GC-MS/MS法測定草莓中吡唑醚菌酯殘留量及安全評(píng)價(jià)

喻歆茹　路彩紅　徐玲英等

中圖分類號(hào)：S 481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020264

吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類新型殺菌劑，其主要通過抑制病菌線粒體的呼吸阻礙病菌的能量循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。吡唑醚菌酯對(duì)子囊菌類、擔(dān)子菌類、半知菌類及卵菌類均有很好的活性，具有保護(hù)、治療、滲透、內(nèi)吸等作用，對(duì)農(nóng)作物生長有一定的調(diào)節(jié)作用，被廣泛用于防治農(nóng)作物的霜霉病、白粉病、葉斑病、炭疽病等病害。除此之外，吡唑醚菌酯還能誘導(dǎo)農(nóng)作物發(fā)生生理變化，提高對(duì)氮元素的吸收，促進(jìn)生長，提高產(chǎn)量。

我國是草莓第一種植大國。由于草莓生長周期短，經(jīng)濟(jì)效益高，已成為我國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之J[們，但連作易引起草莓病害的發(fā)生。吡唑醚菌酯是防治草莓病害的主要農(nóng)藥，其大量使用所帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境問題都值得關(guān)注。盡管吡唑醚菌酯毒性較低，但過量使用可能對(duì)消費(fèi)者構(gòu)成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。目前，國內(nèi)外對(duì)吡唑醚菌酯在農(nóng)產(chǎn)品上的殘留測定方法已有大量報(bào)道，但已報(bào)道的檢測方法中其樣品前處理和凈化方法效果不佳，試劑使用量大。草莓中吡唑醚菌酯殘留檢測的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法尚未見報(bào)道。由于不同樣本基質(zhì)的多樣性，現(xiàn)有方法無法直接使用，我國規(guī)定吡唑醚菌酯在草莓上的最大殘留限量（maxlmum res-idue limit，MRL）為2mg/kg。雖已有關(guān)于吡唑醚菌酯在草莓等鮮食水果、蔬菜上的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)道，但GB 2763—2019中針對(duì)吡唑醚菌酯在食品中最大殘留限量制定的食品類別由15項(xiàng)增加到66項(xiàng)，需要對(duì)其重新進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本試驗(yàn)通過對(duì)提取溶劑、分散固相吸附劑進(jìn)行優(yōu)化，建立了準(zhǔn)確、快速測定草莓中吡唑醚菌酯的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS），同時(shí)結(jié)合施藥濃度、施藥次數(shù)及施藥間隔時(shí)間等因素對(duì)吡唑醚菌酯進(jìn)行消解動(dòng)態(tài)差異、殘留特點(diǎn)等對(duì)比，并對(duì)吡唑醚菌酯在草莓中的最終殘留結(jié)果進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為吡唑醚菌酯在草莓上的科學(xué)合理使用和殘留檢測提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

TQ 8040氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，日本島津公司;DB-5 MS色譜柱（30m×0.25 mm×0.25μm，美國Agilent Technologies公司）;其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器設(shè)備。

99.5%吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Eh renstorfer GmbH公司;分析純乙腈，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;色譜純乙腈，德國默克公司;色譜純甲酸，美國Anaqua Chemicals;氯化鈉（分析純），蘭溪市屹達(dá)化工試劑有限公司;2mL Agela Clean ert MAS-Q凈化管購自天津博納艾杰爾科技有限公司，包括3種，分別為1）C18 50 mg，PSA 50 mg，MgSO₄150 mg;2）C18 50 mg， PSA 50 mg， MgSO₄150 mg， PC 50 mg;3） C18 50 mg， PSA 50 mg，MgSO₄150 mg，PC 8 mg。250 g/L吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫（中國）有限公司。

