超高效液相色譜串-聯(lián)質(zhì)譜檢測小麥中唑啉草酯及其代謝物M4

吳遲　何明遠　歐陽小慶等

中圖分類號：S 481.8 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020599

唑啉草酯為先正達公司開發(fā)的苯基吡唑啉類除草劑，具有內(nèi)吸傳導性，作用機理為乙酰輔酶羧化酶（ACC）抑制劑，造成脂肪酸合成受阻，使細胞生長分裂停止，細胞膜含脂結(jié)構(gòu)被破壞，導致雜草死亡。唑啉草酯主要用于大麥和小麥田防除一年生禾本科雜草，如大穗看麥娘Alopecurus myosuroides Huds.、阿披拉草Apera spica-venti L.Beauv.、燕麥Avenasativa L.、黑麥Secale cereale L.、狗尾草Setaria viridis（L.）Beauv.等主要禾本科雜草，對小麥安全性高。有研究表明，5%唑啉草酯乳油80、100 mL/667m²對小麥田4～5葉禾本科雜草（藺草Schoenoplectus trigueter （L.）Palla、看麥娘Alopecurus aequalis Sobol.為主）防除效果優(yōu)良，藥后35 d株防效分別達到92. 9%和96.1%，鮮重防效分別達到97. 7%和99.1%。由于其防效好、安全性高，唑啉草酯發(fā)展迅速，先后在美國、英國、加拿大以及澳大利亞取得登記。2010年唑啉草酯原藥單劑和復配制劑在中國取得登記。唑啉草酯在植物體內(nèi)迅速代謝為M2，而后羥基化為代謝物M4。唑啉草酯及其代謝物M4被視為唑啉草酯用以制定其MRL值及膳食評估的定義指標。因此，研究建立唑啉草酯及其代謝物M4在小麥中的檢測方法具有重要意義。

目前，唑啉草酯的殘留檢測方法主要有液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和高效液相色譜法（HPLC）。前處理大多采用QuEChERS法。國內(nèi)對于唑啉草酯的測定研究大多是對于大麥樣品，而對唑啉草酯在小麥上的檢測方法研究較少，未見其代謝物M4在小麥上的測定研究報道。本文采用超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法開展了唑啉草酯及代謝物M4在小麥上的殘留試驗，建立了UPLC-MS/MS快速檢測唑啉草酯和代謝物M4在小麥中的殘留分析方法，為該藥劑在小麥上的安全使用提供方法與依據(jù)，為農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)測和膳食評估提供技術支撐。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters XevoTQD），沃特世科技上海有限公司;色譜柱為ACQU-ITY UPLC BEH C18（2.1 mmX50 mm，1.7μm），Waters公司;ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm），Waters公司;Insert Sustain

C8（2.1 mm×75mm，3μm）， GLS Sciences公司;分析天平（MS105），梅特勒托利多儀器上海有限公司;電子天平（YP502N），上海菁海儀器有限公司;數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司;移液器，Eppendorf;臺式高速離心機（TG-18），四川蜀科儀器有限公司;0.22μm微孔濾膜，天津博納艾杰爾公司;多管旋渦混合器（UMV2），北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

唑啉草酯標準品（純度99.1%），北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司;唑啉草酯代謝物M4標準品（純度99. 7%），上海洲銳生物科技有限公司;N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（GCB）、多壁碳納米管（MWCNT），天津博納艾杰爾公司;乙腈、甲酸、乙酸、HCl（色譜純，分析純），賽默飛世爾科技有限公司;氯化鈉（分析純）、無水乙酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2樣品前處理方法

1.2.1麥粒中唑啉草酯提取

采用優(yōu)化的QuEChERS方法，稱取（10. 00±0.05）g麥粒于50 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，10.0 mL0.1%甲酸乙腈，混勻，超聲提取15min，然后向離心管中加入6g無水MgSO₄，1，1.8g無水NaAC，2400 r/min渦旋2min，4000 r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg PSA的離心管中，2400 r/min渦旋2 min，10 000r/min離心2 min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.2.2麥粒中唑啉草酯代謝物M4提取

