超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)小麥中唑啉草酯及其代謝物M4

吳遲　何明遠(yuǎn)　歐陽小慶等

中圖分類號(hào)：S 481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020236

核桃Juglans regia L.又名胡桃、羌桃，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”。核桃因?yàn)槠涿牢断闾鹎液胸S富的、對(duì)人體有利的不飽和脂肪酸，以及大量維生素、微量元素等而深受人們喜愛。中國是世界上核桃起源中心之一，世界核桃生產(chǎn)第一大國，擁有最大的種植面積和產(chǎn)量，出口量?jī)H次于美國，居世界第二。然而，核桃常發(fā)生黑斑病、炭疽病、白粉病等病害，嚴(yán)重者導(dǎo)致果仁變黑腐爛，甚至樹木死亡。在我國登記在核桃上的農(nóng)藥有防治白粉病的石硫合劑和防治干腐病的喹啉銅和肟菌·戊唑醇。肟菌·戊唑醇水分散粒劑是近期拜耳股份公司登記在核桃上的農(nóng)藥，對(duì)作物兼具保護(hù)和病害治療的作用，并且具有增產(chǎn)的功效，為防治核桃樹干腐病的新選擇，應(yīng)用前景良好。

戊唑醇（tebuconazole）是一種高效、具有保護(hù)作用和治療作用的三唑類殺菌劑，廣泛用于蔬菜、水果和谷物中霜霉病、白斑病、黑斑病和軟腐病等病害的防治，其殺菌譜廣、持效期長(zhǎng)。戊唑醇對(duì)大鼠具有明顯的毒性和生殖影響，美國環(huán)保署（EPA）已經(jīng)將其分級(jí)為“潛在人類致癌物”。肟菌酯（trifloxys-trobin）是以天然產(chǎn)物strobilurins作為先導(dǎo)化合物研發(fā)的新型含氟殺菌劑，屬甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥。作為一種線粒體呼吸作用抑制劑，肟菌酯可以影響細(xì)胞三磷酸腺苷（ATP）酶合成，從而發(fā)揮抑菌效果。由于其具有高效、廣譜、持效期長(zhǎng)等特性，且對(duì)作物和環(huán)境安全，常用于防治稻瘟病、稻曲病、紋枯病等。在植物吸收肟菌酯后，會(huì)將其代謝成為肟菌酸（trifloxystrobin acid），肟菌酸的毒性較高，在環(huán)境中具有遷移轉(zhuǎn)化性和持久性。

戊唑醇的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜質(zhì)譜法等，肟菌酯的分析方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法和氣相色譜配NPD檢測(cè)器等，但其代謝物的分析方法文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。張煜卓利用QuEChERS前處理聯(lián)合GCMS-TQ8050氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀建立了測(cè)定核桃等5種堅(jiān)果中戊唑醇和肟菌酯等70種農(nóng)藥的殘留檢測(cè)方法。張婷亭建立了低溫冷凍-分散固相萃取-UPLC-QqLIT-MS法測(cè)定核桃等4種堅(jiān)果中戊唑醇等100種農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析方法。GCMS-TQ8050和UP-LC-QqLIT-MS價(jià)格昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。對(duì)于同時(shí)檢測(cè)戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代謝物肟菌酸在核桃基質(zhì)中的方法國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文建立了同時(shí)測(cè)定核桃中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸殘留量的超高效液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高，為上述3種物質(zhì)在核桃基質(zhì)中的殘留監(jiān)控和質(zhì)量安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

UHPLC-MS/MS（UltiMate 3000/TSQ VAN TGE，Thermo Fisher公司）;TG 16-Ⅱ離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司;TG16離心機(jī)，長(zhǎng)沙邁森儀器有限公司;XW-80A渦旋儀，海門其林貝爾儀器制造有限公司;ID5002C電子天平，天津天馬衡基有限公司;CK2000高通量組織研磨器，北京托摩根生物科技有限公司;粉碎機(jī)，浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

戊唑醇、肟菌酯、肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度分別為99. 7%、99. 2%和98. 0%，德國拜耳公司提供;分析純的無水硫酸鎂、氯化鈉、乙腈，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;99. 8%冰乙酸，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司;乙腈，色譜純，默克公司;88%甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司;蒸餾水，屈臣氏;SHIMSEN DISC濾膜（0. 22μm）;N-丙基乙二胺（PSA），石墨化碳黑（GCB），天津博納艾杰爾科技有限公司;弗羅里硅土（florisil），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;75%戊唑醇·肟菌酯水分散粒劑（WG），拜耳股份公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶劑的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.0100g±0.0001g、0.0101g±0.0001g和0.0102g±0.0001g，用色譜級(jí)乙腈做溶劑分別配制成100mg/L的儲(chǔ)備液100mL，得到100 mg/L的戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下保存。準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，分別用乙腈、核桃空白基質(zhì)將戊唑醇稀釋成質(zhì)量濃度為0. 002 5、0.01、0. 025、0.25、0.5 mg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液;將肟菌酯和肟菌酸稀釋成質(zhì)量濃度為0. 001、0. 01、0.05、0.1、0.5 mg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。UHPLC-MS/MS進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積（y）對(duì)戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/L）作圖，通過最小二乘法擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3提取與凈化

