超聲結(jié)合熱處理對(duì)金黃色葡萄球菌及其生物膜的抗菌和抗生物膜機(jī)制

孫晉躍 王德寶 孫芝蘭 熊強(qiáng) 劉芳 徐為民 王道營(yíng) 李坤鵬

摘 要：將超聲（ultrasound，US）與熱處理（heat，HT）相結(jié)合（UH），研究其對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的殺菌效果，并分析其抗菌和抗生物膜機(jī)制。結(jié)果表明：US聯(lián)合70 ℃ HT（UH70）可顯著降低金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的數(shù)量（P<0.05）;掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，UH70對(duì)菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性具有明顯的破壞作用，激光共聚焦掃描顯微鏡顯示，UH70導(dǎo)致細(xì)胞的通透性急劇增加，從而導(dǎo)致胞外ATP、核酸和蛋白質(zhì)含量顯著增加（P<0.05）;此外，UH70能引起細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈脫氫酶活性顯著降低，引起生物膜胞外多糖含量顯著降低（P<0.05）。綜上所述，US結(jié)合HT與單獨(dú)的US或HT相比具有較強(qiáng)的殺菌效果，它可以通過(guò)破壞金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，引起細(xì)胞膜通透性的改變，造成ATP、核酸、蛋白質(zhì)外泄，降低細(xì)菌呼吸鏈脫氫酶的活性，達(dá)到協(xié)同殺菌目的。

關(guān)鍵詞：超聲;熱處理;金黃色葡萄球菌;游離細(xì)胞;生物膜

Antibacterial and Antibiofilm Mechanism of Ultrasound in Combination with Heat against Staphylococcus aureus

SUN Jinyue1，2， WANG Debao1， SUN Zhilan1， XIONG Qiang2， LIU Fang1，*， XU Weimin1， WANG Daoying1， LI Kunpeng3

（1.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;

2.College of Food Science and Light Industry， Nanjing Tech University， Nanjing 211816， China;

3.Xuzhou Datun Lijia Food Co. Ltd， Xuzhou 221618， China）

Abstract： This study was devised to investigate the bactericidal effect and mechanism of ultrasound （US） in combination with heat （HT） against Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells. The results showed that US combined with HT at 70 ℃ （UH70） significantly reduced the counts of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells （P < 0.05）. Scanning electron microscopy （SEM） showed that UH70 obviously damaged the cell membrane. Confocal laser scanning microscopy （CLSM） indicated that UH70 sharply increased the permeability of the cell membrane， thereby causing a significant increase in the extracellular concentrations of ATP， nucleic acid and protein （P < 0.05）. In addition， UH70 significantly decreased the activity of intracellular respiratory chain dehydrogenase and the concentration of extracellular polysaccharide in the biofilm （P < 0.05）. In conclusion， US combined with HT could have stronger bactericidal effect than either alone. The synergistic bactericidal mechanism may be related to destroying the cell membrane， altering cell membrane permeability， causing the leakage of ATP， nucleic acid and protein out of the cells， and reducing the activity of respiratory chain dehydrogenase.

Keywords： ultrasound; heat; Staphylococcus aureus; planktonic cells; biofilm

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210809-197

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）10-0062-08

引文格式：

孫晉躍， 王德寶， 孫芝蘭， 等. 超聲結(jié)合熱處理對(duì)金黃色葡萄球菌及其生物膜的抗菌和抗生物膜機(jī)制[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 62-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210809-197.? ? http：//www.rlyj.net.cn

SUN Jinyue， WANG Debao， SUN Zhilan， et al. Antibacterial and antibiofilm mechanism of ultrasound in combination with heat against Staphylococcus aureus[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 62-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210809-197.? ??http：//www.rlyj.net.cn

雞肉肉質(zhì)鮮美，脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量高，口感細(xì)膩，因此一直受到消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。目前，雞肉的營(yíng)銷以冷鮮雞肉為主。冷鮮雞肉指的是在0～4 ℃條件下貯藏和銷售的雞肉。但是，由于處理溫度相對(duì)較低，且蛋白質(zhì)含量高，因此雞肉極易受到一些食源性致病菌和食源性條件致病菌污染，從而導(dǎo)致雞肉腐敗變質(zhì)[2]。金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽(yáng)性食源性病原菌之一，可引起人和動(dòng)物受傷部位的感染，引發(fā)心血管發(fā)炎和肺炎[3-4]。同時(shí)，奶酪、牛肉、雞肉、魚(yú)類等高蛋白食品易受到金黃色葡萄球菌的污染[5-7]。生物膜是細(xì)菌污染食品的另外一種方式。一方面，生物膜的胞外會(huì)有許多大分子物質(zhì)聚集，形成一層胞外基質(zhì)。胞外基質(zhì)的存在會(huì)對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力，增加滅菌難度[8]。

