轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立

候吉超　李忠鵬　梁雨欣等

中圖分類號(hào)：S 565.1.Q 943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020133

草甘膦（glyphosate）又稱鎮(zhèn)草寧，1971年由美國(guó)貝爾德等發(fā)現(xiàn)，并由孟山都公司開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，目前已成為全球銷(xiāo)量最大的除草劑品種。來(lái)自土壤農(nóng)桿菌CP4的epsps基因所編碼的CP4-EPSPS蛋白由于對(duì)草甘膦具有高抗性而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物。目前，我國(guó)已獲得多個(gè)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因農(nóng)作物，包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等。中國(guó)是大豆原產(chǎn)國(guó)，同時(shí)也是大豆需求大國(guó)，每年我國(guó)從美國(guó)、巴西、阿根廷等國(guó)進(jìn)口大量轉(zhuǎn)基因大豆，年進(jìn)口總量由1996年的57萬(wàn)t上升到2019年的8851萬(wàn)t，進(jìn)口量不斷攀升。隨著轉(zhuǎn)基因大豆大量進(jìn)口及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，轉(zhuǎn)基因大豆的安全問(wèn)題逐漸引起人們的關(guān)注。因此，建立轉(zhuǎn)基因大豆新型快速檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。

目前，轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)主要分為核酸檢測(cè)和蛋白質(zhì)檢測(cè)兩大類。核酸檢測(cè)以PCR檢測(cè)技術(shù)為主，此外還相繼建立了巢式PCR、熒光定量PCR和Southern-blot等檢測(cè)技術(shù)。PCR檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。蛋白檢測(cè)主要為血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，包括ELISA、雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）和斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）等檢測(cè)技術(shù)。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)環(huán)境、儀器要求較低，適合在基層推廣應(yīng)用。在血清學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)一步研制出了膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)，但是對(duì)轉(zhuǎn)基因加工制品靈敏度較低。

本研究以CP4-EPSPS單克隆抗體和多克隆抗體為基礎(chǔ)，成功建立檢測(cè)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA方法，將檢測(cè)時(shí)間由普通DAS-ELISA的150 min縮短至75 mln。通過(guò)對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化，提高該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、簡(jiǎn)便性，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆的快速檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

CP4-EPSPS標(biāo)準(zhǔn)蛋白、CP4-EPSPS特異性單克隆抗體1D12、羊多克隆抗體8092由本實(shí)驗(yàn)室制備;非轉(zhuǎn)基因‘Williams和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆‘W-82系列由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗CP4EPSPS多克隆抗體8092由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司提供;雙組分TMB顯色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;脫脂奶粉購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司;HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)于Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

BioTek洗板機(jī)、BioTek酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯騰儀器有限公司;高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于日本日立公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1快速DAS-ELISA方法的建立

以CP4-EPSPS單克隆抗體1D12為捕獲抗體包被96孔酶標(biāo)板100μL/孔，40C靜置過(guò)夜，加入5%脫脂奶粉250μL/孔，37℃封閉1h;樣品用PBS緩沖液適當(dāng)稀釋后，充分研磨、離心、取上清液，將上清液與檢測(cè)抗體HRP標(biāo)記的多克隆抗體8092先后加入96孔酶標(biāo)板，各50μL/孔，37℃靜置孵育1h，以上每一步結(jié)束后96孔酶標(biāo)板用PBST洗3遍，拍干;加TMB顯色液90μL/孔，避光顯色5～15 min，加入2 mol/L H₂SO₂溶液45μL/孔終止反應(yīng)。以檢測(cè)樣品OD₁₅₀（P值）/陰性對(duì)照OD₁₅₀（N值）≥2.1判定為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。

試驗(yàn)重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性（轉(zhuǎn)Cp4 ep3-ps基因大豆葉片）、陰性（非轉(zhuǎn)基因大豆葉片）、空白（去離子水）3個(gè)對(duì)照。

