超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中勃地龍殘留量的不確定度評(píng)定

趙盼 馬俊美 郭麗敏

摘 要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定雞肉中勃地龍的不確定度評(píng)價(jià)方法，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在建立不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上，尋找檢測(cè)過(guò)程中各不確定度分量，用統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)各分量進(jìn)行評(píng)定，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，根據(jù)概率分布計(jì)算擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明：校準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)最大;當(dāng)雞肉中勃地龍殘留量為7.425 μg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.754 μg/kg（k=2）。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;雞肉;勃地龍;不確定度

Uncertainty Evaluation for the Determination of Boldenone Residues in Chicken by Ultra-High Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin*

（Hebei Food Inspection and Research Institute， Hebei Food Safety Key Laboratory， Shijiazhuang 050227， China）

Abstract： In order to improve the accuracy of the detection of boldenone in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， a method for uncertainty evaluation was established. Based on the established mathematical model for uncertainty evaluation， the uncertainty components arising from the analytical process were determined and evaluated by statistical analysis. The standard uncertainty was synthesized， and the extended uncertainty was calculated according to the probability distribution. It was found that calibration curve fitting and standard solution preparation made the greatest contribution to the uncertainty. When the boldenone residue in chicken was 7.425 μg/kg，

the expanded uncertainty was 0.754 μg/kg （k = 2）.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; boldenone; uncertainty

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125

中圖分類號(hào)：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）10-0048-06

引文格式：

趙盼， 馬俊美， 郭麗敏. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中勃地龍殘留量的不確定度評(píng)定[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHAO Pan， MA Junmei， GUO Limin. Uncertainty evaluation for the determination of boldenone residues in chicken by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-125.? ? http：//www.rlyj.net.cn

興奮劑是國(guó)際奧委會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)員禁用藥物的統(tǒng)稱，使用興奮劑會(huì)對(duì)人體身心造成嚴(yán)重的危害。目前國(guó)際奧委會(huì)將興奮劑分為7 大類，其中合成類固醇又稱蛋白同化激素、通化激素等，是目前使用最廣的一類興奮劑。它們能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，有利于蛋白質(zhì)沉積，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中使用較為廣泛。但食用含有合成類固醇激素殘留的動(dòng)物食品會(huì)危害人類身體健康，因此，世界各國(guó)對(duì)合成類固醇激素采取禁用或限用，我國(guó)在動(dòng)物食品抽檢中多次檢出類固醇激素殘留，影響我國(guó)該類食品的出口。勃地龍又叫勃地酮、寶丹酮或去氫睪酮，分子式為C19H26O2，是合成類固醇激素的一種。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)發(fā)布《2018年禁用清單國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)》，該清單明確規(guī)定勃地龍為禁用物質(zhì)。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)動(dòng)物源性食品中勃地龍殘留量具有重要意義[1-3]。

在檢測(cè)分析中，由于受檢測(cè)儀器、檢測(cè)方法及實(shí)驗(yàn)誤差的影響，檢測(cè)值往往偏離真實(shí)值。如何判定檢測(cè)結(jié)果真實(shí)有效，不確定度是一個(gè)重要的參考指標(biāo)。對(duì)檢測(cè)過(guò)程中可能存在的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)可提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，避免因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的完善性及實(shí)驗(yàn)人員操作的準(zhǔn)確性不足對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，從而得到更加真實(shí)客觀的檢測(cè)結(jié)果[4-5]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定雞肉中勃地龍的不確定度，通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)中的不確定度來(lái)源，對(duì)各因素進(jìn)行評(píng)定和合成，最后計(jì)算出測(cè)量值的擴(kuò)展不確定度[6-7]，為雞肉中勃地龍檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果評(píng)定提供一定的指導(dǎo)，同時(shí)為測(cè)量其他激素殘留量的不確定度評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉基質(zhì)購(gòu)自石家莊市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

勃地龍（純度≥98%）、睪丸酮-D3（100 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 6500 UPLC-MS/MS（配有電噴霧離子源）、Analyst?（Version 1.6）、MultiQuant（Version 2.1）軟件 美國(guó)Sciex公司;PL203/ME204E電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司;P300H超聲波清

洗器 德國(guó)Elma公司;Vortex Genius 3旋渦混合器 德國(guó)

IKA公司;有機(jī)尼龍微孔濾膜（0.22 μm） 天津艾杰爾公司;ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取1.0 mg勃地龍標(biāo)準(zhǔn)品于10.0 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，配制成10 μg/mL中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取100 μg/mL睪丸酮-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL到5.0 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

用移液槍分別吸取10、20、50、100、200、1 000 μL中間標(biāo)準(zhǔn)溶液到100.0 mL容量瓶?jī)?nèi)，再分別加入100 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈-水（1∶1，V/V）定容，配制成1、2、5、10、20、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)工作液質(zhì)量濃度均為10.00 ng/mL，上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 樣品前處理

