道了靶向HPV的TCR-T療法臨床試驗結果：與HPV相關的惡性腫瘤是典型的上皮癌，包括宮頸癌、口咽癌、肛門癌、外陰癌、陰道癌和陰莖癌均表達HPV E7抗原，有助于惡性轉化和癌細胞存活，HPV E7抗原可作為工程T細胞的治療靶點；12例轉移性HPV-16陽性癌癥患者中8例曾接受程序化細胞死亡蛋白1（PD-1）免疫治療、1例曾接受LN-145細胞治療，效果均不理想，接受靶向TCR的HPV-16 E7工程改造的T細胞（E7 TCR-T）治療后，6例出現(xiàn)了明顯的腫瘤消退。

綜上所述，在這些TCR-T療法的臨床試驗中，針對同種腫瘤的不同試驗的臨床客觀性也會出現(xiàn)差異，這與針對同一抗原的不同TCR的選擇和TCR-T制備工藝之間的差異有關。表1顯示了目前已完成的關于TCR-T療法的臨床試驗結果。

表1 已完成的T細胞受體工程化T細胞療法臨床試驗結果Table 1 Results of conducted clinical trials of T cell receptor-engineered T cells therapy

4 動物模型在克服T細胞受體工程化T細胞 療法挑戰(zhàn)中的應用

盡管已有部分腫瘤患者從TCR-T療法中獲益[34]，但作為一種新的腫瘤治療方式，TCR-T療法仍然具有一定的局限性。其限制性因素主要包括：靶向抗原的選擇、腫瘤特異性TCR的開發(fā)、T細胞的體內持久性和TCR-T療法的臨床安全性等。為了更加安全有效地對腫瘤患者進行治療，可以通過以下策略在非臨床研究的動物模型中預測改善后的TCR-T療法的抗腫瘤功效和臨床安全性。

4.1 選擇T細胞受體工程化T細胞靶向抗原

在TCR-T治療過程中，第一步是選擇最合適的腫瘤抗原作為TCR靶標。目前，主要存在3種類型的腫瘤抗原：存在于健康組織但在癌細胞中高表達的腫瘤相關抗原（tumor-associated antigens，TAAs）；在癌細胞、睪丸、胎兒卵巢和滋養(yǎng)層細胞中表達的癌睪丸抗原[35]（cancer testis antigens，CTAs）；僅在癌細胞中表達的腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigens，TSAs）如新抗原（neoantigen）和致癌病毒產生的抗原，但在健康組織中不表達。

目前，已有部分理想的腫瘤抗原短肽被發(fā)現(xiàn)，以用于TCR-T技術的開發(fā)。在這些抗原肽中，NYESO-1多次被證實是安全有效的腫瘤抗原之一，靶向該種抗原的TCR-T臨床試驗占30%以上。人乳頭瘤病毒HPV-16中的E6和E7蛋白是腫瘤特異性抗原，與宮頸癌的發(fā)生密切相關，針對這2種抗原的TCR-T臨床試驗在這幾年也迅速增加。此外，許多TAAs，CTAs或TSAs可用于TCR-T治療，例如MART-1，威爾姆斯瘤基因1（Wilms' tumor gene 1，WT-1），乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），MAGE（A3，A4，A6，A10），黑色素瘤優(yōu)先表達抗原（preferentially expressed antigen in melanoma，PRAME），巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV），EBV，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，gag），gp100，紅血球凝聚素1（hemagglutinin-1，HA1），人內源性逆轉錄病毒E（human endogenous retroviruses-E，HERV-E），大型多功能肽酶2（large multifunctional peptidase 2，LMP2），CEA，p53等[1]，靶向這些抗原的臨床試驗也正在進行（見圖1）。腫瘤新抗原由點突變、染色體易位和其他類型的致癌基因改變產生，這些抗原在除了腫瘤細胞外任何其他健康組織中均不存在，可作為TCR-T的靶點，而無脫靶毒性[36]?；蚪M測序、質譜分析技術和數(shù)據分析技術的進步促進了個體癌癥特有的特異性新抗原的鑒定，使得自體TCR-T能夠對具有臨床活性的新抗原產生反應[37-39]。盡管有許多新抗原是通過經典突變產生的，但其他一些由翻譯后修飾（例如磷酸化或甲基化）產生的新抗原也可以被TCR-T靶向[40-41]。