另一方面，食品、食品加工設(shè)備以及一些隱蔽處會(huì)增大形成生物膜的的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致食品的交叉污染[9-10]。

因此，鑒于金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的危害，開(kāi)發(fā)高效的殺菌技術(shù)抑制金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的生長(zhǎng)就顯得尤其重要。

近年來(lái)，超聲（ultrasound，US）殺菌技術(shù)受到廣泛關(guān)注。然而，當(dāng)單獨(dú)使用US殺菌時(shí)，并沒(méi)有顯示出對(duì)食源性致病菌有較強(qiáng)殺菌作用，且殺菌效率較低[11]。因此，許多研究者將US協(xié)同滅菌作為提高滅菌效率的替代方法。Guo Liping等[12]報(bào)道US和次氯酸鈉聯(lián)合處理對(duì)滅活大腸桿菌具有協(xié)同作用。許愈等[13]報(bào)道，US聯(lián)合酸性電解水可以提高對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效率。熱殺菌是一種傳統(tǒng)的殺菌技術(shù)，在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。在72 ℃條件下處理20 min或在82 ℃條件下處理5 min，可有效減少杏仁表面食源性致病菌的數(shù)量[14]。然而，較高的溫度可能會(huì)損害食品的營(yíng)養(yǎng)成分和感官質(zhì)量。因此，尋找一種既能滅活食品中的微生物，又能保證食品質(zhì)量不受損害的方法具有重要意義。Li Jiao等[15]報(bào)道，US與加熱相結(jié)合可以縮短滅菌時(shí)間并降低滅菌溫度。

本研究確定熱處理（heat，HT）、US、US結(jié)合HT（UH）對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的殺菌效果，研究UH的抗菌和抗生物膜機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株，由課題組從雞肉中分離并保存。

BHI腦心浸液肉湯、BHI腦心浸液固體培養(yǎng)基?青島海博生物科技有限公司;Nunc? Lab-TekTM 8 孔腔室蓋玻片系統(tǒng)、LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;24 孔聚氯乙烯培養(yǎng)板 美國(guó)康寧公司;增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-800KD超聲清洗機(jī) 中國(guó)昆山超聲儀器有限公司;Centrifuge 5810R離心機(jī)、Centrifuge 5424R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Gen5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;Ultra View VOX轉(zhuǎn)盤(pán)式激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國(guó)卡爾蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

將從-80 ℃冰箱取出的金黃色葡萄球菌菌液解凍，然后用接種環(huán)蘸取菌液，在BHI固體平板上劃線，并在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落放置于5 mL的BHI腦心浸液肉湯試管中，37 ℃條件下，200 r/min培養(yǎng)12 h，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，濃度約為109 CFU/mL，連續(xù)轉(zhuǎn)接2 次后備用[13]。

1.3.2 US、HT、UH處理

HT、US、UH處理金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞。通過(guò)恒溫水浴鍋進(jìn)行HT處理，溫度分別為50、60、70 ℃（HT50、HT60、HT70組），加熱時(shí)間分別為5、10、20、30、60 min。在超聲波清洗機(jī)（50 kHz、400 W）進(jìn)行US和UH處理，處理溫度分別為50、60、70 ℃（UH50、UH60、UH70組），處理時(shí)間分別為5、10、20、30、60 min。未經(jīng)任何處理的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞在室溫下放置5、10、20、30、60 min作為空白對(duì)照。

1.3.3 金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞的滅菌處理

將對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌菌液1 mL收集至離心管中，在4 ℃條件下，5 000 r/min離心10 min，去除培養(yǎng)基，并用0.85 g/100 mL生理鹽水洗滌菌泥3 次，然后注入5 mL 0.85 g/100 mL生理鹽水，制備成菌懸液（約109 CFU/mL）。將金黃色葡萄球菌菌懸液用US、HT50、HT60、HT70、UH50、UH60、UH70分別處理5、10、20、30、60 min。最后，用0.85 g/100 mL生理鹽水連續(xù)10 倍梯度稀釋菌懸液，選取合適稀釋梯度的菌懸液1 mL，加入平板，并加入BHI固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后放入37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[13，16]。