采用優(yōu)化的QuEChERS方法，稱?。?.00±0. 05）g麥粒于50 mL離心管中，加入10. 00 mL1 mol/L HCl，混勻，80'c水浴超聲30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，向離心管中加入5. 00g NaCl，4.00 g無水MgSO₄，2400r/min渦旋2min，4 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg C18的離心管中，2400 r/min渦旋2 min，10 000 r/min離心2 min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.2.3秸稈中唑啉草酯提取

采用優(yōu)化的QuEChERS方法，稱?。?. 00±0. 05）g秸稈于50 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，10.0 mL0.1%醋酸乙腈，混勻，超聲提取15 min，然后向離心管中加入6g無水MgSO₄，1.8 g無水NaAC，2400 r/min渦旋2min，4000r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg PSA的離心管中，2 400 r/min渦旋2 min，10000 r/min離心2 min，取上清過0.2μm微孔濾膜，待測。

1.2.4秸稈中唑啉草酯代謝物M4提取

采用優(yōu)化的QuEChERS方法，稱取（1.00±0.05）g秸稈于50 mL離心管中，加入10. 00 mL 1mol/LHC1，混勻，80℃水浴超聲30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超聲提取15min，冷卻至室溫后，向離心管中加入5. 00gNaCl，4.00g無水MgSO₄，2400r/min渦旋2 min，4000r/min離心5min，取上清4.000mL，旋蒸近干，用1. 000 mL乙腈定容，待凈化。將旋蒸瓶中溶液分別轉(zhuǎn)移至裝有50 mg C18的離心管中，2400r/min渦旋2 min，10000r/min離心2min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.3唑啉草酯及其他代謝物M4的檢測

1.3.1色譜柱和凈化劑的選擇

本研究考察了3種色譜柱C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），C8柱（2.1mm×75 mm，3μm）和LCHILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm）對唑啉草酯和唑啉草酯代謝物保留和響應的影響。當流動相為乙腈水相（70：30），且水相中含有0.01%的甲酸時，采用上述色譜柱分別對o.25 mg/l_的唑啉草酯和唑啉草酯代謝物標準溶液進行分析測定。麥粒和秸稈基質(zhì)中唑啉草酯分別采用乙腈、甲醇、0. 1%甲酸乙腈和0.1%的醋酸乙腈提取，麥粒和秸稈中唑啉草酯代謝物M4分別采用乙腈、0. 1%甲酸乙腈、0.1%醋酸乙腈、10 mL 1mol/L HCl+10 mL乙腈提取，80℃水浴中超聲輔助提取，以PSA為凈化材料，選擇最優(yōu)提取劑。

1.3.2色譜條件

色譜柱為AOQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），柱溫為40℃。唑啉草酯流動相為乙腈和0. 01%甲酸水溶液（70. 0/30.0）等度洗脫，流速為0.4 mL/min;進樣量為2μL。唑啉草酯代謝物M4流動相為乙腈和0.01%甲酸水溶液二元梯度洗脫，流速0.4 mL/min;進樣量為5μL;梯度洗脫條件見表1。

1.3.3質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+）。離子源溫度150℃，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N₂）流量1000L/Hr，錐孔反吹氣（N₂）流量50L/Hr。唑啉草酯毛細管電壓1. 99kV，唑啉草酯代謝物M4毛細管電壓3. 80 kV。采用MRM多重反應監(jiān)測，以保留時間和離子對（母離子和2個子離子）信息比較進行定性分析;以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4方法驗證

1.4.1標準曲線繪制

采用麥粒、秸稈基質(zhì)空白提取液做溶劑，分別稀釋唑啉草酯標準溶液和唑啉草酯代謝物M4，得到濃度為0. 000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的基質(zhì)標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。采用麥?；|(zhì)空白提取液做溶劑，稀釋標準溶液，得到濃度為0. 005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的麥?；|(zhì)標準溶液。采用秸稈基質(zhì)空白提取液做溶劑，稀釋標準溶液，得到濃度為0. 002、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的秸稈基質(zhì)標準溶液。按1.3條件進行檢測，分別以唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的質(zhì)量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.2添加回收以及精密度準確度

