T細胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

徐曉敏 ，李華

（1. 中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031；2. 國科大杭州高等研究院，浙江 杭州 310000）

目前，以T細胞受體工程化T細胞（T cell receptor-engineered T cell，TCR-T）和嵌合抗原受體T細 胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法為主流的過繼性T細胞免疫療法成為腫瘤免疫治療的一大熱點。通過向天然的T細胞中轉(zhuǎn)入識別腫瘤抗原的T細胞受體（T cell receptor，TCR）α/β異二聚體或嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），T細胞便能夠高效地識別靶抗原，在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤免疫功能。CAR-T療法是過繼性免疫療法中研究較為火熱的一員，目前已上市的產(chǎn)品以及處于臨床階段的CAR-T產(chǎn)品多針對于血液瘤，對于實體瘤的治療效果較差。分析其中原因，主要在于實體瘤的細胞療法存在不少難點，例如不同類型實體瘤的異質(zhì)性大、缺乏獨特的腫瘤相關(guān)抗原作為治療靶點、T細胞無法定向遷移到腫瘤部位、CAR-T的增殖能力和抗凋亡能力等持續(xù)性不夠以及腫瘤內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境對TCR有抑制作用等。雖然CAR-T與TCR-T都與通用的細胞治療兼容，并且能夠誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)，但TCR-T顯示出一些獨特的特性，使其在治療具有挑戰(zhàn)性的實體瘤時具有獨特的優(yōu)勢，但這種優(yōu)勢背后具體的分子機制尚不完全清楚。因此本文主要針對現(xiàn)有的文獻報道，從TCR和CAR本身結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)差異等方面出發(fā)來理解這種臨床治療上的差異，這對于理解TCR-T針對實體瘤的治療優(yōu)勢具有重要意義。

1 T細胞受體的結(jié)構(gòu)

TCR是所有T細胞表面表達的由基因重排產(chǎn)生的天然抗原受體，它與CAR之間存在許多不同。與CAR的單鏈結(jié)構(gòu)不同，TCR由2條高度可變肽鏈組成異二聚體，包括TCR2（α/β）和TCR1（γ/δ）。由于攜帶αβ肽鏈的T細胞占了絕大多數(shù)（98%），所以接下來提及的TCR都默認(rèn)為TCR2（α/β）。TCRα鏈和β鏈均各有1個可變抗原結(jié)合區(qū)、1個恒定區(qū)和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。但TCR鏈并不具備獨立傳遞信號的能力，這是由于TCR的2條肽鏈（αβ）胞內(nèi)區(qū)很短，無法獨立傳遞信號（見圖1）。這種結(jié)構(gòu)特性使得其必須通過跨膜區(qū)（帶正電荷）與分化簇3（cluster of differentiation 3，CD3）分子帶負(fù)電的跨膜區(qū)非共價結(jié)合，形成TCR-CD3復(fù)合物，進而將TCR識別抗原的信號傳遞到胞內(nèi)，將抗原特異性識別與效應(yīng)反應(yīng)結(jié)合起來，啟動一系列信號反應(yīng)。TCR通過1個抗原識別亞基（TCRαβ）和3個CD3信號亞基（CD3δε，CD3γε和CD3ζζ）形成八聚體，而CD3γ，CD3δ和CD3ε鏈各含有1個免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）基序，CD3ζ鏈含有3個ITAM基序，因此1個TCR-CD3復(fù)合物共含有10個ITAM基序和20個關(guān)鍵的酪氨酸磷酸化位點[1]（見圖1）。這些ITAM基序中的酪氨酸磷酸化在TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。2019年，Dong等[2]報道了配體未結(jié)合狀態(tài)下人TCR-CD3復(fù)合物的冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)，分辨率為3.7 ?，并以TCRαβ/CD3δε/CD3γε/CD3ζζ的化學(xué)計量1∶1∶1∶1進行組裝，這與生化實驗所得結(jié)果相呼應(yīng)，進一步證實了TCR-CD3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成。