1.2樣品前處理

1.2.1提取溶劑的優(yōu)化

乙酸乙酯、丙酮、乙腈、正己烷是果蔬樣品中農(nóng)藥殘留分析的常用提取溶劑，本試驗(yàn)比較了這5種試劑作為提取溶劑的提取效率。稱取已勻漿的草莓空白樣品5.0g于50 mL離心管中，加入吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加量為0.2 mg/kg）靜置30 min。加入20 mL提取試劑振蕩30 min，加入約3g氯化鈉，渦旋振蕩1min，5454 g離心1 min，吸取1.0 mL上清液至平底燒瓶于40℃濃縮至近干，色譜純乙腈定容2.5mL，待凈化。

1.2.2凈化填料的優(yōu)化

吸附填料的組成和用量是影響樣品前處理凈化的重要因素，本試驗(yàn)采用分散固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。吸取1.2.1的待凈化液1.6mL于3種Cleanert MAS-Q凈化管中，渦旋30 s，8000g離心1 min，取上清液過0.22μm濾膜，待檢測。

1.2.3儀器分析條件

氣相色譜條件：色譜柱DB-5 MS。進(jìn)樣口溫度：250℃;起始溫度80℃保持1min，以35℃/min升溫至280℃，保持6 min;載氣：He（純度≥99. 999%），恒流模式，進(jìn)樣體積1.0μL;進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣;質(zhì)譜條件：采用多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（ multiplereaction monitoring，MRM）采集，電離方式：EI（70 eV）;接口溫度：280℃;離子源溫度：230℃;檢測電壓：0.8 kV，定性和定量離子對(duì)、碰撞能如表1所示。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

乙腈為溶劑，配制1μg/mL吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并依次稀釋成0. 001、0.005、0.010、0.050、0. 100、0.200μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.2.3節(jié)的檢測條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)峰面積作圖，繪制吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。使用草莓空白樣品，按照1.2的方法提取并凈化制得草莓空白基質(zhì)溶液，吸取2 mL草莓空白基質(zhì)溶液，N₂吹至近干后用配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，超聲得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0. 22μm微孔濾膜后進(jìn)行GC-MS/MS測定。

1.2.5回收率和精密度

向草莓空白樣品中添加3個(gè)水平（0. 020、0.20、2.0 mg/kg）的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次。按照已優(yōu)化的前處理方法提取和凈化，1.2.3的檢測條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3吡唑醚菌酯田間消解動(dòng)態(tài)和殘留試驗(yàn)

于2019年3月—12月分別在浙江省杭州市、遼寧省沈陽市、北京市、山東省濰坊市、黑龍江省哈爾濱市、湖南省長沙市、安徽省合肥市、貴州省畢節(jié)市進(jìn)行250 g/L吡唑醚菌酯EC防治草莓葉斑病的田間試驗(yàn)。250 g/L吡唑醚菌酯EC的田間推薦劑量為6. 0～10.0 g/667m²。在草莓葉斑病發(fā)生初期采用噴霧方式施藥，每個(gè)小區(qū)50m²，藥液量為0. 067 5L/m²，保證均勻施藥，施藥3次，施藥間隔7～10 d。施藥后2h、1、3、5、7、lo d每個(gè)小區(qū)按四分法采集樣品。所有樣品裝入樣品袋中，在低于

20℃條件下保存。其中消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)采用山東、北京、遼寧、浙江4地的樣品;最終殘留試驗(yàn)采用8地5、7、10d的樣品。樣品檢測前，所有樣品在冷凍狀態(tài)下經(jīng)勻漿機(jī)勻漿，制備成待檢樣品。

1.4膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI）和風(fēng)險(xiǎn)概率（risk probability）對(duì)吡唑醚菌酯在草莓中的膳食風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。

NEDI=∑[STMR（STMR-P_i）×F];