在空白麥粒中添加3個水平濃度的唑啉草酯標準溶液，添加水平分別為0. 001、0.01 mg/kg和0.1 mg/kg。在空白秸稈中添加3個水平濃度唑啉草酯標準溶液，添加水平分別為0. 01、0.1 mg/kg和1. 00 mg/kg。在空白麥粒中添加3個水平濃度的唑啉草酯代謝物M4標準溶液，添加水平分別為0.01、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg。在空白秸稈中添加3個水平濃度唑啉草酯代謝物M4標準溶液，添加水平分別為0. 05、0.1 mg/kg和0.5 mg/kg，每個添加水平濃度重復5次。按1.3條件進行檢測，計算添加回收率及相對標準偏差（RSD）。

2結(jié)果與分析

2.1唑啉草酯及其代謝物M4的檢測

2.1.1檢測條件優(yōu)化

為獲取唑啉草酯、唑啉草酯代謝物M4多反應監(jiān)測參數(shù)，采用在質(zhì)譜直接進標準品的方式，在100～500 m/z范圍內(nèi)掃描，對正離子電離（ESI⁺）和負離子電離（ESI^-）同時進行監(jiān)測。結(jié)果表明，在ESI⁺模式下，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4具有明顯的特征離子峰[M+H]。再調(diào)整合適的錐孔電壓選定母離子，調(diào)節(jié)碰撞能量，進一步獲得定量和定性離子及相應的碰撞能量，最終優(yōu)化條件如1.3所示。進一步優(yōu)化色譜條件，最終唑啉草酯、唑啉草酯代謝物M4均采用乙腈-0.01%甲酸水溶液體系為流動相，在所設梯度洗脫條件下得到較好的靈敏度、重現(xiàn)性及峰形（圖2）。

2.1.2色譜柱選擇

唑啉草酯及其代謝物M4在LCHILIC柱上的保留時間有所增加，色譜峰形較差，為準確定量帶來困難。二者在C18、C8色譜柱上的保留時間相當，但在C8色譜柱上的響應明顯不如于C18色譜柱。因此，選取C18色譜柱用于唑啉草酯及其代謝物的分析測定。

2.2麥粒和秸稈樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

以添加回收率為指標，結(jié)果表明，0.1%甲酸乙腈對麥粒中唑啉草酯的提取效果最佳，0. 1%醋酸乙腈對秸稈中唑啉草酯的提取效果最佳，在80℃水浴中加熱超聲輔助條件下，10mL 1mol/LHCl+10 mL乙腈對麥粒與秸稈中唑啉草酯代謝物M4提取效果最佳。相對于乙腈，酸化乙腈的提取效率更高。唑啉草酯代謝物M4存在游離態(tài)與共軛態(tài)，添加1mol/L HCl，以水浴加熱超聲輔助提取，更有利于樣本中共軛態(tài)M4游離，結(jié)果見表3。

2.2.2凈化劑的選擇

唑啉草酯分別采用GCB、PSA、多壁碳納米管凈化，唑啉草酯代謝物M4分別采用PSA、C18和GCB凈化。凈化后，上清液均變澄清，說明4種凈化方式都能很好地去除色素。不同凈化劑對麥粒和秸稈基質(zhì)中0. 100 mg/kg添加濃度的唑啉草酯及唑啉草酯代謝物M4的回收率影響不同。50 mg GCB、50 mg PSA、10 mg多壁碳納米管凈化后，麥粒基質(zhì)中唑啉草酯的回收率范圍分別為70. 3%～79. 1%、71. 9%～77. 3%、65.2%～73.7%，秸稈基質(zhì)中唑啉草酯的回收率分別為58. 9%～64. 8%、72. 0%～77. 1%、40. 2%～57. 1%; 50 mg C18、50 mg GCB、50 mg PSA凈化后，麥?；|(zhì)中唑啉草酯代謝物M4的回收率分別為70. 3%～78.1%、69. 2%～77. 3%、55. 2%～62.3%。秸稈基質(zhì)中唑啉草酯代謝物M4的回收率分別為78. 9%～84. 8%、72. 0%～77.1%、59. 5%～65.4%。結(jié)果表明，麥粒與秸稈基質(zhì)中，選用PSA為凈化劑唑啉草酯添加回收均滿足要求，選用C18為凈化劑唑啉草酯代謝物M4添加回收均滿足要求（回收率在70%～120%之間）。結(jié)果見圖3。