與TCR-CD3復(fù) 合 物 相比，1個CAR分 子通常由1個包含輕重鏈可變區(qū)域的單鏈可變區(qū)片段（single-chain variable fragment，scFv）抗體的胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成（見圖1）。CAR的跨膜區(qū)與T細胞的跨膜區(qū)功能一樣，具有錨定作用，可以將CAR固定在T細胞膜上，使其穩(wěn)定地發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。CAR的胞內(nèi)區(qū)則由1個（二代CAR）或2個（三代CAR）共刺激受體和CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。與TCR一樣，CAR信號序列上同樣具有多個ITAM，能將CAR接收到的抗原信號轉(zhuǎn)化為活化信號，激活T細胞，使其增殖并分化為效應(yīng)性的T細胞，發(fā)揮抗腫瘤等免疫應(yīng)答功效。但是與天然的TCR相比，CAR僅含有3個ITAM。一項對小鼠TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明，低多樣性的ITAM足以誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生，但TCR驅(qū)動的細胞增殖需要高多樣性ITAM，從而揭示了TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有分級性質(zhì)[3]。此外，更大的ITAM多樣性能夠介導(dǎo)更強的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]，以確保更高比例的細胞在抗原刺激下被激活，而不是簡單地放大單個T細胞的信號強度。因此，合適的ITAM數(shù)量也許在T細胞功能發(fā)揮中具有重要作用。表1對TCR與CAR的特性做了比較。

表1 T細胞受體和嵌合抗原受體的特性對比Table 1 Comparison of characteristics between T cell receptor and chimeric antigen receptor

圖1 T細胞受體和嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Structure diagrams of T cell receptor and chimeric antigen receptor

2 T細胞受體的抗原識別

TCR和CAR識別的抗原類型不同。TCR能夠識別由主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）呈遞的抗原，CAR則利用其scFv識別細胞表面分子。目前的生物信息學(xué)預(yù)測表明，大約27%的人類蛋白質(zhì)組包含膜整合結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能在細胞表面表達，因此這些蛋白質(zhì)能夠被CAR識別[12-13]。這同時也意味著有很大一部分表達在癌細胞內(nèi)的潛在靶點因不能被CAR有效識別而不適用于CAR-T療法。相比之下，TCR可以識別來自整個蛋白質(zhì)組的抗原表位，包括位于細胞表面、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的靶標(biāo)分子。因此，相對于CAR，TCR可以識別更為廣泛的抗原類型，不僅僅局限于細胞表面分子。這也許正是TCR-T在治療實體瘤方面具有更好療效的原因之一。

TCR和CAR對抗原的親和力不同。在工程化的T細胞中，TCR對抗原的親和力至關(guān)重要，能夠決定T細胞治療的安全性和有效性[6]。使用scFv識別域的CAR對抗原的親和力通常在納摩爾（nmol · L-1）級別[5]。相比之下，天然TCR的親和力的數(shù)量級通常在微摩爾（μmol · L-1）級別[14]。基于此，許多學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究人員想利用CAR-T對抗原的高親和性來獲得良好的抗腫瘤功效。然而許多實驗結(jié)果顯示，與高親和力的CAR相比，具備低親和力CAR結(jié)構(gòu)的CAR-T顯示出更強的增殖能力和抗凋亡等持續(xù)性和抗腫瘤能力[15-16]。因此，抗原親和力是否與抗腫瘤功能呈現(xiàn)正相關(guān)仍是一個有待商榷的問題。

TCR和CAR在抗原識別的敏感性方面也不盡相同。雖然基于scFv的CAR相對于TCR對其目標(biāo)抗原具有更高的內(nèi)在親和力，但TCR-T可以感受并響應(yīng)靶細胞上更少的分子，即能夠?qū)O少的抗原肽-MHC復(fù)合物（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）產(chǎn)生反應(yīng)，甚至單一抗原pMHC即可將其激活[17]。相反，CAR修飾的T細胞需要高好幾倍數(shù)量級的抗原刺激才能實現(xiàn)與TCR-T同等水平的細胞因子釋放。Harris等[18]通過將傳統(tǒng)的α/β異二聚體或CAR與CAR胞內(nèi)信號基序結(jié)合，比較了TCR和CAR在相同靶抗原的刺激下兩者信號的差異，結(jié)果表明盡管TCR在膜表面的水平低于CAR，但TCR信號對抗原的敏感度是CAR信號的10 ～ 100倍；另外，定量的單分子活細胞成像結(jié)果顯示TCR的敏感性是CAR的1 000倍[7]。這種敏感性數(shù)量級上的差異的內(nèi)在機制尚不完全清楚，其中一種解釋為相對低親和力的TCR比相對高親和力的scFv擁有更快的抗原解離速率（off-rate），因而能夠連續(xù)不斷地與單個pMHC進行反應(yīng)從而擴大下游信號[19]。這種快速的抗原識別可能對實體瘤的殺傷更有利。

