南瓜炭疽病菌Colletotrichum brevis porum生物學(xué)特性及藥劑防治

張琳　彭琳　邵郅偉等

中圖分類號(hào)：S 436. 429 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j. zwbh. 2020115

南瓜Cucurbita moschata是一種富含β-胡蘿卜素和抗衰老物質(zhì)的健康食物，并且南瓜在結(jié)籽期會(huì)產(chǎn)生豐富的礦物質(zhì)，比如鋅。南瓜原產(chǎn)墨西哥到中美洲一帶，明代傳入我國(guó)，現(xiàn)南北各地廣泛種植。炭疽病是南瓜上的一種重要病害，主要發(fā)生在南瓜的葉、莖、花等部位，造成爛葉、爛果或死苗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

以前，普遍認(rèn)為Colletotrichum orbiculare是引起瓜類炭疽病的病原菌，且在黃瓜、西瓜、長(zhǎng)瓜、蜜瓜和苦瓜上均發(fā)現(xiàn)該種炭疽病菌的危害。2015年，在‘綠皮香栗23號(hào)南瓜上，發(fā)現(xiàn)了與之不同的炭疽病菌Colletotrichum brevisporum。本試驗(yàn)對(duì)該病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并對(duì)13種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為該種瓜類炭疽病的預(yù)防和治療提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

南瓜炭疽病菌C.brevisporum（菌株編號(hào)為CCCM12）來(lái)源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理綜合治理實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)，病原菌以菌絲體的形式存于干燥濾紙片上，濾紙片置于滅菌硫酸紙袋內(nèi)保持密封和干燥，保存于-20℃。

1.2供試培養(yǎng)基

生物學(xué)特性測(cè)定所用培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂20g;查氏培養(yǎng)基，配方為氯化鉀0.5g，磷酸氫二鉀1g，硝酸鈉2g，硫酸鐵0.01g，七水合硫酸鎂0.5g，蔗糖30g，瓊脂20g，均用蒸餾水補(bǔ)足至1000mL備用。SNA培養(yǎng)基，配方為硝酸鉀0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，七水合硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，蔗糖0.2g，葡萄糖0.2g，瓊脂15g，蒸餾水補(bǔ)足至1000mL備用。

1.3試劑及儀器

試驗(yàn)采用日本TaKaRa公司生產(chǎn)的10 mmol/LdNTPs、Taq酶、PCR Buffer等;生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的25mmol/L MgCl₂;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)中使用的儀器為日本HITACHI公司生產(chǎn)的CT15RE臺(tái)式微量高速離心機(jī);基恩士（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)的超景深三維顯微系統(tǒng)VHX-600;美國(guó)BI0-RAD公司生產(chǎn)的C1000Touch Thermal cycler PCR擴(kuò)增儀。

1.4病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1病原菌寄主范圍測(cè)定

利用針刺接種法，供試南瓜炭疽病菌CCCM12在PDA上培養(yǎng)7d，用滅菌的8mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，選用儲(chǔ)藏期新鮮南瓜、辣椒Capsicum annuum、紫甘藍(lán)Brassica oleracea、火龍果Hylocereus undatus、西葫蘆Cucurbita pepo、青椒Capsicum annuum、黑布林Prunus salicina、紅布林Prunus salicina、大白菜Brassica rapa pekinen-sis、木瓜Chaenomeles sinensis、西瓜Citrullus lana-tus、甜瓜Cucumis melo、黃瓜Cucumis sativs和芒果Mangifera indica等14種供試植物進(jìn)行致病性測(cè)定。利用無(wú)菌針頭刺傷植物果實(shí)表面，取直徑為8mm的菌餅接種，在同一個(gè)植物組織的一半接種CCCM12菌餅，另一半接種空白PDA作為對(duì)照。每處理接種5個(gè)植物組織，3次重復(fù)，接種7d后觀察發(fā)病情況。

1.4.2病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定

將直徑為8mm的南瓜炭疽病菌CCCM12菌株菌餅接至無(wú)菌試管中，加入2 mL滅菌水，置于35、40、45、50、55、60℃的水浴中加熱10 min，然后接種于PDA平板中央，25℃光照培養(yǎng)，5d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.4.3溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