風(fēng)險(xiǎn)概率=NEDI/（ADI×B_w）×100%。

STMR：農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值;STMR—P_i：用加工因子校正的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值;F：一般人群某一食品的消費(fèi)量。ADI：每千克體重每日允許攝入量，單位mg/kg。B_w：人群平均體重，單位kg。當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)概率>100%時(shí)，表示會(huì)對(duì)一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)概率越大，風(fēng)險(xiǎn)越大，反之，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)概率<100%時(shí)，表示對(duì)一般人群健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)是可接受的，風(fēng)險(xiǎn)概率越小，風(fēng)險(xiǎn)越小。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的優(yōu)化

供試的5種溶劑中乙酸乙酯屬中等極性，用其作為提取溶劑時(shí)目標(biāo)化合物難以轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，且易將基質(zhì)樣品中的非極性雜質(zhì)，如蠟質(zhì)、脂肪等提取出來。丙酮容易將樣品中的色素雜質(zhì)提取出來，且丙酮與水互溶，難以與水相分層。為了獲得更高的回收率和較好的樣品提取效率，本試驗(yàn)對(duì)5種不同試劑的提取效率和差異顯著性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。不同提取溶劑提取的樣品中吡唑醚菌酯的平均回收率差異顯著（P<0.05），丙酮、乙腈及1. 0%甲酸乙腈均能有效提取吡唑醚菌酯，但由于草莓基質(zhì)含水量高，用乙腈或者酸化乙腈提取后鹽析效果更好，當(dāng)提取溶劑為1.0%甲酸乙腈時(shí)，吡唑醚菌酯的萃取效率最高，其回收率為95.7%，RSD為3.2%，其結(jié)果與Narenderan等報(bào)道的一致。

2.2凈化填料的優(yōu)化

近年來，分散固相萃取法在農(nóng)藥上應(yīng)用廣泛，常見的用于凈化的吸附填料有C18，PC和PSA。PSA可以有效吸附脂肪酸、糖類、色素及有機(jī)酸等物質(zhì)。PC主要去除色素、甾醇類和非極性干擾物，C18主要去除脂肪和酯類等非極性干擾物。本試驗(yàn)選用C18、PC和PSA作為吸附填料，比較其對(duì)吡唑醚菌酯回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。3種凈化方法下吡唑醚菌酯的平均回收率差異顯著（P<0.05），在吸附填料中均含有PSA 50 mg、MgSO₄150 mg、C18 50 mg的條件下，凈化方法1添加50 mg PC其吡唑醚菌酯的回收率僅有45.5%;凈化方法3將PC含量降低為8 mg時(shí)，吡唑醚菌酯的回收率顯著提高，回收率為83.1%;而凈化方法2的吸附填料里無PC，目標(biāo)物的回收率為107. 9%，與PC吸附劑相比，PSA也能吸附部分色素達(dá)到凈化色素的效果。結(jié)果表明，PC填料對(duì)于吡唑醚菌酯具有吸附作用，導(dǎo)致其回收率偏低，因此本試驗(yàn)采用PSA和C18作為凈化填料吸附雜質(zhì)。與Lagunas-Allue等所報(bào)道的方法相比，改進(jìn)QuEChERs-GC-MS/MS的LOQ更低，凈化分離效果好。

2.3方法的線性范圍、準(zhǔn)確度及精密度

本研究基于優(yōu)化后的QuEChERs方法進(jìn)行樣品前處理，采用1. 0%甲酸乙腈作為提取溶劑，凈化過程添加C18、PSA等分散固相吸附劑來去除草莓樣本中的雜質(zhì)。外標(biāo)法定量分析結(jié)果表明：在0. 001～0. 200 mg/L圍內(nèi)，吡唑醚菌酯的峰面積（y）與其質(zhì)量濃度（x）呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程為y=4878. 9x—2985.8，相關(guān)系數(shù)r=0. 999 8。

由表2可以看出：在0. 020、0.20、2.0 mg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯在草莓中的平均回收率為101.4%、96. 8%、97. 3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1. 8%、2.0%、3.3%（n=5）。草莓中吡唑醚菌酯的定量限（LOQ）為0. 020 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)的規(guī)范要求。

2.4基質(zhì)效應(yīng)