3 T細胞受體的信號啟動

盡管關(guān)于TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制方面的研究層出不窮，但TCR的觸發(fā)機制仍不完全清楚，目前主要有以下幾種機制（不一定相互排斥）被提出。

3.1 動態(tài)隔離模型

當(dāng)TCR復(fù)合物與pMHC復(fù)合物結(jié)合后，會與抗原提呈細胞之間形成免疫突觸。動態(tài)隔離模型（kinetic segregation model）可描述為在免疫突觸中，TCR處于中心位置并形成“緊密結(jié)合區(qū)域”（close contact zones），進而排斥一些大分子蛋白，如磷酸酶CD45分子[20]。這種機制最終導(dǎo)致的結(jié)果即為TCR/CD3近端的激酶和磷酸酶平衡失調(diào)，從而使得CD3被磷酸化，促進T細胞活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在CAR與靶細胞特異性表達抗原結(jié)合的表面，CD45同樣處于被排除狀態(tài)以促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，動態(tài)隔離模型在CAR信號中也許同樣重要[21]。

3.2 動力學(xué)校對機制

動力學(xué)校對機制（kinetic proofreading mechanism）是指pMHC和不同的TCR相互作用過程中，不停地結(jié)合和解離，進行動力學(xué)校對；當(dāng)TCR與pMHC相互作用的半衰期（t1/2）可以維持足夠長的時間，便可以引發(fā)下游信號事件的發(fā)生。近年來利用光遺傳學(xué)技術(shù)的研究也支持TCR的動力學(xué)校對機制，該項研究利用光來調(diào)控TCR或CAR與抗原的相互作用時間。研究表明，CAR具有類似于TCR的校對機制，因此TCR與CAR僅在其以足夠的強度與配體結(jié)合時才響應(yīng)，以確保有足夠的時間與抗原接觸[22]。這種可能性對于優(yōu)化CAR設(shè)計的靈敏度和特異性具有重要意義。

3.3 串行參與模型

串行參與模型（serial engagement model）常與動力學(xué)校對機制并列提及。該模型闡述TCR與pMHC達成緊密結(jié)合就像接力一樣，即單個pMHC可與多個TCR進行連續(xù)性的接觸，而這些連續(xù)性接觸積累起來的結(jié)果，使得TCR與pMHC達到緊密結(jié)合，最終導(dǎo)致T細胞的完全活化[23-24]。

3.4 構(gòu)象形變模型

TCR屬于精巧組裝的復(fù)合物。構(gòu)象形變模型指出，pMHC的刺激會引起TCR分子產(chǎn)生構(gòu)象形變，而微小的構(gòu)象改變都可引發(fā)不同的功能。TCR的構(gòu)象改變發(fā)生在其胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。越來越多的證據(jù)表明，TCR作為機械傳感器，當(dāng)相應(yīng)配體與其特異性結(jié)合后，TCR-CD3復(fù)合物在其胞外區(qū)發(fā)生依賴于力的結(jié)構(gòu)改變[25]。這種機械力來源于細胞外和細胞內(nèi)。關(guān)于細胞外機械力（external force），一方面，位于細胞表面的TCR能夠受到血液剪切力的影響；另一方面，細胞極化會使得T細胞接收來自細胞前沿產(chǎn)生機械外力[25]。另外，在T細胞與抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）或靶細胞形成免疫突觸時，細胞骨架重組導(dǎo)致的逆行流動則會對TCR施加大量內(nèi)在機械力（internal force）[26]。TCR可以利用機械力引發(fā)pMHC構(gòu)象變化，多步級聯(lián)放大激動型和非激動型抗原的差別，從而在面臨多樣性的抗原時，保持與特定pMHC緊密的錨定，實現(xiàn)精準(zhǔn)的抗原識別[27]。對于CAR而言，目前尚不清楚是否存在同樣的機制。但是，CAR分子結(jié)構(gòu)是支持其進行力依賴的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)改變的。TCR跨膜區(qū)的構(gòu)象改變涉及CD3ζ，TCRα以及TCRβ跨膜區(qū)。CAR的跨膜區(qū)由CD8α或CD28的跨膜區(qū)構(gòu)成，目前關(guān)于CAR跨膜區(qū)構(gòu)象形變引發(fā)其功能改變的研究尚未見報道。