1.3.2快速DAS-ELISA方法的優(yōu)化

以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 ep3-ps基因大豆葉片作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。采用矩陣滴定法優(yōu)化捕獲抗體和檢測(cè)抗體的工作濃度，以P/N最大值確定抗體工作濃度。運(yùn)用DAS-ELISA方法分別對(duì)捕獲抗體孵育時(shí)間、待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體共同孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以P/N最大值確定捕獲抗體孵育時(shí)間，同時(shí)分析P/N值，選擇合適的樣品與檢測(cè)抗體共同孵育時(shí)。

1.3.3快速DAS-ELISA方法檢測(cè)范圍的確定

用PBS將CP4-EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度從160μg/mL等比稀釋至0.078 125μg/mL，運(yùn)用優(yōu)化后的快速DAS-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)，繪制靈敏度曲線，得出快速DAS-ELISA方法的檢測(cè)范圍。

1.3.4檢測(cè)材料的優(yōu)化

根據(jù)1.3.3小節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)大豆葉片和籽粒進(jìn)行稀釋度優(yōu)化，采集非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒，葉片用PBS緩沖液（1g樣品：10 mL PBS）充分研磨后，用PBS緩沖液等比稀釋至1：20 000倍;籽粒處理方法同葉片，最終等比稀釋至1：640倍;12 000r/min離心5min，取上清液，運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)P/N值，得出葉片和籽粒檢測(cè)時(shí)的稀釋區(qū)間。

1.3.5重復(fù)性試驗(yàn)

運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)Cp4 epsps大豆葉片和種子各4份，每份材料3個(gè)技術(shù)重復(fù)，測(cè)定OD₁₅₀，分別計(jì)算板內(nèi)、板間變異系數(shù)。

1.3.6田間樣品檢測(cè)

試驗(yàn)田中隨機(jī)采集100份大豆植株葉片，用PBS緩沖液從1：10至1：320倍之間隨機(jī)稀釋，充分研磨，12 000r/min離心5 min，取上清液，運(yùn)用上述建立的快速DAS-ELISA方法對(duì)其檢測(cè)，同時(shí)利用Western blot方法檢測(cè)，以單抗1D12為一抗（1：5000稀釋），HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗（1：10000稀釋），對(duì)比二者檢測(cè)結(jié)果，并運(yùn)用建立的檢測(cè)方法對(duì)5粒非轉(zhuǎn)基因和15粒轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆籽粒進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證檢測(cè)方法效果。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析和Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 CP4-EPSPS蛋白快速DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立

采用矩陣滴定法篩選捕獲抗體和檢測(cè)抗體的最佳工作濃度（表1），當(dāng)捕獲抗體工作濃度為10 μg/mL，檢測(cè)抗體工作濃度為1. 25μg/mL時(shí)，P/N值最大，表明在此濃度下檢測(cè)效果最好，確定其為抗體最佳工作濃度。分別對(duì)捕獲抗體、待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體共同孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示，捕獲抗體最佳包被條件為37℃2h后4℃過(guò)夜;據(jù)圖2所示，當(dāng)待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體37℃共同孵育75min時(shí)，P/N值最大，但37℃孵育60 min和75 min時(shí)P/N值無(wú)顯著差異，本研究建立的檢測(cè)方法以快速定性為主，綜合考慮，確定樣品與檢測(cè)抗體最佳共同孵育條件為37℃孵育60 min。

1）P/N為檢測(cè)樣品OD₁₅₀/陰性對(duì)照OD₁₅₀。 P/N is the ratio of OD₁₅₀between sample and blank control.