本試驗(yàn)采用在空白草莓基質(zhì)中添加待測物的方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，通過測定吡唑醚菌酯在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（K_m）及其在純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（K），計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）。ME=（K_m/K-1）×100%。當(dāng)|ME|≤20%時(shí)，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí)，為中等基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)|ME|>50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。由于草莓基質(zhì)復(fù)雜，凈化不完全而流出的基質(zhì)雜質(zhì)不僅影響方法的靈敏度，甚至還影響儀器的壽命，因此通常要求在保證添加回收率的同時(shí)要最大化地去除基質(zhì)干擾。本文比較了不同凈化方法下的草莓基質(zhì)效應(yīng)，通過凈化方法1、2和3凈化草莓樣品，吡唑醚菌酯的基質(zhì)效應(yīng)分別為13. 2%，9. 7%，13. 7%，均呈現(xiàn)弱基質(zhì)效應(yīng)，說明3種凈化方式條件下凈化效果良好。不同吸附填料對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響評(píng)估結(jié)果顯示，含PC填料的凈化方法其基質(zhì)效應(yīng)要高于無PC填料的凈化方法，這可能是因?yàn)镻C吸附雜質(zhì)的同時(shí)也吸附目標(biāo)分析物。通過基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)采用溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5吡唑醚菌酯在草莓中的消解動(dòng)態(tài)

2.6吡唑醚菌酯在草莓中的最終殘留

吡唑醚菌酯在8地草莓中的最終殘留結(jié)果如表4所示，以250 g/L吡唑醚菌酯EC有效成分150 g/hm²在草莓上施藥3次。施藥后5d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 015～0. 35 mg/kg，殘留中值（STMR）為0. 16 mg/kg，殘留最大值（HR）為0. 35 mg/kg。施藥后7d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 014～0. 31 mg/kg，STMR為0.12 mg/kg，HR為0. 31mg/kg。施藥后10 d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 012～0.15 mg/kg，STMR為0.085 mg/kg，HR為0.15 mg/kg。采收間隔期5d時(shí)吡唑醚菌酯在草莓中達(dá)到最大殘留量（0. 35 mg/kg），小于我國規(guī)定吡唑醚菌酯在草莓上的最大殘留限量（MRL=2 mg/kg）。

2.7吡唑醚菌酯膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

基于最終殘留試驗(yàn)中吡唑醚菌酯的殘留數(shù)據(jù)，以一般人群的膳食結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，選用采收間隔期5d的吡唑醚菌酯STMR（0.16 mg/kg）和GB 2763—2019中規(guī)定吡唑醚菌酯的ADI（0. 03mg/kg）進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果如表5所示。一般人群吡唑醚菌酯的國家估算每日攝入量（ NEDI）為1.34 mg，占日允許攝入量的70. 9%，小于100%，表明我國居民對(duì)吡唑醚菌酯長期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)較低，不會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明：以250 g/L吡唑醚菌酯EC有效成分150 g/hm²的劑量在草莓上噴霧施藥3次，采收間隔期為5d時(shí)不會(huì)對(duì)一般人群造成膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)建立了基于分散固相萃取法結(jié)合GC-MS/MS檢測草莓樣品中吡唑醚菌酯殘留分析方法，以PSA、C18為凈化吸附填料，吡唑醚菌酯的平均回收率為96. 8%～101.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～3.3%，定量限為0. 020 mg/kg。該方法具有操作簡單，高效等優(yōu)點(diǎn)，且靈敏度、重現(xiàn)性、回收率等指標(biāo)都能滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯在草莓中的消解速率較快，半衰期為2. 2～3.0 d，屬于易降解農(nóng)藥，在末次施藥Sd后草莓中吡唑醚菌酯的殘留水平遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)規(guī)范殘留試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)草莓中吡唑醚菌酯的殘留進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，風(fēng)險(xiǎn)概率小于100%，表明了吡唑醚菌酯通過長期膳食攝人不會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。