在TCR-CD3復(fù) 合 物 中，CD3ε的 胞 內(nèi) 區(qū) 含有1個富含堿性氨基酸的區(qū)域（basic residue rich sequence，BRS）、1個富含脯氨酸的區(qū)域（proline rich sequence，PRS）和1個ITAM；CD3ζ的胞內(nèi)區(qū)含有3個ITAM，以及2個夾在其間的BRS；CD3γ和CD3δ的胞內(nèi)區(qū)各含1個ITAM。研究表明，帶正電的CD3ε和CD3ζ的BRS可以與質(zhì)膜內(nèi)葉中帶負(fù)電的酸性磷脂相結(jié)合，暗示兩者能夠在pMHC結(jié)合時進行動態(tài)的結(jié)合與釋放，并且這種動態(tài)化的變化與CD3ε和CD3ζ的ITAM基序的磷酸化機制密切相關(guān)。在T細胞靜息狀態(tài)下，CD3ε的BRS區(qū)域可以與細胞質(zhì)膜上的酸性磷脂發(fā)生靜電相互作用，從而使得整個CD3ε的胞內(nèi)區(qū)被屏蔽在膜脂雙層中。這種膜屏蔽機制既屏蔽了CD3ε的酪氨酸位點，同時也阻止了BRS區(qū)與淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck）的相互作用，達到抑制TCR整體磷酸化的效果[28]。當(dāng)TCR與特異性的抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合后，會使得TCR發(fā)生形變，CD3ε胞內(nèi)區(qū)從膜上解離下來，暴露其中的酪氨酸磷酸化位點。此外，由于T細胞活化導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度的上升，內(nèi)流的鈣離子可以通過中和酸性磷脂負(fù)電荷的方式使得未直接接觸抗原的TCR中的CD3ε胞內(nèi)區(qū)從膜上解離[29]；于是，暴露于胞質(zhì)的游離CD3ε ITAM進一步被下游的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶磷酸化，進而發(fā)生一系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，從而放大TCR活化信號。另外，還有學(xué)者指出pMHC與TCR的結(jié)合會暴露CD3ε的PRS區(qū)域，這一暴露的PRS區(qū)域可以為含有SH3結(jié)構(gòu)域的非催化域酪氨酸激酶（non-catalytic region of tyrosine kinase，Nck）提供結(jié)合位點并進一步放大TCR信號[30-31]。但不管是BRS還是PRS，都暗示TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是簡單的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，其中必定存在尚不清楚的復(fù)雜結(jié)構(gòu)變化，因此，對pMHC與TCR結(jié)合后，導(dǎo)致TCR復(fù)合物磷酸化及其結(jié)構(gòu)變化的理解仍然是一個非常大的挑戰(zhàn)。近期以機械力為參數(shù)的研究另辟蹊徑，利用TCR與激動型pMHC配體的結(jié)合具有機械力依賴性的特點，通過觀測TCR與pMHC配體結(jié)合時形成“捕獲鍵（catch bond）”還是“滑移鍵（slip bond）”，研究人員能夠推測下游信號激活的差異[32]。

受體聚集也是導(dǎo)致構(gòu)象形變的機制之一。配體結(jié)合會導(dǎo)致膜蛋白的聚集或構(gòu)象改變。Janeway于1995年首次提出TCR的活化伴隨TCR的聚集和構(gòu)象改變。由于常規(guī)T細胞的激活并不需要pMHC多聚體[33]，因此受體聚集可能并不是TCR激活的主要機制。而CAR啟動信號傳遞必須依賴CAR蛋白分子聚集[34-35]，因此這種機制可能在CAR中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。