圖1 T細胞受體工程化T細胞療法的臨床試驗靶向抗原分布Figure 1 Distribution of targeted antigens of TCR-T clinical therapy

為了確保TCR-T療法的安全性和有效性，原則上應該選擇僅在癌細胞中表達的腫瘤特異性抗原作為理想靶標。篩選出的腫瘤抗原短肽在進入臨床應用前需要在動物模型中驗證其腫瘤特異性，證實這些抗原短肽是否僅在腫瘤細胞中表達，最大程度地減小TCR-T療法在臨床治療中潛在的脫靶毒性。

4.2 腫瘤特異性T細胞受體的開發(fā)與優(yōu)化

找到合適的腫瘤特異性抗原只解決了問題的一半，因為要篩選出靶向抗原的最適TCR也存在一定的挑戰(zhàn)性。分離出腫瘤反應性T細胞需要選擇合適的細胞來源，并且理想的T細胞要具有合適親和力的TCR和顯著的TCR表達頻率與純度，這些先決條件是成功開發(fā)出腫瘤特異性TCR的基礎。獲得腫瘤特異性T細胞后，在TCR測序中面臨的最大挑戰(zhàn)是每個T細胞腫瘤特異性TCR的α和β鏈的正確配對。高通量測序技術的引入可以使研究人員分析樣品中數(shù)百萬個TCR分子的多樣性，通過這種方法可以獲得所有TCR序列以構成樣本庫[42-44]。目前，獲得特異性TCR最快的方法是將單細胞TCR測序與帶有特定人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子和選定腫瘤表位的條形碼樣多聚體結合起來，從而顯著加快從人類樣品中分離TCR的速度，避免任何富集步驟，并直接能夠進行TCR序列的功能驗證[45]。

TCR的親和力被證實與TCR-T功能直接相關[46-48]。高親和力的TCR已被用于大多數(shù)臨床試驗，因為它們能夠以較低的表達水平識別腫瘤細胞，但是高親和力的TCR可能會導致自身免疫性疾病。一些研究表明，TCR的親和力處于低水平或中等水平也可以介導T細胞對腫瘤的殺傷，并且不會誘發(fā)自身免疫性疾病[49-53]。Miller等[49]研究發(fā)現(xiàn)，分別將高親和力或低親和力卵清蛋白（ovalbumin，OVA）特異性TCR-T轉移至卵巢癌小鼠模型后，高親和力的TCR-T在快速殺傷表達OVA的卵巢癌細胞的同時，也造成了小鼠的自身免疫性糖尿?。蝗欢?，低親和力的TCR-T同樣能介導腫瘤細胞的清除，而沒有產生自身免疫性疾病。目前，關于中低親和力TCR-T的良好抗腫瘤功效，只在部分腫瘤中得以體現(xiàn)，比如卵巢癌[49]、黑色素瘤[50-51]等，仍需更多的證據來證明中低親和力TCR應用的普遍性。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些化學藥品、細胞因子和放射療法可以激活HLA信號通路并上調腫瘤細胞表面抗原肽和HLA復合物的表達[54-55]。因此，使用具有最佳親和力的TCR可以特異性地消滅腫瘤細胞，而不會誘發(fā)自身免疫性疾病，并且TCR-T療法與其他療法聯(lián)合使用的組合治療方案有望實現(xiàn)治療效果最大化。

