黑龍江和云南葡萄產(chǎn)區(qū)灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性檢測

賈爽爽　黃曉慶　孔繁芳等

中圖分類號：S 481.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020248

由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的葡萄灰霉病不僅是葡萄生產(chǎn)中的常見病害，更是產(chǎn)后貯藏期的毀滅性病害，嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和質(zhì)量，對葡萄產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上用于防治該病害的殺菌劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、煙酰胺類、苯氨基嘧啶類等。葡萄灰霉病菌產(chǎn)孢量大、易變異，適應(yīng)性強(qiáng)，隨著殺菌劑的頻繁、大量使用，該病菌已對多種殺菌劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性。

多菌靈屬于苯并咪唑類內(nèi)吸性殺菌劑，作用于真菌β-微管蛋白，抑制孢子芽管分隔和菌絲生長。該殺菌劑自20世紀(jì)60年代問世以來被廣泛用于灰霉病的防治，但其作用位點(diǎn)單一，具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn)。隨著該藥劑的頻繁使用，灰霉病菌已對其產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性。日本、巴西、希臘以及我國多個(gè)地區(qū)的番茄及草莓上的灰霉病菌均出現(xiàn)了大量抗性菌株。大量研究表明，灰葡萄孢對多菌靈的抗性主要與其靶標(biāo)基因β-tubulin上的E198A、E198V、E198K、E198G或F200Y突變有關(guān)，各個(gè)國家或地區(qū)檢測出的抗性突變類型和比例存在不同，但總體上以E198A和E198V兩種抗性突變類型為主。

異菌脲屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，該殺菌劑可以激活絲狀真菌中參與調(diào)控菌株對滲透壓敏感性的雙組分組氨酸激酶信號途徑（TCHK信號途徑）。研究表明，該途徑中的組氨酸激酶OSI元件為二甲酰亞胺類殺菌劑的作用靶標(biāo)。二甲酰亞胺類殺菌劑的作用位點(diǎn)較多，可使灰霉病菌菌絲和芽管生長受阻，畸形或漲破，從而起到抑制病原菌的作用。隨著異菌脲的不斷重復(fù)使用，灰霉病菌對該殺菌劑逐漸產(chǎn)生了抗藥性。美國灰霉病菌的異菌脲抗性頻率從2014年的20. 05%上升至2015年的62%。我國很多地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了大量抗異菌脲灰霉菌株，例如，2006年浙江、江蘇、山東和遼寧4省的蔬菜灰霉病菌對異菌脲的平均抗性頻率為20%左右;2012年江蘇草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率達(dá)到64.6%;北京市草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率由2013年的40.4%上升至2014年的45. 3%，且不同采樣點(diǎn)的抗性頻率存在明顯的不同。隨著對灰霉病菌異菌脲抗性機(jī)理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)灰霉病菌對異菌脲的抗性主要與Bos1基因的I365S、I365N、I365R、Q369P、V368F+Q369H、Q369P+N373S和N373S突變有關(guān)。

上述灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性報(bào)道主要集中在蔬菜及草莓病害上，目前葡萄灰霉病菌相關(guān)抗藥性研究較少。2019年，鄭媛萍等發(fā)現(xiàn)山東蓬萊地區(qū)的葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率均高達(dá)90%以上。黑龍江省哈爾濱市和云南省賓川縣是我國的主要葡萄產(chǎn)區(qū)，多菌靈和異菌脲在這兩個(gè)地區(qū)已使用多年，明確該地區(qū)葡萄灰霉病菌對這兩種殺菌劑的抗性頻率及抗性突變類型，為進(jìn)一步建立針對這兩種藥劑抗性的快速分子檢測技術(shù)及指導(dǎo)當(dāng)?shù)仄咸鸦颐共〉挠行Х揽氐於ɡ碚摶A(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株的采集、分離純化和保存

2017年從黑龍江省哈爾濱市和云南省賓川縣葡萄主要種植區(qū)采集葡萄灰霉病果裝入自封袋并用冰袋降溫帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室對病樣進(jìn)行分離培養(yǎng)，產(chǎn)孢后使用接種環(huán)蘸取少量孢子劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，1d后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，兩個(gè)地區(qū)共分離純化得到葡萄灰霉病菌77株，其中采集自黑龍江省哈爾濱市的菌株共39株，采集自云南省賓川縣的菌株共38株，將培養(yǎng)好的菌株打取直徑為5mm的菌餅置于40%甘油中于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試藥劑與培養(yǎng)基