4 T細胞受體和嵌合抗原受體免疫突觸的形成

上文提到，TCR和CAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始伴隨受體聚集。對于天然TCR而言，當(dāng)TCR與pMHC結(jié)合后，T細胞和APC之間會形成復(fù)雜而有序的超分子結(jié)構(gòu)，稱為超分子激活聚集體（supramolecular activation cluster，SMAC），即免疫突觸。這種細胞與細胞之間的接觸包括“immunological kinapse”（IK）和“immunological synapse”（IS）。其中kinapse是TCR在受體遷移尋找相應(yīng)配體pMHC的過程中形成的一種瞬時且不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，synapse則是TCR與pMHC識別后形成的穩(wěn)定長時間接觸面[36]。TCR刺激和共刺激信號水平、T細胞的分化狀態(tài)以及靶細胞的表型共同決定了細胞是否形成對稱、穩(wěn)定的IS或瞬時的IK，或在2種模式之間過渡[37]。IS由3種不同類型的受體組成，包括TCR、黏附受體和共刺激或共抑制受體，以及它們相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在TCR與pMHC識別過程中，T細胞和APC之間會形成約為15 nm的間隙，這為受體和配體形成IS提供了空間[38]。黏附分子通過將細胞膜緊密連接在一起來支持IS的結(jié)構(gòu)，這對于持續(xù)的抗原識別必不可少。另外，IS招募的共刺激受體或共抑制受體可以顯著調(diào)節(jié)T細胞的激活。T細胞與B細胞或平面抗原呈遞底物相互作用的免疫熒光成像顯示，SMAC由3個同心圓環(huán)組成，類似于“牛眼（bull,s eye）”[39]（見圖2）。中央SMAC（cSMAC）形成中心環(huán)，外圍SMAC（pSMAC）和遠端SMAC（dSMAC）在其外圍環(huán)繞。每個環(huán)都有自己特殊的組成和功能。cSMAC包含一定濃度的TCR和共刺激分子CD28，負(fù)責(zé)伴隨突觸形成的關(guān)鍵T細胞激活信號事件；pSMAC包含一系列黏附分子，如淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte functionassociated antigen-1，LFA-1），負(fù)責(zé)穩(wěn)定細胞間的相互作用；dSMAC由絲狀肌動蛋白組成，有助于對突觸施加機械力，另外，dSAMC還聚集許多酪氨酸磷酸酶，最典型的即為CD45[40]。

CAR-T突觸并不像SMAC那樣具有高度組織性。相反，它們是雜亂無章的、零散的信號簇，缺乏明確的結(jié)構(gòu)。除了不形成較小且不典型的F-肌動蛋白環(huán)之外，CAR形成的免疫突觸缺乏黏附環(huán)并且Lck激酶簇呈散亂分布[9,41]（見圖2）。因此，CAR-T與其靶細胞形成的免疫突觸在結(jié)構(gòu)上不同于經(jīng)典免疫突觸[9,21]。這也可能是兩者具有殺傷能力差異的重要原因之一。

圖2 T細胞受體和嵌合抗原受體免疫突觸的比較Figure 2 Comparison of immune synapses between T cell receptor and chimeric antigen receptor

CAR-T突觸和經(jīng)典pMHC/TCR突觸之間的這些結(jié)構(gòu)差異會導(dǎo)致功能差異。對突觸形成后TCR-T介導(dǎo)的殺傷與CAR-T介導(dǎo)的殺傷的時程比較顯示，CAR-T的信號強度比TCR-T信號更強且上升更快，穿孔素（perforin）和顆粒酶B（granzyme B）的釋放更快，脫落也明顯更快。因此，與細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）相比，CAR-T殺死靶細胞的速度更快[9,41]。而無序的CAR-T突觸可能就是其快速殺傷活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[42]。需要指出的是，這里CAR-T的快速殺傷活性建立在高抗原密度的基礎(chǔ)上。在低抗原密度下，CAR-T近端信號弱且常受限于其活化閾值而不能夠?qū)Π屑毎M行有效殺傷[7]。這種對靶抗原的低敏感性正好能夠解釋在CAR-T免疫治療中由于腫瘤抗原低表達或無法檢測而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[43]。