4.3 改善T細胞體內持久性

目前，工程化改造后的T細胞存在著體內持久性受限的問題。無論是傳統(tǒng)的免疫細胞療法，還是TCR-T療法及CAR-T療法，T細胞都需要在體外經刺激活化，大量增殖分化成為終末分化效應T細胞（effector T cell）后輸回體內?；剌?shù)腡細胞無增殖分化能力，且長期的體外刺激活化，使T細胞逐漸進入耗竭狀態(tài)（T cell exhaustion），回輸體內后容易走向死亡，而難以在體內發(fā)揮持久的抗腫瘤效應[56]。研究顯示，記憶T細胞是一群低分化狀態(tài)的異質性T細胞亞群，在持續(xù)對抗腫瘤或遇到復發(fā)腫瘤時能快速增殖分化產生效應T細胞而有效清除腫瘤細胞，在腫瘤免疫應答和免疫記憶維持中發(fā)揮重要作用[57]。

記憶T細胞在不同強度的信號刺激下，可根據表型、功能和轉錄本數(shù)據歸為干細胞記憶T細胞（stem cell memory T cell，TSCM）、中樞記憶T細胞（central memory T cell，TCM）、效應記憶T細胞（effector memory T cell，TEM）及組織駐留記憶T細胞（tissue resident memory T cell，TRM）亞群[58]。Gattinoni等[59]發(fā)現(xiàn)，na?ve T細胞激活分化后產生的TSCM仍具有na?ve T細胞的表型，如CD45RA，CD62L及CCR7，又有激活后T細胞的表型，如CD95，IL2Rβ和IL15Rβ。作為記憶細胞，TSCM能快速地分泌細胞因子，響應IL-15快速地增殖，是一群自我更新能力最強的記憶T細胞亞群。Xu等[60]研究表明，在有IL-15和IL-7條件下體外培養(yǎng)T細胞時，能獲得更高比例TSCM亞群，在小鼠腫瘤模型中的存活持續(xù)時間和抗腫瘤效果更好。TCM表達CD62L和CCR7，具有快速增殖和分化的特征，能夠歸巢至次級淋巴器官。TEM表型為CD62L-CCR7-，更傾向于分泌細胞毒因子，具有較強的溶瘤功能，可遷移至炎癥組織中迅速發(fā)揮效應功能。TRM為組織駐留性記憶T細胞，不參與循環(huán)，由于其浸潤能力以及直接的殺傷效應，能快速響應局部組織抗感染和抗腫瘤，在抗實體瘤中有應用前景[61]。

除了在臨床前小鼠模型中，低分化水平的記憶T細胞在臨床上也展現(xiàn)出更好的治療效果。2019年，Chapuis等[62]報道了靶向抗原WT-1的TCR-T療法的臨床試驗結果，對于TCR-T療法響應較好的患者體內，低分化水平的中樞記憶T細胞所占的比例更高。因此，可以通過改善細胞培養(yǎng)條件或工程化改造T細胞等手段，使回輸?shù)腡CR-T中具有更高比例的記憶性T細胞，從而提高T細胞回輸后在體內的持久性，進而增強TCR-T療法的抗腫瘤功效。