2.3方法驗證

2.3.1基質(zhì)標準曲線繪制

基質(zhì)匹配外標法定量分析，結(jié)果表明在0. 000 5～0.5 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的峰面積（y）與其質(zhì)量濃度（x）呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.2添加回收試驗的準確度和精密度

在0. 001、0.010mg/kg和0.100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麥粒中的平均回收率為77. 6%～90.4%，RSDs為1.71%～3.64%;在0. 010、0. 100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸稈中的平均回收率為76. 7%～84.4%，RSDs為4.35%～9. 36%。在0.010、0.100 mg/kg和1. 000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為81. 9%～89.4%，RSDs為5. 51%～13. 90%。在0.050、0.100 mg/kg和0. 500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在秸稈中的平均回收率為74. 5%～89. 2%，RSDs為3.14%～15. 60%（表5）。唑啉草酯在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 001 mg/kg和0.01 mg/kg;唑啉草酯代謝物M4在麥粒、秸稈中的定量限分別為0.01 mg/kg和0.05 mg/kg，該方法的回收率、準確度、精密度、靈敏度均滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的檢測要求。

3結(jié)論與討論

本研究采用QuEChERS方法進行樣品前處理，建立了UPLC-MS/MS測定小麥麥粒和秸稈中唑啉草酯及其代謝物M4的殘留分析方法。提取溶劑的選擇與目標化合物的溶解性質(zhì)以及目標化合物存在的基質(zhì)有關。常用的有機提取溶劑有乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等，其中乙腈對大多數(shù)農(nóng)藥具有良好的溶解性以及較小的雜質(zhì)溶出度，甲醇也是一種比較好的提取溶劑，但其揮發(fā)性較大，而且與水互溶，往往容易造成提取后共存的水分難以除去。而提取溶劑酸化具有保證目標物的穩(wěn)定性，提高提取效率的作用。QuEChERS方法常用的凈化材料有C18、PSA、GCB、無水硫酸鎂和多壁碳納米管等，其中C18可吸附樣品中的脂肪和蛋白質(zhì)，PSA主要吸附樣品中的脂肪酸和糖類雜質(zhì)，GCB主要去除植物中的葉綠素等雜質(zhì)，無水硫酸鎂可去除樣品中的水分。本文篩選了唑啉草酯與唑啉草酯代謝物M4在麥粒和秸桿基質(zhì)中最佳提取溶劑與最佳凈化劑。在0. 000 5～0.5mg/L范圍內(nèi)，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的濃度與色譜峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關系;在0. 001、0.010 mg/kg和0. 100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麥粒中的平均回收率為77. 6%～90.4%，RSDs為1.71%～3.64%;在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸稈中的平均回收率為76. 7%～84.4%，RSDs為4.35%～9.36%。在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為81. 9%～89.4%， RSDs為5.51% N13. 90%。在0. 050、0.100 mg/kg和0.500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為74. 5%～89. 2%，RSDs為3.14%～15. 60%。唑啉草酯在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 001 mg/kg和0. 01 mg/kg;唑啉草酯代謝物M4在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 01mg/kg和0.05 mg/kg。與韓何丹等建立的HPLC-MS/MS測定唑啉草酯的方法相比，本研究的定量限更低，靈敏度更高。該方法快速簡便，準確可靠。與JMPR上提供的HPLC-MS/MS測定唑啉草酯代謝物M4的方法相比，該方法經(jīng)濟快速，操作簡單。