上海市草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺敏感性檢測及抗性分子機(jī)制

高萍　高士剛　成瑋等

中圖分類號：S 481.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2020555

由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的灰霉病是一種難以防治的世界性的重要病害，可危害觀賞植物、蔬菜、水果（例如草莓）等230余種作物?；颐共【晌：χ参锕麑?shí)、葉片、莖葉和花等，該菌具有寄主范圍廣、產(chǎn)孢量大、遺傳變異頻繁、傳播能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以非常難防治，且極易產(chǎn)生抗藥性。草莓灰霉病主要發(fā)生在采果期，采后果實(shí)常迅速腐爛，造成非常嚴(yán)重的損失。

氟吡菌酰胺是由德國拜耳公司研發(fā)的一種琥珀酸脫氫酶抑制劑類（succinate dehydrogenase inhibi-tors，SDHIs）殺菌劑，2012年在我國獲得登記。氟吡菌酰胺具有高效、廣譜和持效久等特性，常用于防治霜霉病、灰霉病、白粉病和菌核病等。其通過抑制病原菌內(nèi)呼吸鏈中琥珀酸脫氫酶活性，阻礙線粒體呼吸作用，從而抑制病原菌孢子萌發(fā)、菌絲體生長，進(jìn)而控制病害發(fā)展。

上海市屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，極適宜草莓灰霉病的發(fā)生，國內(nèi)常用的酰胺類殺菌劑有啶酰菌胺，許多地區(qū)均已出現(xiàn)田間自然發(fā)生的灰霉病菌對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的報(bào)道，但關(guān)于草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的抗性研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過氟吡菌酰胺對上海5個(gè)區(qū)的草莓灰霉病的抗藥性檢測，建立敏感性基線，研究抗性分子機(jī)制以及了解抗性分布，為未來氟吡菌酰胺的合理使用提供數(shù)據(jù)支持，為推動(dòng)農(nóng)藥減量提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

于2019年1月—3月，從上海市5個(gè)地區(qū)（崇明區(qū)、嘉定區(qū)、青浦區(qū)、奉賢區(qū)及浦東新區(qū)）的草莓生產(chǎn)基地，隨機(jī)采集已感染發(fā)病的灰霉病病果，參考劉欣等的方法進(jìn)行單孢分離、鑒定和保存，來源于同一病果的病菌保留1株，共獲得90株單孢灰葡萄孢菌株。將所有菌株轉(zhuǎn)接至PDA試管斜面，編號（地點(diǎn)縮寫+序號），保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2藥劑、試劑與培養(yǎng)基

98. 8%氟吡菌酰胺原藥，南通泰禾化工股份有限公司提供（自制）;丙酮，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，用于菌株培養(yǎng)以及毒力測定;PCR EasyTaq Super Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖，上海翊圣生物科技有限公司。

1.3菌絲生長抑制試驗(yàn)

采用菌絲生長速率法進(jìn)行測定。氟吡菌酰胺原藥用丙酮溶解，配成10000 μg/mL的母液，設(shè)置鑒別濃度分別為0、0. 25、0.5、1、2、4、8、16、32、64μg/mL及128μg/mL。將待測菌株接入PDA平板活化，于（25±1）℃黑暗培養(yǎng)72 h后，在菌落邊緣打取直徑為7mm的菌餅，接種到上述系列濃度的含藥平板中央，以加入等量丙酮平板為對照，每處理重復(fù)3次，（25±1）℃黑暗倒置培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法測量菌落直徑。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-7）×100%;