98%多菌靈原藥和98.4%異菌脲原藥均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥應(yīng)用工藝學(xué)研究組提供。多菌靈溶于0.1mol/L的鹽酸溶液中，配制成5 mg/mL的母液;異菌脲溶于100%的甲醇，配制成10 mg/mL的母液。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：土豆去皮洗凈切成約1cm³的小塊，準(zhǔn)確稱取200g，加入1LddH₂O煮至熟透，過濾后定容至1L，加入20g葡萄糖和20 g瓊脂粉，加熱并攪拌至完全溶解，用錐形瓶分裝后121℃高壓滅菌20 min。

1.3葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率測定

測定葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率，其中多菌靈的鑒別濃度為10μg/mL，異菌脲的鑒別濃度為5μg/mL。在培養(yǎng)2d的菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅，接種于含藥和對照PDA平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次。22℃培養(yǎng)箱L∥D=12 h∥12 h光暗交替培養(yǎng)2d后，觀察并記錄菌株生長情況。分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)地區(qū)葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率?？剐灶l率一抗性菌株數(shù)/所測菌株總數(shù)×100%。

1.4 β-tubulin基因和Bos1基因序列測定

使用E-Z96真菌基因組DNA提取試劑盒（D3390-02）（OMEGA）提取供試菌株的基因組DNA。使用引物TubA F/R： CGCGAGGAGTTCCCAGAACG/GACGGCGGAAACCAAGTGG和Bos1F/R： AGCCCAGGGTGAGATACTCC/TTTGCGAC-AGCTGTTGTGAC分別擴(kuò)增上述菌株的β-tubulin和Bos1基因。引物由上海生工生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為40μL，包括14μL ddH₂O、20μL2×Taq Mix，上下游引物各2μL，DNA模板2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，56℃C退火30 s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測序結(jié)果使用ge-neous軟件進(jìn)行整理和分析。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率

黑龍江省的39株葡萄灰霉病菌均對多菌靈產(chǎn)生抗性，抗性頻率為100. 0%，有20株對異菌脲產(chǎn)生抗性，抗性頻率為51. 3%，對多菌靈和異菌脲的多藥抗性頻率為51. 3%。云南省的38株葡萄灰霉病菌中有37株對多菌靈和異菌脲均產(chǎn)生了抗性，抗性頻率均為97.4%（表1）。

2.2葡萄灰霉病菌對多菌靈的抗性突變

對供試菌株的測序結(jié)果表明，所有多菌靈敏感菌株均未檢測到β-tubulin基因上的突變，在所有多菌靈抗性菌株中均檢測到了E19 8A或E19 8V突變。兩個(gè)地區(qū)的多菌靈抗性突變類型分布不同。在黑龍江省的39株多菌靈抗性菌株中，E19 8A突變株有35株，占比為89. 7%，E19 8V突變株有4株，占比為10. 3%。云南省的37株多菌靈抗性菌株中，E198A突變株有18株，占比為48. 6%，E198V突變株有19株，占比為51.4%（圖1）。

2.3葡萄灰霉病菌對異菌脲的抗性突變

對供試菌株的測序結(jié)果表明，所有異菌脲敏感菌株均未檢測到Bos1基因上的突變，在所有異菌脲抗性菌株中均檢測到了I365N、I365S、Q369P+N373S或Q369P突變。兩個(gè)地區(qū)的異菌脲抗性突變類型分布不同。20株采自黑龍江省哈爾濱市異菌脲抗性菌株中，共有I365N、I365S、Q369P+N373S和Q369P 4種突變類型，占比分別為45. 0%、20. 0%、30.0%和5.0%。云南省賓川縣的37株異菌脲抗性菌株只有I365N、I365S和Q369P+N373S 3種抗性突變，占比分別為10. 8%、59.5%和29. 7%（圖2）。