了解突觸的形成機制并鑒定其質(zhì)量非常有必要。基于玻璃制成的平面脂質(zhì)雙層系統(tǒng)的成像系統(tǒng)已被用于預(yù)測IS的質(zhì)量，并證明IS的質(zhì)量與CAR-T功能相關(guān)聯(lián)[44]。更有數(shù)據(jù)表明，在病理條件下，高IK頻率表明T細胞無能化，進入免疫耐受狀態(tài)而阻止腫瘤免疫[45]。由此可見，合適的IS形成是T細胞抗腫瘤功能發(fā)揮的必要條件。然而，目前IS在T細胞中的形成機制仍未完全了解，還有許多關(guān)鍵問題有待回答。例如CAR-T這種無序IS結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的機制尚不清楚。有研究人員將具有高親和力識別結(jié)構(gòu)的CAR與天然的TCR融合或連接后發(fā)現(xiàn)，改造后的T細胞能夠與相應(yīng)的靶細胞形成典型的穩(wěn)定的IS結(jié)構(gòu)[46-47]。因此，這種IS結(jié)構(gòu)的混亂也許并不是由于CAR對抗原的高親和力及它的非MHC限制性性質(zhì)所導(dǎo)致。鑒于IS結(jié)構(gòu)的重要性，仍需進一步了解其在抗腫瘤作用中的地位。

5 T細胞受體的近端信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

TCR通過其配體識別亞基與APC上特異性表達的pMHC復(fù)合物結(jié)合，激活TCR信號通路。SRC家族蛋白酪氨酸激酶Lck是TCR信號起始的關(guān)鍵因子，它能夠與CD4和CD8共受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并分別通過CD8或CD4與MHC I類或MHC II類復(fù)合物的共結(jié)合募集至TCR。處于活化構(gòu)象的Lck可以磷酸化ITAM，每個ITAM具有2個可被磷酸化的關(guān)鍵酪氨酸殘基，被雙磷酸化的ITAM可以招募相對分子質(zhì)量為70 000的ζ鏈相關(guān)蛋白激酶（zeta-chain-associated protein kinase-70，ZAP-70），使蛋白酪氨酸激酶ZAP-70結(jié)合到CD3鏈中[48]。這里需要說明的是，Lck激酶包括游離狀態(tài)和與共受體偶聯(lián)的2類群體，它們均能在TCR活化后磷酸化CD3，但游離狀態(tài)的激活態(tài)Lck會被更早地招募至TCR起始信號傳遞[49]。換言之，由Lck介導(dǎo)的TCR活化可以分為2個階段：首先，游離態(tài)Lck激酶最先被招募到TCR并磷酸化CD3 ITAM；接著，與共受體偶聯(lián)的Lck被招募，一方面能夠促進TCR與pMHC的結(jié)合，另一方面起到放大信號的作用[49-51]。隨后，與ITAM結(jié)合的ZAP-70被磷酸化并招募更多的ZAP-70分子且進一步傳遞信號。由此可見，Lck和ZAP-70之間存在著非常嚴(yán)格的層級關(guān)系，Lck位于ZAP-70的上游[24]。

Lck在TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起始中發(fā)揮非常重要的功能，它將細胞外TCR與pMHC的結(jié)合事件與細胞內(nèi)生物化學(xué)事件聯(lián)系在一起。研究發(fā)現(xiàn)，Lck的定位和構(gòu)象變化是TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要決定因素[52-53]。Lck由1個UD結(jié)構(gòu)域（unique domain）、2個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（SH3和SH2）和1個激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain）組成，它包含若干個磷酸化位點，其激酶活性受2個關(guān)鍵調(diào)節(jié)性酪氨酸位點Y394和Y505的磷酸化和去磷酸化控制。Y394位于Lck激酶環(huán)中，其自磷酸化可以穩(wěn)定催化結(jié)構(gòu)域的活性構(gòu)象。而C末端Src激酶（C-terminal Src kinase, Csk）能夠?qū)ck的活性負(fù)向調(diào)控，它通過對Lck羧基末端Y505殘基的磷酸化，促進Y505與Lck SH2結(jié)構(gòu)域的分子相互作用，從而穩(wěn)定了使催化結(jié)構(gòu)域失活的折疊構(gòu)象。CD3ε ITAM存在部分單磷酸化現(xiàn)象，這種單磷酸化的CD3ε能夠招募抑制性激酶Csk，發(fā)揮抑制性作用[54]。另外，跨膜酪氨酸磷酸酶CD45可使Lck磷酸化的Y505和Y394去磷酸化，因此，CD45可以直接調(diào)節(jié)控制Lck活性。上文中已經(jīng)提到，在T細胞活化早期，游離的活化型Lck最先被招募至TCR附近磷酸化CD3鏈以及一些關(guān)鍵的激酶來起始T細胞活化，這可能是由于游離的Lck比與共受體結(jié)合的Lck具有更高的流動性、更多的Y394磷酸化以及更強的激酶活性[55]，因而游離的Lck對于TCR的早期活化非常重要；但當(dāng)共受體結(jié)合的Lck不能被招募到TCR周圍時，T細胞同樣不能被有效地活化[56]。另外，作為早期活化的重要成分，ITAM和ZAP-70的磷酸化都需要具有活性的Lck的存在，因此活化型的Lck必須位于TCR:pMHC附近足夠長的時間，以確保這些事件的發(fā)生。綜上，Lck的定位和構(gòu)象變化都將影響免疫突觸的形成和穩(wěn)定性。