抗性水平（RF）=菌株EC₅₀/敏感基線EC₅₀。

1.4琥珀酸脫氫酶基因序列測定及比對

菌株菌絲DNA的提取采用改良的CTAB法。根據(jù)灰葡萄孢琥珀酸脫氫酶基因（Sdh，A，Sdh，B，Sdh，C與Sdh， D）序列，采用劉欣等的4對引物：SdhA-F：ATTTGGAAACGCCCTTGGAC，SdhAR：CATTACCGAACAATCCCGCA;SdhBF：ACCTACTCGCCCTATCCAAT，SdhBR：AGACTTAGCAATAACCGCCC;SdhCF：GCCAGATTTCCTTAGTCAG，SdhCR：GCTGGACTCTGAATGTGAT;SdhDF：AGCCAATCAAATCCGTTCCG，SdhDR：CAAACTCCTCCCTGCCCTCT，對全部菌株的4條亞基編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 體系為20μL：包含2×PCR Easy犜犪狇Super Mix10μL、上下游引物各0.5μL（10 μmol/L）、DNA 模板20ng，最后用ddH2O補(bǔ)足。PCR程序：95℃預(yù)變性3min;95℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，32個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。

取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)對膠片進(jìn)行拍照記錄，有條帶PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）公司進(jìn)行測序。

1.5數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel軟件計(jì)算藥劑對菌絲生長的抑制率、有效抑制中濃度ECso值;利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用該軟件描述統(tǒng)計(jì)模塊進(jìn)行Shapiro-Wilk法（W）法正態(tài)性檢驗(yàn)，P>0. 05則符合正態(tài)分布，反之則為非正態(tài)分布;最后根據(jù)整個(gè)測定種群的ECso分布加以分析，繪制頻率分布直方圖及正態(tài)分布曲線。測序結(jié)果使用DNAMAN軟件對敏感及抗性菌株的SDH亞基序列進(jìn)行比對分析，并以NCBI網(wǎng)站（https：∥www. ncbi.nlm. nih. gov）數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列作為參考。參考GenBank基因登記號：KR705916.1（BcSdhA）、KR866382.1（BcSdhB）、KR705923.1（BcSdhC）和KR705930.1（BcSdhD）。

2結(jié)果與分析

2.1草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的敏感性基線

在上海市5個(gè)地區(qū)，共采集并成功分離到90個(gè)草莓灰霉病菌菌株。敏感性測定結(jié)果顯示：氟吡菌酰胺對90個(gè)菌株的ECs。介于0.09～75.91μg/mL，表明上海不同地區(qū)之間草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的敏感性差異較大。經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：EC₅₀頻次分布W=0.49，P<0.001，呈非連續(xù)性分布（圖1），表明不同菌株對氟吡菌酰胺的敏感性出現(xiàn)了分化，已出現(xiàn)敏感性降低的亞群體甚至抗性菌株。其中，22株菌株的EC₅₀≥6.54μg/mL，呈非連續(xù)性分布（圖1）;其余68株菌株的ECo介于0.09～4. 80μg/mL，呈連續(xù)性正態(tài)分布，其W=0.97，P=0. 054>0.05（圖2）。該68株菌株平均ECso為（1. 68±0.91）μg/mL，呈現(xiàn)一個(gè)連續(xù)單峰曲線，符合正態(tài)分布，故可作為敏感性基線參考值。

2.2菌株序列對比分析

對全部90株菌株進(jìn)行Sdh A，Sdh B，Sdh.C與Sdh D基因測序。結(jié)果顯示：全部菌株的Sdh A、Sdh C與Sdh D 3個(gè)基因均未發(fā)生突變（結(jié)果未展示）;Sdh B基因：41株菌株未發(fā)生突變，49株菌發(fā)生突。41株未突變的EG₅₀范圍為0. 26～3. 24μg/mL，27株272位組氨酸突變?yōu)榫彼幔–AC突變?yōu)镃GC，H272R），菌株EC₅₀范圍為0.09～4.80μg/mL，與未突變菌株的EC₅₀值存在交叉;14株230位天冬酰胺突變?yōu)楫惲涟彼幔ˋAC突變?yōu)锳TC，N2301），菌株EC₅₀范圍為6. 54～16. 45μg/mL，8株225位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼幔–CC突變?yōu)門TC，P225F），菌株EC₅₀范圍為22. 98～75. 91μg/mL（表1）。