1.3.4 金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞的滅菌處理

將1 mL濃度約為107 CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液添加到24 孔聚氯乙烯培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，并在37 ℃條件下培養(yǎng)72 h，每24 h更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后得到生物膜細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基，并用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）清洗生物膜3 次，最后向每個(gè)孔中添加1 mL 0.01 mol/L PBS，制備生物膜細(xì)胞懸液（約109 CFU/mL）。用US、HT50、HT60、HT70、UH50、UH60、UH70處理生物膜細(xì)胞懸液，處理時(shí)間分別為5、10、20、30、60 min。經(jīng)不同處理后，將生物膜溶液收集至裝有9 mL 0.01 mol/L PBS的試管中，用已滅菌的棉簽刮擦孔壁和底部，并將棉簽一起放入試管中。按照1.3.3節(jié)方法對(duì)生物膜中細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5 SEM和CLSM觀察細(xì)胞形態(tài)

用US、HT70和UH70處理金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞30 min，此外，未經(jīng)任何處理并置于室溫下30 min的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞用作空白對(duì)照。

參考Liu Fang等[16]的方法。游離細(xì)胞SEM觀察：將處理和未經(jīng)處理的菌懸液在5 000×g、4 ℃條件下離心10 min，并留下菌泥，然后，將菌泥用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛在4 ℃條件下固定12 h，通過(guò)SEM觀察游離細(xì)胞形態(tài);生物膜細(xì)胞SEM觀察：將濃度約107 CFU/mL的未經(jīng)處理金黃色葡萄球菌菌液（400 ?L）添加到8 孔室載玻片的每個(gè)孔中，并根據(jù)1.3.4節(jié)方法進(jìn)行生物膜培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)不同處理后，將8 孔室載玻片割成小方塊，并用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛在4 ℃條件下固定12 h，通過(guò)SEM觀察生物膜細(xì)胞形態(tài)。

參考Liu Fang等[16]的方法。游離細(xì)胞CLSM觀察：將處理和未經(jīng)處理的菌懸液在5 000×g、4 ℃條件下離心10 min，使用LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒染色30 min，通過(guò)CLSM觀察游離細(xì)胞形態(tài);生物膜細(xì)胞CLSM觀察：采用SEM分析中的方法培養(yǎng)生物膜，將經(jīng)不同處理后的生物膜用LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒染色30 min，然后去除隔板，在CLSM下觀察生物膜細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6 金黃色葡萄球菌生物膜中胞外多糖含量測(cè)定

參考Liu Fang等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。用US、HT70和UH70處理金黃色葡萄球菌生物膜30 min，未經(jīng)任何處理并置于室溫下30 min的金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞用作空白對(duì)照。將處理和未經(jīng)處理的生物膜細(xì)胞收集到不同試管中，在5 000×g、4 ℃條件下離心30 min，收集上清液測(cè)定可溶性多糖含量，收集沉淀物并重懸在10 mL 0.85 g/100 mL NaCl溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.22%甲醛）中，用于測(cè)定不溶性多糖含量。采用苯酚-硫酸法測(cè)定可溶性和不溶性多糖含量。

1.3.7 胞外ATP、核酸、蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參考Liu Fang[16]、Guo Mingming[17]等的方法。用US、HT50、HT60、HT70、UH50、UH60和UH70處理金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞30 min，在3 000×g、4 ℃條件下離心10 min，收集上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD260 nm、OD280 nm），分別用于表征核酸、蛋白質(zhì)含量。

參考Liu Fang等[16]的方法進(jìn)行胞外ATP含量測(cè)定。用US、HT50、HT60、HT70、UH50、UH60和UH70處理金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞30 min，在10 000×g、0 ℃條件下離心1 min，取上清液，按照試劑盒步驟進(jìn)行操作測(cè)定胞外ATP含量。