關(guān)于CAR，與TCR共享相同的CD3ζ胞內(nèi)區(qū)的同時，它還包含CD28和腫瘤壞死因子超家族成員4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域。因此CAR與TCR之間，以及包含不同共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR之間的近端信號傳導(dǎo)不盡相同。例如，在包含CD28或4-1BB的2種二代CAR中，配體結(jié)合后，CD3ζ ITAM的磷酸化雖然位置相同，但強度不同，包含CD28的CAR在早期時間點檢測到更強的磷酸化信號。這可能是因為CD28含有1個可以結(jié)合Lck的脯氨酸富含區(qū)，使其能夠像共受體一樣招募Lck[57]。有關(guān)CAR的近端信號傳導(dǎo)仍屬于活躍的研究領(lǐng)域。

6 T細胞受體的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在上述提及的一系列酪氨酸激酶初始激活后，T細胞活化銜接因子（the linker of active T cells, LAT）和含SH2結(jié)構(gòu)域相對分子質(zhì)量為76 000的白細胞磷酸化蛋白（SH2 domain-containing leukocyte phosphoprotein of 76 000, SLP-76）被磷酸化，活化T細胞，募集多個銜接因子和效應(yīng)分子，形成LAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體來調(diào)節(jié)下游信號[58]。LAT的磷酸化由ZAP-70介導(dǎo)，而兩者的連接通過Lck激酶的SH2作為橋梁所介導(dǎo)[59]。隨后，磷酸化的LAT招募磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ, PLC-γ）、生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2, GRB 2）和Shc下游GRB相關(guān)接頭蛋白（GRB-related adaptor downstream of Shc, Gads）。LAT相關(guān)效應(yīng)分子的活化導(dǎo)致信號通過3種主要信號通路進行轉(zhuǎn)導(dǎo)：鈣調(diào)蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κ-B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路。鈣調(diào)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會導(dǎo)致活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）發(fā)生核轉(zhuǎn)移。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致肌動蛋白聚合以及轉(zhuǎn)錄因子FOS，JUN和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的激活；NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使REL和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子核移位；這些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用引起T細胞增殖和遷移、細胞因子分泌、免疫突觸的形成以及相關(guān)效應(yīng)功能。由此可見，LAT是T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需支架蛋白。

由于CAR是利用CD3ζ作為信號基序去激活T細胞的效應(yīng)功能，因此普遍認(rèn)為CAR存在與TCR相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。許多著眼于CAR下游的磷酸化事件的研究結(jié)果顯示CAR-T和TCR-T的磷酸化事件雖然在量級和動力學(xué)上存在差異，但CAR-T中并未出現(xiàn)新的通路[57,60-61]。CAR利用相同的分子機制去轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，包括PLC-γ，ZAP-70，LAT和Src家族蛋白激酶等。但也有研究表明，CAR和TCR擁有不同的信號通路，即CAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以繞過LAT[10]。此外，CAR-T對抗原刺激之后的表現(xiàn)仍有無法解釋的方面。例如，與TCR相比，CAR觸發(fā)下游信號分子的酪氨酸磷酸化更快，細胞毒性顆粒釋放更快[62]。通過直接將TCR和CAR表達在同一細胞中進而比較它們的信號過程，發(fā)現(xiàn)盡管TCR信號與CAR信號相比更緩慢和更微弱，但TCR信號更為持久[9]。另外，兩者對抗原的敏感性不同。已有許多研究指出，TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有高度的敏感性，在只有單個抗原pMHC存在的情況下，就足以激活T細胞反應(yīng)[8,63]。然而，CAR的激活需要更多的抗原分子刺激[62]。有學(xué)者解釋這種低敏感性是由于CAR活化時近端信號明顯減弱導(dǎo)致，盡管CAR在免疫突觸內(nèi)的抗原結(jié)合親和力方面表現(xiàn)優(yōu)于TCR，但其胞內(nèi)區(qū)CD3ζ鏈的酪氨酸蛋白激酶ZAP-70的招募效率很低[7]。CAR的這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷，一方面限制了CAR-T療法治療表面抗原密度低的腫瘤的療效；另一方面，這也許解釋了CAR-T臨床治療中患者由于腫瘤的抗原表達水平低或無法檢測到而出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。