2.3上海地區(qū)草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的抗性水平

參照表1的菌株突變類型、ECso和抗性水平范圍，定義敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)：RF<3為敏感（S）;3≤RF<10為低抗菌株（LR）;10≤RF<50為中抗菌株（MR）;RF≥50為高抗菌株（HG）。根據(jù)上述劃分標(biāo)準(zhǔn)，灰霉病菌Sdh B亞基未發(fā)生突變和272位突變的菌株屬于敏感菌株;230位突變的菌株屬于低抗菌株，225位突變的菌株屬于中抗菌株（表1）。上海地區(qū)灰霉病菌菌株對氟吡菌酰胺的敏感性檢測結(jié)果（表2）顯示，全市抗性菌株頻率24.44%，不同地區(qū)菌株的抗性頻率差異較大，奉賢區(qū)抗性菌株頻率最高，為77. 27%，浦東新區(qū)和嘉定區(qū)分別為25. 00%和4.76%，崇明區(qū)和青浦區(qū)未檢測到抗性菌株，抗性頻率均為0。不同地區(qū)菌株對氟吡菌酰胺的敏感性差異較大，奉賢區(qū)菌株出現(xiàn)最大ECo為75. 91μg/mL，而青浦區(qū)菌株出現(xiàn)最小EC50為0.09μg/mL，兩者之間相差843倍（表2）。22個(gè)抗性菌株中低抗菌株占63. 63%、中抗占36. 36%，其中抗性最高的菌株抗性倍數(shù)達(dá)45. 18（表3）。

3結(jié)論與討論

本研究采用菌絲生長速率法測定了2019年采自上海市5個(gè)草莓種植基地共計(jì)90株灰霉病菌株對氟吡菌酰胺的敏感性，其中的68株菌株EC₅₀符合正態(tài)分布，所得曲線呈現(xiàn)一個(gè)連續(xù)單峰，均值為（1. 68±0.91）μg/mL，與張曉柯等針對江蘇省草莓灰霉病菌建立的菌絲生長敏感基線（1. 94±1. 55）μg/mL接近，故可作為草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的敏感基線參考值評估田間整體抗性情況。此外，結(jié)合菌株ECso和基因突變位點(diǎn)，對已報(bào)道的草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺抗藥性標(biāo)準(zhǔn)（RF<2為敏感;2≤RF<10為低抗;10≤RF<50為中抗;RF≥50為高抗）進(jìn)行了優(yōu)化，新定義了更適用的草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)（RF<3為敏感;3≤RF<10為低抗;10≤RF<50為中抗;RF≥50為高抗）。

研究表明，上海市5個(gè)區(qū)灰霉病菌對氟吡菌酰胺的敏感性已產(chǎn)生分化，全市灰霉病菌抗性菌株頻率24. 44%，但是以低、中抗為主，而奉賢區(qū)抗性菌株頻率已達(dá)較高水平，崇明、嘉定、浦東以及青浦草莓生產(chǎn)區(qū)草莓灰霉病對氟吡菌酰胺抗性頻率較低，甚至為0，變異系數(shù)較小，說明這4個(gè)區(qū)對氟吡菌酰胺目前還處在敏感水平，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的群體。因此，在上海奉賢地區(qū)草莓灰霉病防治，應(yīng)及時(shí)調(diào)整施藥方案，減少氟吡菌酰胺的用藥頻次，建議優(yōu)先選用其他作用機(jī)制或類型的新型殺菌劑，如與咯菌腈等輪換使用，并密切監(jiān)測病原菌對氟吡菌酰胺的敏感性變化動(dòng)態(tài)，以避免防治失敗。