提?。悍Q?。?.00±0.05）g試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液2 μL，加入碳酸鈉溶液3 mL和叔丁基甲醚25 mL，均質(zhì)30 s，振蕩10 min，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，將離心殘?jiān)?5 mL叔丁基甲醚重復(fù)再提取1次，合并上清液。

凈化：將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL梨形瓶，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用2.0 mL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）溶解殘余物，漩渦混勻后，溶液冷凍30 min，16 000 r/min離心5 min，取適量溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，供上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 檢測(cè)條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液;流動(dòng)相B：乙腈;梯度洗脫;流速0.25 mL/min;進(jìn)樣量1.0 μL;柱溫30 ℃。洗脫程序：0～1.00 min、20% B，1.00～3.00 min、20%～90% B，3.0～4.5 min、90% B，4.51～6.00 min、20% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式，毛細(xì)管電壓5 500 V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，離子源溫度550 ℃，氣簾氣壓力25 psi，輔助加熱氣壓力（GS1）50 psi，輔助加熱氣壓力（GS2）50 psi。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型建立

按照農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，樣品中勃地龍殘留量按下式計(jì)算。

式中：X為樣品中勃地龍殘留量/（μg/kg）;ρ為通過(guò)峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中計(jì)算出的上機(jī)樣液中檢測(cè)物質(zhì)量濃度/（ng/mL）;V為上機(jī)樣液最終定容體積/mL;m為試樣質(zhì)量/g;n為樣品制備過(guò)程中的稀釋因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，對(duì)影響勃地龍檢測(cè)結(jié)果的各不確定度分量來(lái)源進(jìn)行評(píng)估，不確定度的來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、校準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品提取、凈化過(guò)程、樣品定容、樣品重復(fù)性檢測(cè)、儀器設(shè)備等[8-9]，詳見(jiàn)圖1。

圖 1 UPLC-MS-MS 檢測(cè)勃地龍過(guò)程中的不確定度來(lái)源

Fig. 1 Uncertainty sources in the determination of boldenone by UPLC-MS-MS

2.2 不確定度評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（C）

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的不確定度u（C1）、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量產(chǎn)生的不確定度u（C2）、標(biāo)準(zhǔn)溶液移取產(chǎn)生的不確定度u（C3）和標(biāo)準(zhǔn)溶液定容產(chǎn)生的不確定度u（C4）[8]。

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的不確定度u（C1）

勃地龍標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.8%，擴(kuò)展不確定度為1%，包含因子k=2（證書(shū)給出），取正態(tài)分布[10-12]，由勃地龍標(biāo)準(zhǔn)品純度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

睪丸酮-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，擴(kuò)展不確定度為3%，包含因子k=2（證書(shū)給出），取正態(tài)分布，由睪丸酮-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

綜上，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量產(chǎn)生的不確定度u（C2）

用十萬(wàn)分之一電子天平稱取1.00 mg勃地龍標(biāo)準(zhǔn)品，該天平檢定證書(shū)給出示值誤差的檢定結(jié)果為-0.02 mg，取均勻分布[13-15]，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液移取產(chǎn)生的不確定度u（C3）

使用移液器吸取儲(chǔ)備液和中間液，檢定證書(shū)給出相應(yīng)的容量相對(duì)誤差[16]，取均勻分布[17-19]，標(biāo)準(zhǔn)溶液移取產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。（V1、V2均為移取液體體積）標(biāo)準(zhǔn)溶液移取過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度見(jiàn)表1。

標(biāo)準(zhǔn)溶液移取產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液定容產(chǎn)生的不確定度u（C4）

標(biāo)準(zhǔn)溶液定容產(chǎn)生的不確定度有容量瓶容量允差產(chǎn)生的不確定度u（C容量瓶）和甲醇、乙腈-水（1∶1，V/V）定容液體積膨脹產(chǎn)生的不確定度u（C體積膨脹）[20-22]。

容量瓶（A級(jí)）經(jīng)計(jì)量檢定合格，容量允差按照J(rèn)JG 196—2006《玻璃儀器檢定規(guī)程》[23]執(zhí)行，服從三角分配[8，24]，溫度差忽略不計(jì)，由容量瓶容量允差產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（表2），其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

本實(shí)驗(yàn)在21.8 ℃環(huán)境下操作，勃地龍儲(chǔ)備液和中間液分別用甲醇定容至10 mL、內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用甲醇定容至5 mL，工作液均用乙腈-水（1∶1，V/V）定容至100 mL，甲醇體積膨脹系數(shù)為β甲醇=1.1×10-3，乙腈體積膨脹系數(shù)β乙腈=1.37×10-3，水體積膨脹系數(shù)β水=2.1×10-3，服從均勻分布，溫度差ΔT為1.8 ℃，根據(jù)公式，計(jì)算得甲醇體積膨脹產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（C甲醇體積膨脹）≈0.001 14，乙腈-水體積膨脹產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（C乙腈-水體積膨脹）≈0.001 80。定容液體積膨脹產(chǎn)生的不確定度為