CAR和TCR在激活后具有許多相似的下游信號事件，如它們都分泌穿孔素和顆粒酶B去誘導(dǎo)靶細胞的凋亡，并表達細胞因子和趨化因子來增強免疫功能或調(diào)控炎癥反應(yīng)，然而，臨床報告卻顯示出不同的結(jié)果。細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）表現(xiàn)為CAR-T療法中最常見的毒性，其確切的機制尚不完全清楚；其潛在的原因可能是CAR異?；蜻^度活化的信號。在靜息態(tài)T細胞中，CD3ζ肽鏈對借助于其C末端的正電與質(zhì)膜上帶負(fù)電的酸性磷脂相互作用，從而達到屏蔽信號的作用[29]。而當(dāng)抗原不存在時，CAR-T仍存在很強的基底信號[64]。因此，高強度的基底信號也許放大了信號而促進細胞因子的產(chǎn)生，進而進一步導(dǎo)致細胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生而影響CAR-T療法的療效。此外，在天然的TCR復(fù)合物中，CD3ε ITAM可被單磷酸化，從而招募Csk磷酸酶，發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能[54]。提示除了過強的活化信號，有關(guān)負(fù)調(diào)控信號在CAR中的缺失也可能是導(dǎo)致CRS的重要原因。總之，天然TCR復(fù)合物結(jié)構(gòu)遠比想象的更復(fù)雜，故應(yīng)當(dāng)意識到其在指導(dǎo)過繼性免疫療法中T細胞設(shè)計改造方面的重要性。

7 結(jié)語

TCR-T和CAR-T療法均為過繼性免疫療法治療癌癥的前沿技術(shù)，且基本思路均為將T細胞在體外進行修飾、擴增后再植入患者體內(nèi)，2種改造過的受體都能夠介導(dǎo)T細胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用。但兩者顯然存在許多不同：包括結(jié)構(gòu)、抗原識別機制和識別類型、對抗原響應(yīng)的敏感度等。CAR-T療法已在難治性白血病和淋巴瘤患者中誘導(dǎo)了顯著的反應(yīng)，并獲得了美國FDA的批準(zhǔn)，因此其對血液瘤及淋巴瘤的功效毋庸置疑。但目前許多臨床數(shù)據(jù)均顯示TCR-T療法在治療實體瘤的能力方面比CAR-T療法略勝一籌?？偟膩碚f，從2種細胞本身特點出發(fā)：首先，CAR-T靶向腫瘤抗原，而TCR-T除了識別表面抗原之外，還能夠通過白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）提呈進而靶向細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組，這意味著TCR-T可以識別廣泛的腫瘤抗原，不限于膜表達抗原，還包括一些由體細胞突變產(chǎn)生的新抗原（neo-antigen）。此外，從患者體內(nèi)取出的T細胞所制備的TCR-T與患者HLA等位基因匹配，避免了移植后的免疫排斥反應(yīng)。最后，TCR-T有更好的腫瘤浸潤和分布，而CAR-T由于識別表面抗原傾向于分布在腫瘤周圍，使得TCR-T在治療實體瘤時更有效[11]。盡管如此，目前對于特異性腫瘤抗原靶點的發(fā)現(xiàn)還甚少，并且從病人體內(nèi)取出的T細胞無法在體外有效地大量擴增，體外的制備工序費時費力。另外，科學(xué)家們現(xiàn)在還無法很好地解決T細胞療法治療后的大量不良反應(yīng)。綜上所述，過繼性免疫細胞療法治愈癌癥任重而道遠。不論是CAR-T療法，還是TCR-T療法都仍存在一系列問題，因此很有必要清楚理解基本的TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，并為設(shè)計更好的T細胞產(chǎn)品提出新的策略，以求其在實體瘤臨床治療中得到進一步應(yīng)用。