2.2快速DAS-ELISA檢測(cè)范圍的確定

運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA方法對(duì)不同濃度CP4-EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，建立CP4EPSPS蛋白靈敏度曲線，如圖3所示，當(dāng)CP4-EPSPS蛋白濃度在0.3125～80μg/mL時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即該方法的檢測(cè)范圍。

2.3檢測(cè)材料的優(yōu)化

對(duì)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片、籽粒蛋白粗提液濃度進(jìn)行優(yōu)化，如表2所示，當(dāng)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片樣品稀釋10～5000倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，且稀釋80倍時(shí)P/N值最大，因此，確定葉片樣品稀釋區(qū)間為10～80倍;如表3所示，籽粒樣品稀釋10～320倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，為了便于操作，確定籽粒樣品稀釋區(qū)間為10～80倍。在該稀釋范圍內(nèi)，檢測(cè)效果較好，有利于快速定性檢測(cè)轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

運(yùn)用建立的快速DAS-ELISA方法對(duì)8份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示，8份樣品板內(nèi)變異系數(shù)為1. 64%～5. 42%，板間變異系數(shù)為3.05%～9.13%，變異系數(shù)均小于25%，表明建立的檢測(cè)方法穩(wěn)定性較好，符合ELISA定性試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)。

2.5田間樣品檢測(cè)緒果比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，100份檢測(cè)樣品中共計(jì)有53份樣品出現(xiàn)特異性免疫印跡，快速DAS-ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示（表5），共計(jì)檢測(cè)出53份陽(yáng)性樣品，對(duì)比兩種方法檢測(cè)結(jié)果，兩種檢測(cè)方法符合率為100%，對(duì)20份已知的大豆籽粒進(jìn)行檢測(cè)（W代表非轉(zhuǎn)基因大豆，C代表轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆），非轉(zhuǎn)基因大豆P/N值<2.1，轉(zhuǎn)基因大豆P/N值≥2.1，與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果比較檢測(cè)符合率為100%（表6）。

3討論

本研究以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒作為試驗(yàn)材料對(duì)快速DAS-ELISA工作條件進(jìn)行優(yōu)化，與使用重組蛋白作為試驗(yàn)材料相比，結(jié)果更真實(shí)可靠。蛋白免疫印跡雜交（West-ern-blot）是鑒定轉(zhuǎn)基因生物的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究以Western-blot檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)衡量快速DAS-ELISA的準(zhǔn)確性。對(duì)100份大豆樣品的檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，本研究建立的快速DAS-ELISA準(zhǔn)確率為100%。

為了縮短檢測(cè)時(shí)間，本研究?jī)?yōu)化了檢測(cè)方法。首先，檢測(cè)抗體經(jīng)HRP標(biāo)記，省去了酶標(biāo)二抗的反應(yīng)步驟：此外，將抗原孵育和檢測(cè)抗體孵育這兩步反應(yīng)合并為一步進(jìn)行，進(jìn)一步減少了檢測(cè)步驟。檢測(cè)過(guò)程僅需要兩步，將檢測(cè)時(shí)間縮短至75 min，目前，國(guó)外進(jìn)口試劑盒檢測(cè)時(shí)間在2. 5～3.5 h之間。本檢測(cè)方法中，樣品孵育超過(guò)30 min時(shí)，檢測(cè)結(jié)果即呈陽(yáng)性，因此在實(shí)際檢測(cè)中，孵育30 min可以作為樣品與抗體反應(yīng)最短時(shí)間。

在測(cè)定DAS-ELISA的檢測(cè)范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著CP4-EPSPS蛋白濃度等比例逐漸降低，P/N值呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況，是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍走^(guò)飽和時(shí)，部分蛋白沒(méi)有結(jié)合檢測(cè)抗體而與捕獲抗體直接結(jié)合，最終影響P/N值。

綜上所述，本研究建立的快速DAS-ELISA方法適用于轉(zhuǎn)Cp4 epsps基因大豆植株和種子的快速檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因后代材料的精準(zhǔn)鑒定和轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的監(jiān)管提供技術(shù)手段，該檢測(cè)方法是否適用于玉米、水稻等作物還有待于進(jìn)一步研究。