本研究通過對供試菌株SDH基因的核苷酸序列的對比分析，發(fā)現(xiàn)Sdh A、Sdh C與Sdh D 3個(gè)基因均未發(fā)生突變，而Sdh B亞基272位密碼子CAC突變?yōu)镃GC，引起組氨酸（H）突變?yōu)榫彼幔≧），但并不影響菌株的敏感性，這一結(jié)論與張曉柯等報(bào)道的抗性可能主要是由B亞基的272位突變引起不一致;230位密碼子AAC突變?yōu)锳TC，引起天冬酰胺（N）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖），菌株表現(xiàn)為低抗;225位密碼子CCC突變?yōu)門TC，引起脯氨酸（P）突變?yōu)楸奖彼幔‵），菌株表現(xiàn)為中抗，這一結(jié)論與Amiri等的一致，Hu等和Fernandez等也報(bào)道草莓灰霉病菌株Sdh B的N230I和P225F突變導(dǎo)致其對氟吡菌酰胺產(chǎn)生抗性。

琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑作用靶標(biāo)為線粒體復(fù)合體Ⅱ（三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵復(fù)合體），通過完全或者部分占據(jù)底物泛醌的位點(diǎn)，抑制電子從琥珀酸傳遞到輔酶Q（泛醌），干擾呼吸鏈上復(fù)合體Ⅱ電子傳遞，阻斷其能量代謝，最終導(dǎo)致病原菌死亡。結(jié)構(gòu)包括3部分：酸片段（A）、胺片段（B）和酰胺鍵鏈接部分（C）（圖3），C部分是固定基團(tuán)，A和B部分為活性基團(tuán)。啶酰菌胺和氟吡菌酰胺同為琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，具有不同的活性基團(tuán)（圖4）。許多研究發(fā)現(xiàn)灰霉菌Sdh B亞基的H272R突變可產(chǎn)生對啶酰菌胺的抗性，本研究發(fā)現(xiàn)H272R突變的灰霉菌株對氟吡菌酰胺仍舊敏感，兩種殺菌劑對灰霉菌Sdh B亞基H272R突變表現(xiàn)出不同的生物活性。SDH殺菌劑的抑菌活性主要取決于它們與靶標(biāo)位點(diǎn)的對接能力和親和力，這種親和力受到殺菌劑化學(xué)結(jié)構(gòu)的高度影響。已有報(bào)道，氟吡菌酰胺的活性基團(tuán)3-氯-5-三氟甲基2吡啶基被2-氯-4三氟甲基-2-苯基取代時(shí)，導(dǎo)致其抗子囊菌活性顯著下降，而被正交苯基取代時(shí)，抗擔(dān)子菌活性增強(qiáng)。

病原菌對SDHIs的抗性主要由琥珀酸脫氫酶復(fù)合體亞基上氨基酸突變所致，氨基酸突變，改變了藥劑與藥靶的親和力，進(jìn)而影響病菌的抗藥性。Sdh B亞基230位點(diǎn)的天冬酰胺是親水性的，異亮氨酸是高度疏水性，蛋白質(zhì)疏水性的改變是否會影響琥珀酸脫氫酶的形成或氧化還原電位，從而有利于與其他氨基酸的對接形成Q位點(diǎn)（琥珀酸脫氫酶泛醌結(jié)合位點(diǎn)，quinone-binding sites）還有待進(jìn)一步研究。同樣，Sdh B亞基225位點(diǎn)的脯氨酸被體積較大的苯丙氨酸替代，使得225位點(diǎn)附近的空間構(gòu)型發(fā)生改變，從而降低了殺菌劑結(jié)合Q位點(diǎn)的親和性。本研究發(fā)現(xiàn)Sdh B亞基N2301和P225F突變與氟吡菌酰胺抗性程度高低具有相關(guān)性，為將來草莓灰霉病菌對氟吡菌酰胺的抗性檢測技術(shù)的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。此外，由于本研究抗性菌株群體數(shù)量的局限性，上海市草莓灰霉病病菌抗氟吡菌酰胺的菌群是否還存在其他基因突變類型，以及氟吡菌酰胺與其他藥劑交互抗性關(guān)聯(lián)性等方面有待進(jìn)一步研究。