準(zhǔn)確稱取粉碎后的核桃樣品5g于50 mL離心管中，加入5ml_超純水，待樣品完成潤濕后，加入10 mL 2%的乙酸乙腈，以1000r/min振蕩提取10 min，加入2g氯化鈉和3g無水硫酸鎂，振蕩5 min，以5000 r/min離心5 min。移取1.5 mL上清液于裝有150 mg無水硫酸鎂+50 mg弗羅里硅土的2mL離心管中，渦旋30 s，以5000r/min離心5 min，過0.22μm有機(jī)濾膜至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.4儀器條件

1.4.1色譜條件

C18色譜柱（100 mmX2.1mm，1.9μm，ThermoFisher公司）;二元梯度洗脫分離，流速0.25 ml/min，進(jìn)樣體積5μL，以乙腈（A）和0.2%甲酸水溶液（B）（V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，0～1.0 min，5%A;1.0～1.3min，5%～95%A;1.3～4.5min， 95%A;4.5～4.8min，95%～5%;4. 8～5.5min，5%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）電噴霧離子源，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）正離子模式（ESI+）;毛細(xì)管溫度350℃;電噴霧電壓3 200 V;離子傳輸管溫度320℃;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)猓蕷饬魉?0arb，輔助氣流速10arb;戊唑醇：定量離子對(duì)307. 9>69.8，定性離子對(duì)307. 9>124.8，S-leans射頻電壓62 V，碰撞電壓為20 V（定量離子）和29 V（定性離子）。肟菌酯：定量離子對(duì)408. 6>144.7，定性離子對(duì)408. 6>185.8，S-leans射頻電壓67 V，碰撞電壓為41 V（定量離子）和16 V（定性離子）。肟菌酸：定量離子對(duì)395. 0>144.7，定性離子對(duì)307. 9>147.8，S-leans射頻電壓59 V，碰撞電壓為37 V（定量離子）和10 V（定性離子）。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

戊唑醇的添加濃度為0. 05mg/kg，肟菌酯、肟菌酸的添加濃度為0.2mg/kg時(shí)，分別用乙腈、1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈和5%乙酸乙腈對(duì)核桃中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸進(jìn)行提取。4種不同提取劑的提取效果及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如圖1所示，使用乙腈為提取劑時(shí)，添加平均回收率為33%～119%;使用1%乙酸乙腈為提取劑時(shí)，添加平均回收率為111%～131%、使用5%乙酸乙腈作為提取劑時(shí)，添加平均回收率為106%～122%，超過NY/T788-2018標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的回收率范圍（70%～120%）。而使用2%乙酸乙腈為提取劑時(shí)，樣品添加平均回收率為80%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<5%，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍均符合NY/T 788-2018標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍。因此試驗(yàn)提取劑選擇2%乙酸乙腈。

2.2凈化劑的選擇

在QuEChERS方法中，比對(duì)不同凈化劑的凈化效果。PSA可以有效去除樣品中的有機(jī)酸、色素和糖類物質(zhì);十八烷基鍵合硅膠（C18）可以從極性樣品中提取糖類和脂類物質(zhì)，主要用于反相萃取;弗羅里硅土可以從非極性溶液中萃取極性化合物，主要吸附脂肪酸;GCB主要吸附一些平面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如色素。在2.1中確定提取溶劑為2%乙酸乙腈，在戊唑醇的添加濃度為0. 05 mg/kg和肟菌酯及其代謝物肟菌酸的添加濃度為0.2 mg/kg的條件下，考察了C18、PSA、弗羅里硅土、GCB和C18+PSA組合（C18、PSA、弗羅里硅土均為50 mg再加入150 mg無水硫酸鎂，GCB為20 mg加入150 mg無水硫酸鎂，C18+PSA為各50 mg再加入150 mg無水硫酸鎂）凈化劑的凈化效果（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以C18、PSA、弗羅里硅土、GCB、C18+PSA為凈化劑時(shí)回收率分別為95%～115%、80%～95%、100%～102%、94%～104%、91%～99%，數(shù)據(jù)均符合NY/T 788-2018標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的回收率范圍（70%～120%）。本文將進(jìn)一步通過測(cè)定和計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，考慮從基質(zhì)效應(yīng)大小方面選擇凈化劑。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱在一定程度上與基質(zhì)種類有關(guān)，同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)還受提取農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)以及提取濃度、提取溶劑等的影響，如一些含有氨基、羥基和氨基甲酸酯基等官能團(tuán)的農(nóng)藥極易吸附在檢測(cè)器進(jìn)樣口的活性位點(diǎn)上，導(dǎo)致樣品基質(zhì)效應(yīng)變化。此外，檢測(cè)器的不同和進(jìn)樣方式的不同也會(huì)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生影響，基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的大小以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率與標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率的比值來表示。