1.3.8 呼吸鏈脫氫酶活性測(cè)定

通過(guò)氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）實(shí)驗(yàn)測(cè)定呼吸鏈脫氫酶的活性[18-19]。用US、HT50、HT60、HT70、UH50、UH60和UH70處理金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞30 min。然后將菌液與2 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）、2 mL 0.1 mol/L葡萄糖溶液和2 mL 1 mg/mL TTC溶液混合，并置于37 ℃反應(yīng)5 h。最后，將樣品與5 mL石油醚混合，并提取有機(jī)相。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得有機(jī)相在490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD490 nm）。呼吸鏈脫氫酶活性與OD490 nm呈正相關(guān)，以O(shè)D490 nm分析呼吸鏈脫氫酶活性變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有樣本為3 份，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 26.0軟件中的ANOVA分析對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間的顯著性差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 US、HT和UH處理對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞的殺菌效果

由圖1可知，在處理5 min時(shí)，US、HT50、HT60和HT70組只能使0.13、0.35、0.75、1.37（1g（CFU/mL））的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞失活，而處理30 min時(shí)可使0.31、0.79、5.74、7.21（1g（CFU/mL））的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞失活。這表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞逐漸減少。此外，溫和的熱處理比超聲處理對(duì)細(xì)菌的滅活更有效。US處理60 min只能使0.35（1g（CFU/mL））的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞失活，然而，HT70處理60 min可使7.23（1g（CFU/mL））的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞失活。此外，UH比US或HT單獨(dú)處理更有效。UH70處理60 min可使得金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞數(shù)量降低到低于檢出限（≤1.4（1g（CFU/mL））），而單獨(dú)的US或HT在本研究中的任何處理時(shí)間也達(dá)不到相同的處理效果。

2.2 US、HT和UH處理對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞的殺菌效果

由圖2可知，對(duì)照組的金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞數(shù)量約為9.40（1g（CFU/mL）），經(jīng)US、HT50、HT60和HT70處理5 min后，金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞分別減少0.08、0.46、0.87、1.35（1g（CFU/mL）），處理30 min后分別減少0.22、0.65、2.93、5.35（1g（CFU/mL）），這表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞逐漸減少。此外，金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞經(jīng)HT70處理60 min后，減少6.10（1g（CFU/mL）），減少量高于US處理60 min，金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞只能減少0.42（1g（CFU/mL））。UH60處理30 min，生物膜細(xì)胞數(shù)量的減少值大于US和HT60處理30 min的減少值之和。

2.3 SEM和CLSM觀察

用SEM觀察金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞，由圖3A1～D1、A3～D3可知，對(duì)照組的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞表面完整光滑，無(wú)任何孔隙，且生物膜細(xì)胞緊密連接在一起，這表明生物膜細(xì)胞胞外基質(zhì)未受到破壞。經(jīng)US處理30 min后，金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞表面開(kāi)始出現(xiàn)褶皺，生物膜細(xì)胞的胞外基質(zhì)出現(xiàn)瓦解。而HT70處理30 min后細(xì)胞出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，細(xì)菌表面開(kāi)始出現(xiàn)凹陷，生物膜細(xì)胞的胞外基質(zhì)遭到破壞，變得稀疏。UH70處理30 min后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，游離細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞黏連在一起，生物膜細(xì)胞基質(zhì)受到嚴(yán)重破壞，生物膜變得更稀疏。

用CLSM觀察金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞，由圖3A2～D2、A4～D4可知，對(duì)照組金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，這表明所有細(xì)菌細(xì)胞都是活細(xì)胞。經(jīng)US處理30 min后，少量游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞被染成紅色，這表明US可造成少量細(xì)胞的通透性發(fā)生改變。經(jīng)HT70處理30 min后，游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞被染成紅色的比例明顯增加，這表明HT70可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性明顯增加。UH70處理30 min后，金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性急劇增加，被染成紅色的細(xì)胞比例明顯高于US和HT70處理組。

2.4 金黃色葡萄球菌生物膜胞外多糖含量

大寫(xiě)字母不同，表示組間差異顯著（P<0.05）。圖5～6同。

由圖4可知，對(duì)照組金黃色葡萄球菌生物膜胞外可溶性多糖含量與不溶性多糖含量分別為32.93、62.07 μg/mL。

經(jīng)US、HT70和UH70處理30 min后生物膜胞外可溶性多糖含量變?yōu)?6.90、18.60、13.61 μg/mL，不溶性多糖含量變?yōu)?5.90、27.26、21.04 μg/mL。與對(duì)照組相比，US、HT70和UH70處理均可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌生物膜胞外多糖含量顯著減少（P<0.05）。此外，UH處理比單獨(dú)的US和HT處理能夠更有效降低金黃色葡萄球菌生物膜胞外可溶性多糖與不溶性多糖含量。