4.4 提高T細胞受體工程化T細胞療法臨床安全性

動物模型在提高TCR-T療法的臨床安全性方面起著關鍵作用。然而，在TCR-T療法開發(fā)的過程中，這些動物模型也會出現(xiàn)無法準確預測細胞治療毒性和移植物抗宿主反應等問題。Rapoport等[63]在以癌睪丸抗原NY-ESO-1為靶標對多發(fā)性骨髓瘤患者進行治療的臨床結果顯示，雖然70%的患者病情接近完全緩解，但有5例患者出現(xiàn)了自體移植物抗宿主反應。Morgan等[64]在以黑色素瘤相關抗原MAGE-A3作為靶標的TCR-T臨床試驗結果顯示，雖然部分患者出現(xiàn)緩解，但有3例患者出現(xiàn)了由腦部損害引起的精神障礙，其中2例受試者甚至面臨死亡的危險，這是由于MAGE-A3 TCR交叉識別結合腦部正常組織中MAGE-A12抗原肽而導致的神經毒性。因此，不同腫瘤類型在選擇特異性TCR時就意味著可能存在特定器官的毒性，如MAGE3 TCR在大腦和心臟中具有毒性。相較于CAR-T，小鼠模型在預測TCR的脫靶或靶標毒性方面有所欠缺。因此，用于TCR-T療法研究的臨床前小鼠模型還需進一步的改進與優(yōu)化。在構建腫瘤模型時，選擇表達了人細胞因子的人源化小鼠品系MITRG和MISTRG，為移植的人源細胞提供物種特異性細胞因子支持，可以更好地驗證TCR-T療法的治療效果和臨床安全性[65]。在TCR-T療法的臨床前研究中，選擇構建人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）小鼠模型，將腫瘤患者的腫瘤組織移植至重癥免疫缺陷型小鼠體內，使小鼠模型能更真實地模擬患者的體內環(huán)境，可為TCR-T治療提供更精準的研究與評價工具[66]。此外，為了真實反映與評價人源免疫細胞與腫瘤微環(huán)境在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮的作用，需要建立更加有效的人免疫反應體系小鼠模型。由于TCR-T發(fā)揮抗腫瘤作用離不開相關免疫細胞的參與，因此，構建含人源免疫細胞系統(tǒng)的人源化小鼠模型，在有效驗證與評估抗腫瘤免疫治療效果中可發(fā)揮至關重要的作用。

除了在非臨床研究的動物模型中驗證TCR-T療法的臨床安全性之外，還可以通過對TCR-T進行改造來增強TCR-T治療的安全性。TCR-T療法在臨床治療中往往展現(xiàn)出較CAR-T療法更低的副作用，但脫靶效應造成的副作用仍阻礙著TCR-T療法的發(fā)展。TCR-T療法對腫瘤患者進行治療的過程中，患者可能會出現(xiàn)CRS等嚴重的副作用，并可能進一步引起致命的并發(fā)癥。若腫瘤抗原在健康組織細胞中低表達，則可能會引起TCR-T的靶點毒性，導致健康細胞被T細胞殺傷[67]。此外，外源TCR和T細胞內源TCR的錯配也可能會導致TCR-T的非特異性脫靶毒性，而對正常組織造成嚴重損害[68]。此時，自殺基因的引入可作為調節(jié)和優(yōu)化TCR-T療法的備選策略。單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是在臨床上經過反復驗證的一種自殺基因，并被證明安全有效，可以賦予TCR-T對更昔洛韋（ganciclovir）的致死敏感性[69-70]。其他自殺基因，比如截短的人類表皮生長因子受體（tEGFR）和誘導型Caspase 9安全開關（iCasp9）也經常被用于提高臨床安全性的設計[71-72]。另外，臨床前需要嚴格評估腫瘤靶向抗原是否會在正常組織或器官中表達。比如，在AFP特異性TCR-T療法開展前，可利用丙氨酸掃描評估TCR-T的特異性和安全性[73]。由于外源TCR在T細胞中表達時，可能存在與內源TCR表達競爭和錯配等問題，可以利用基因編輯和RNA干擾等技術，敲除或敲低內源性TCR，來避免這些問題[74-75]。

5 總結與展望

TCR-T免疫療法正在逐漸發(fā)展成為一種廣泛適用，且功能強大的癌癥治療手段。到目前為止，TCR-T療法已在部分實體瘤的治療中取得了較好的臨床效果，特別是針對黑色素瘤和滑膜細胞肉瘤等的治療。盡管TCR-T療法為腫瘤患者帶來了新的治療選擇和希望，但是該療法對于實體瘤的治療還存在一些挑戰(zhàn)，包括靶向抗原的選擇、腫瘤特異性TCR的開發(fā)、T細胞的體內持久性和TCR-T療法的臨床安全性等。相信隨著工程化改造T細胞研究的不斷發(fā)展，在不久的將來會有更多的腫瘤患者在TCR-T療法中受益。