ME=（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1）×100%。

通過測(cè)定不同樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度的峰面積，計(jì)算出相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以基質(zhì)效應(yīng)（ME）作為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的指標(biāo)。當(dāng)ME=0，則該基質(zhì)不存在基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)-20%50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

按照1.2方法得到戊唑醇、肟菌酯及其代謝物的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，結(jié)果表明在使用的5種凈化劑的條件下，在系列濃度范圍內(nèi)，戊唑醇、肟菌酯及其代謝物的峰面積所形成的溶液濃度方程的線性關(guān)系良好。

基于2.2節(jié)中5種凈化劑進(jìn)行樣品基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)定和計(jì)算。戊唑醇、肟菌酯及其代謝物肟菌酸在核桃中的基質(zhì)效應(yīng)如表1所示。戊唑醇和肟菌酯中基質(zhì)效應(yīng)最小的凈化劑為弗羅里硅土，肟菌酸中基質(zhì)效應(yīng)最小的凈化劑為PSA。為了在檢測(cè)過程中降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)儀器的影響，在保證回收率的情況下，選擇基質(zhì)效應(yīng)影響小的凈化劑。因此，經(jīng)過對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的綜合對(duì)比，選擇弗羅里硅土作為凈化劑。

2.4方法的準(zhǔn)確度和精密度

本試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度用添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來衡量。稱取5g空白的核桃樣品，加入戊唑醇、肟菌酯及其代謝物肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)品，其中戊唑醇的加標(biāo)水平分別為5、50、500μg/kg，肟菌酯及其代謝物肟菌酸的加標(biāo)水平分別為2、20、200μg/kg。對(duì)其進(jìn)行樣品前處理后測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表2。在加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，戊唑醇的平均回收率為80. 3%～100. 8%，RSD為2.5%～11.7%;肟菌酯的平均回收率為91.1%～102.9%，RSD為1.7%～12.5%;肟菌酸的平均回收率為91.7%～101. 9%，RSD為3.7%～9. 2%，方法顯示了良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 788-2018）的要求。其中在對(duì)照區(qū)中采集的樣品空白的色譜圖和戊唑醇、肟菌酯及肟菌酸加標(biāo)色譜圖見圖3。

2.5線性相關(guān)性和定量限

使用核桃基質(zhì)空白溶液配制1、5、10、50、100、500μg/L和1000μg/L的戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2前處理方法的選擇中所確定的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。在1～1000μg/L范圍內(nèi)，戊唑醇、肟菌酯和肟菌酸的峰面積與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系（R²≥0. 9998），滿足外標(biāo)法定量檢測(cè)的要求，其中線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)等參數(shù)見表1。以最小添加回收濃度確定3種目標(biāo)化合物的定量限，其中戊唑醇的定量限為5μg/kg，肟菌酯和肟菌酸的定量限均為2μg/kg。

2.6實(shí)際樣品的檢測(cè)

在山西和河北按照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》開展最終殘留試驗(yàn)，75%戊唑醇·肟菌酯水分散粒劑以推薦最高劑量112.5g/hm²（制劑用藥量：稀釋1000倍）在核桃成熟前倒推施藥3次，每次間隔10d，核桃成熟期采集核桃。戊唑醇最終殘留量為6～99μg/kg，肟菌酯最終殘留量為<2～103μg/kg，肟菌酯的代謝物肟菌酸殘留量均小于定量限（表3）。

3結(jié)論

本研究建立了在核桃基質(zhì)中同時(shí)檢測(cè)戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代謝物肟菌酸的一種簡(jiǎn)便可靠的殘留分析方法。使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）能夠?qū)颂一|(zhì)樣品中戊唑醇、肟菌酯和肟菌酯代謝物肟菌酸進(jìn)行分析。實(shí)際樣品檢測(cè)中，戊唑醇最終殘留量為6～99μg/kg，肟菌酯最終殘留量為<2～103μg/kg，肟菌酯的代謝物肟菌酸殘留量均小于定量限。樣品前處理操作簡(jiǎn)單，對(duì)目標(biāo)化合物選擇性強(qiáng)，方法的線性范圍、檢測(cè)限、定量限、平均添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等性能指標(biāo)均滿足農(nóng)藥殘留分析要求。