2.5 胞外ATP、核酸、蛋白質(zhì)含量

由圖5A和圖5D可知，對(duì)照組的金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的胞外ATP含量分別為6.69、7.26 nmol/mL。經(jīng)US、HT50、HT60和HT70處理30 min后，游離細(xì)胞的胞外ATP含量分別約為44、135、252、284 nmol/mL，生物膜細(xì)胞的胞外ATP含量分別約為26、68、91、170 nmol/mL，這表明游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的胞外ATP含量隨著處理溫度的升高而顯著增加，且HT比US能更有效地破壞游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜（P<0.05）。此外，經(jīng)UH50、UH60和UH70處理30 min后，游離細(xì)胞的胞外ATP含量分別約為153、275、377 nmol/mL，生物膜細(xì)胞的胞外ATP含量分別約為75、110、201 nmol/mL。這表明與US和HT單獨(dú)處理相比，UH可以更有效地破壞游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜，引起胞內(nèi)ATP泄漏到胞外，從而導(dǎo)致胞外ATP含量顯著增加（P<0.05）。

核酸和蛋白質(zhì)分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處具有最大光密度。與對(duì)照組相比，所有處理組均可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的胞外核酸和蛋白質(zhì)含量顯著增加（P<0.05），但UH處理組的胞外核酸和蛋白質(zhì)含量顯著高于US和HT的單一處理組，這表明UH處理組與US和HT單一處理組相比，可對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。

2.6 金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞呼吸鏈脫氫酶活性

細(xì)菌呼吸鏈脫氫酶活性降低，意味著細(xì)菌的呼吸作用和代謝途徑受到抑制。由圖6可知，對(duì)照組金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞OD490 nm分別為0.463和0.422。經(jīng)US、HT50、HT60和UH70處理30 min后的游離細(xì)胞OD490 nm分別為0.375、0.355、0.274和0.145，生物膜細(xì)胞OD490 nm分別為0.371、0.309、0.188和0.128。此外，經(jīng)UH50、UH60和UH70處理30 min后的游離細(xì)胞OD490 nm分別為0.335、0.200和0.099，生物膜細(xì)胞OD490 nm分別為0.287、0.158和0.109。這表明，UH處理比US和HT單獨(dú)處理能夠更有效地降低金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的呼吸鏈脫氫酶活性。

3 討 論

US和HT聯(lián)合使用（UH）對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞具有協(xié)同殺菌作用。UH70能滅活金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞達(dá)到無(wú)法檢測(cè)的水平（≤1.4（1g（CFU/mL））），但單獨(dú)的US或HT70處理在任何時(shí)間都達(dá)不到相同的效果。此外，UH70可以在30 min內(nèi)滅活6.30（1g（CFU/mL））金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞，但HT70需要60 min才能達(dá)到同樣的效果。因此，UH不僅提高了滅菌效率，而且縮短了處理時(shí)間。值得注意的是，金黃色葡萄球菌生物膜細(xì)胞比游離細(xì)胞更難被滅活，這是因?yàn)榧?xì)菌聚集在一起，形成黏附因子，使得菌體細(xì)胞聚集在一起，從而增大滅菌的難度[20-21]。Bermúdez-Aguirre等[22]報(bào)道，US結(jié)合HT處理無(wú)害李斯特菌10 min的殺菌效果和單獨(dú)熱處理30 min的殺菌效果一樣。Zhu Jinyan等[23]報(bào)道，US聯(lián)合HT對(duì)大腸桿菌O157：H7的殺菌效果明顯優(yōu)于單獨(dú)的US或HT的殺菌效果。Li Jiao等[11]報(bào)道，US聯(lián)合55 ℃ HT具有明顯的協(xié)同殺菌作用，二者聯(lián)合處理的殺菌效果顯著高于單獨(dú)US和55 ℃ HT的殺菌效果。US和HT具有協(xié)同殺菌作用，這種協(xié)同殺菌作用的產(chǎn)生主要?dú)w因于二者單獨(dú)處理都會(huì)產(chǎn)生亞致死損傷細(xì)胞，當(dāng)二者聯(lián)用時(shí)，這部分亞致死損傷細(xì)胞會(huì)被HT迅速滅活，從而產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用[24]。