3結(jié)論與討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國內(nèi)外灰霉病菌已對多菌靈產(chǎn)生較普遍的抗藥性。1987年我國就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該病菌對多菌靈具有高度耐藥性，且隨著多菌靈的頻繁使用，抗性頻率逐漸上升。2012年—2013年湖北省草莓灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率為49.32%。2013年2014年長三角地區(qū)果蔬灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率為70.48%。2015年山西省灰葡萄孢對多菌靈的抗性頻率為90.32%。國外也對灰葡萄孢的多菌靈抗性進(jìn)行了諸多報(bào)道。2008年—2009年希臘灰葡萄孢對多菌靈的抗性頻率為60. 5%。本研究結(jié)果表明，黑龍江省和云南省的葡萄灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率分別到達(dá)100. 0%和97.4%，表明多菌靈對這兩個(gè)地區(qū)的葡萄灰霉病菌幾乎喪失防效。鑒于對多菌靈抗的抗藥性可穩(wěn)定遺傳，建議生產(chǎn)上停止多菌靈的使用，改用其他作用機(jī)制不同于多菌靈且抑菌效果好的殺菌劑。

二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲也是生產(chǎn)上防治灰霉病的常用殺菌劑，自20世紀(jì)70年代開始使用，到目前為止多地區(qū)的多種作物上的灰霉病菌均對該殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性。國外的異菌脲抗性灰霉病菌發(fā)現(xiàn)的較早，在1986年英國的灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率就已經(jīng)達(dá)到45.3%。美國灰霉病菌的異菌脲抗性頻率從2014年的20.05%上升至2015年的62%。我國很多地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了大量抗異菌脲灰霉病菌株。本研究結(jié)果中黑龍江省和云南省的葡萄灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率分別達(dá)到51.3%和97.4%，表明上述兩個(gè)地區(qū)的葡萄灰霉病菌對異菌脲抗性頻率較高，尤其是在云南賓川縣，該藥劑幾乎失去防效。據(jù)報(bào)道，灰霉病菌對異菌脲的抗性并不穩(wěn)定，持久性弱，它可以產(chǎn)生對異菌脲敏感的孢子，使得菌株對異菌脲再次敏感。所以，建議暫停異菌脲的使用或與其他作用機(jī)制不同的殺菌劑交替使用，以便使葡萄灰霉病菌恢復(fù)對異菌脲的敏感性，延長異菌脲的使用壽命。

對多菌靈和異菌脲的多藥抗性研究結(jié)果表明，黑龍江省的葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的多藥抗性頻率達(dá)到了較高的水平，為51.3%。云南省的多藥抗性頻率更高，達(dá)到了97.4%，幾乎所有的葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲均具有抗性。因此，建議生產(chǎn)上兩省葡萄產(chǎn)區(qū)避免多菌靈和異菌脲同時(shí)使用。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江省和云南省葡萄灰霉病菌的多菌靈抗性突變僅發(fā)生在β-tubulin基因的第198位上，有E198A和E198V兩種類型，未檢測到其他突變。并且E19 8A和E19 8V抗性突變在這兩個(gè)地區(qū)的分布存在明顯差異，其中，黑龍江省的大部分多菌靈抗性菌株為E198A突變（89.7%），而云南省這兩種突變類型所占的比例相似，推測這可能與南、北地區(qū)的氣候差異導(dǎo)致不同突變類型菌株的適合度不同有關(guān)。Bos-1基因上與灰霉病菌對異菌脲的抗性有關(guān)的突變較多，其中I365N和I365S出現(xiàn)的頻率相對較高，并且不同地區(qū)檢測到的抗性突變類型存在差異。而黑龍江省哈爾濱市葡萄灰霉病菌對異菌脲的抗性突變有I365N、I365S、Q369P+N373S和Q369P 4種類型，云南省賓川縣有I365N、1365S和Q369P+N373S 3種。兩個(gè)地區(qū)不同抗性突變類型的分布存在差異，其中黑龍江省I365N突變類型所占的比例最大，達(dá)到45%;而云南省賓川縣的抗性突變類型主要為I365S（59.5%）。

綜上所述，黑龍江省和云南省的葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性頻率均很高。其中，多菌靈的藥效基本喪失，建議生產(chǎn)上立即停止使用;而對異菌脲，建議暫?；蛘吲c其他藥劑交替使用。這兩個(gè)地區(qū)多菌靈抗性菌株β-tubulin基因存在E198A和E198V兩種突變類型;引起異菌脲的抗性突變主要有I365N/S和Q369P 3種，可依據(jù)上述靶標(biāo)突變位點(diǎn)建立相應(yīng)的抗藥性快速分子檢測技術(shù)，為更大范圍內(nèi)進(jìn)行葡萄灰霉病菌對多菌靈和異菌脲抗性的檢測或監(jiān)測以及病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。