標(biāo)準(zhǔn)溶液定容產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度。

2.2.2 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度urel（m）

樣品稱量使用百分之一電子天平，該檢定證書(shū)給出示值誤差的檢定結(jié)果為0.01 g，取均勻分布，稱樣量為（5.00±0.05）g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.3 樣品定容產(chǎn)生的不確定度urel（V）

樣品定容體積為2 mL，使用1 000 μL移液槍移取2 次，1 000 μL移液槍移取1 000 μL溶液容量相對(duì)誤差為0.4%，服從均勻分布，計(jì)算方法同2.2.1.3節(jié)，樣品定容產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.4 校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度urel（A0）

用乙腈-水溶液（1∶1，V/V）將勃地龍中間液分別配制成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時(shí)分別加入0.1 mL 10 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液，按指定方法條件進(jìn)行測(cè)試，以待測(cè)物溶液質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，建立工作曲線[10，18，25]，線性范圍為1～100 ng/mL，采用最小二乘法擬合得到線性回歸方程

Y=bX+a，斜率b=0.191 81，截距a=0.034 69，相關(guān)系數(shù)r=0.999 26。

對(duì)陰性雞肉樣品加標(biāo)后分別測(cè)定6 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度，其中。

式中：SR表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)殘差;n表示對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)（n=6），f表示對(duì)樣品的測(cè)定次數(shù)（f=6）;0表示檢測(cè)樣品溶液質(zhì)量濃度除以內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的平均值;表示標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各質(zhì)量濃度除以內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的平均值;c0表示檢測(cè)樣品質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的比值;Yi表示標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各質(zhì)量濃度點(diǎn)檢測(cè)的實(shí)際峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，ci表示標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度的比值。

經(jīng)計(jì)算得SR≈0.022 1，u（A0）≈0.081 5，則校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.5 樣品重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度urel（x）

稱取陰性雞肉樣品6 份，每份質(zhì)量（5.00±0.05）g，分別添加400 μL 100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，即加標(biāo)水平為8 μg/kg，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。重復(fù)性檢測(cè)引入的測(cè)量不確定度屬于A類不確定度[26-27]，將平均測(cè)定值代入貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差≈0.114（其中，n表示測(cè)定次數(shù)，n=6），則樣品重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度（n=6），其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.6 樣品提取、凈化過(guò)程產(chǎn)生的不確定度urel（R）

目標(biāo)化合物不能從基質(zhì)中完全提取，在提取、凈化過(guò)程中損失造成的不確定度，用加標(biāo)回收率方法進(jìn)行計(jì)算[28-29]，加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表4。將平均回收率代入貝塞爾公式計(jì)算得6 次檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S（R）≈0.014 2，則樣品提取、凈化過(guò)程產(chǎn)生的不確定度，。

計(jì)算t值對(duì)回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，，將t值與95%置信度、（n-1）自由度下的雙側(cè)臨界值t0.05/5進(jìn)行比較，查檢驗(yàn)表t0.05/5=2.571，t>t0.05/5，表明回收率與100%具有顯著性差異，需采用回收率校正因子對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行修正。

2.2.7 UPLC-MS/MS產(chǎn)生的不確定度urel（fQ）

該設(shè)備校準(zhǔn)證書(shū)給出其不確定度u=0.6%，k=2，則。

2.2.8 擴(kuò)展不確定度和結(jié)果表示

根據(jù)上述各相對(duì)不確定度分量數(shù)值計(jì)算相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（y）和合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u，取95%置信度，包含因子k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U。

3 結(jié) 論

通過(guò)分析雞肉中勃地龍殘留量的不確定度，得出當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為7.425 μg/kg時(shí)，在95%置信區(qū)間內(nèi)，其擴(kuò)展不確定度為0.754 μg/kg。各不確定度分量中，影響較大的有校準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，其影響大小依次為urel（A0）>urel（C）>urel（x）/urel（R）>urel（V）>urel（fQ）>urel（m），在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和移液器移取引入的不確定度最大。因此，建議在檢測(cè)時(shí)增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)次數(shù)，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確可靠，盡量選擇不確定度小的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、容量誤差小的移液器、誤差小的電子天平等設(shè)備，提高檢測(cè)人員的技術(shù)水平和儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性，以減小測(cè)量不確定度，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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收稿日期：2021-05-11

基金項(xiàng)目：河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020ZD08）

第一作者簡(jiǎn)介：趙盼（1983—）（ORCID： 0000-0001-6883-3058），女，工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。

E-mail： zhaopanhb@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：郭麗敏（1970—）（ORCID： 0000-0003-2191-9916），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。E-mail： guolimin0311@163.com