近年來(lái)，許多研究還報(bào)道了US和化學(xué)抑菌劑聯(lián)合使用具有明顯的協(xié)同殺菌作用。José等[25]報(bào)道，US與40 mg/L過(guò)氧乙酸聯(lián)合使用可以顯著滅活櫻桃和番茄上的鼠傷寒沙門(mén)氏菌，二者具有明顯的協(xié)同殺菌作用。Huu等[26]報(bào)道，低頻率的US和沒(méi)食子酸丙酯聯(lián)合處理可以顯著提高殺菌效率。He Qiao等[27]報(bào)道，US聯(lián)合百里香精油納米乳具有明顯的協(xié)同殺菌作用，二者聯(lián)合處理可顯著提高對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌作用。US和化學(xué)抑菌劑的結(jié)合具有明顯的協(xié)同殺菌作用，這種協(xié)同作用主要?dú)w因于US可以破壞菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而促進(jìn)抑菌劑更好滲入細(xì)胞，破壞菌體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[28]。

通過(guò)SEM圖像可以看出，UH可以嚴(yán)重破壞金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞完整性。此外，CLSM圖像顯示，UH處理后菌體細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性急劇增加，從而導(dǎo)致胞外ATP和核酸、蛋白質(zhì)含量顯著增加[29]。許愈等[13]報(bào)道，US聯(lián)合酸性電解水處理可嚴(yán)重破壞副溶血性弧菌的細(xì)胞膜完整性，造成細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)大量流出至胞外。Guo Liping等[12]報(bào)道，US與次氯酸鈉聯(lián)合使用可導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)K+外泄，并損壞大腸桿菌的細(xì)胞膜。Guo Mingming等[17]報(bào)道，US聯(lián)合百里香精油納米乳可以嚴(yán)重破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜，造成胞內(nèi)蛋白和核酸外泄。此外，UH顯著降低金黃色葡萄球菌生物膜胞外多糖含量，破壞生物膜的胞外基質(zhì)。生物膜胞外基質(zhì)一旦受到破壞，生物膜結(jié)構(gòu)會(huì)迅速瓦解，加快菌體的死亡。Liu Fang等[16]報(bào)道，苯乳酸與微酸電解水的結(jié)合比單一處理能夠更有效破壞生物膜的胞外基質(zhì)，降低生物膜胞外多糖含量，導(dǎo)致菌體死亡。上述結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞膜的通透性和完整性受到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ATP、核酸和蛋白質(zhì)就會(huì)釋放出來(lái)。盡管單一的US處理不足以使細(xì)菌細(xì)胞失活，但US能夠破壞菌體的細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致化學(xué)抑菌劑或熱處理能夠更好地滅活細(xì)胞。

4 結(jié) 論

UH處理能有效增強(qiáng)對(duì)金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的殺菌效果，具有明顯的協(xié)同殺菌作用。此外，SEM圖像顯示，UH處理嚴(yán)重破壞了金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞膜的完整性。CLSM圖像顯示，UH處理能夠顯著提高金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)外泄，呼吸鏈脫氫酶活性降低。因此，US與HT的結(jié)合主要通過(guò)破壞金黃色葡萄球菌游離細(xì)胞和生物膜細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，引起細(xì)胞膜通透性改變，造成ATP、核酸、蛋白質(zhì)外泄，降低細(xì)菌呼吸鏈脫氫酶活性，來(lái)達(dá)到協(xié)同殺菌的目的。

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收稿日期：2021-08-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31871866）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX（21）2016）;

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-41）;江蘇省蘇北科技專項(xiàng)（XZ-SZ202013）

第一作者簡(jiǎn)介：孫晉躍（1995—）（ORCID： 0000-0003-0074-1370），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾笄莓a(chǎn)品質(zhì)量安全。

E-mail： 2055163428@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：劉芳（1982—）（ORCID： 0000-0002-2302-027X），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樾笄莓a(chǎn)品質(zhì)量安全。

E-mail： fangliu82@163.com