用打孔器打取直徑8mm的菌餅，接至PDA平板中央，分別在5、10、15、20、25、30、35、40℃的恒溫條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，并在5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.4.4光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

將直徑為8mm的病原菌菌餅接至PDA平板中央，將平板分別置于連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱中，25℃恒溫培養(yǎng)，5d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.4.5 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，向上述不同pH平板（15mL/皿）中移入菌餅（直徑8mm），25℃C恒溫培養(yǎng)。5d后，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.4.6碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用含等質(zhì)量碳元素的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油和甘露醇作為碳源，以不加碳源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每皿定量15mL培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，將直徑8mm的菌餅接至含不同碳源的平板上，25℃條件下培養(yǎng)5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.4.7氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用含等質(zhì)量氮元素的蛋白胨、牛肉膏、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、DL-甲硫氨酸、賴氨酸、硝酸鉀和硝酸銨作為氮源，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），每皿定量15mL培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，將直徑為8mm菌餅接至含不同氮源的平板上，25℃條件下培養(yǎng)5d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理接種5皿，每處理3次重復(fù)。

1.5藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

1.5.1供試菌株及藥劑

供試菌株為南瓜炭疽病菌CCCM12。供試藥劑共13種，均為原藥：97%醚菌酯，京博農(nóng)化科技有限公司;95%氟環(huán)唑，沈陽(yáng)科創(chuàng)化學(xué)品有限公司;95%腈菌唑、98%抑霉唑和96%咯菌腈，浙江禾本科技股份有限公司;95%福美雙，河北冠龍農(nóng)化有限公司;96%甲基硫菌靈，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司;99. 6%吡唑嘧菌酯，巴斯夫歐洲公司;95%苯醚甲環(huán)唑和95%百菌清，利民化工有限責(zé)任公司;98.3%戊唑醇，江蘇龍燈化學(xué)有限公司;97%多菌靈，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司;95%己唑醇，江蘇萊科化學(xué)有限公司。其中，咯菌腈、醚菌酯和吡唑嘧菌酯原藥用乙腈溶解，其余藥劑原藥用丙酮溶解，均配制成質(zhì)量濃度為1×10⁵mg/L的母液保存，用于室內(nèi)毒力測(cè)定。

1.5.2試驗(yàn)方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定13種供試藥劑對(duì)南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。將預(yù)先配制好的藥劑母液用0. 1%的Tween-80水溶液稀釋后，各濃度梯度的藥液以1：9（V/V）的體積比與溶化的PDA培養(yǎng)基混勻，制成不同濃度藥劑的PDA平板。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置6個(gè)復(fù)篩濃度（表1），以加入等量Tween-80水溶液的PDA平板為空白對(duì)照，以加入溶劑的Tween-80水溶液的PDA平板為溶劑對(duì)照。將直徑為8mm的菌餅接種到含藥平板中央，每個(gè)處理接種5皿，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率。

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.6數(shù)據(jù)分析

利用（Xfice 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)合DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件求出抑制中濃度（EC₅₀）、置信區(qū)間等，比較不同殺菌劑對(duì)南瓜炭疽病菌的抑制作用。利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1南瓜炭疽病菌CCCM12生物學(xué)特性測(cè)定

2.1.1寄主范圍測(cè)定結(jié)果

將南瓜炭疽病菌CCCM12采用針刺接種方法接種不同植物組織，7d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，炭疽菌CCCM12菌株對(duì)南瓜、辣椒、紫甘藍(lán)、火龍果、西瓜、香瓜、西葫蘆、青椒、黑布林、紅布林、大白菜、木瓜、黃瓜和芒果均有致病性（表2、圖1）。

2.1.2溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)南瓜炭疽病菌CCCM12生長(zhǎng)的影響顯著。菌絲在20～30℃生長(zhǎng)較好，其中25℃菌絲生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)5d后的菌落直徑為59.5mm; 5℃時(shí)，菌株CCCM12在第2天開(kāi)始生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)5d后的菌落直徑為18.5mm。

2.1.3光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

光照對(duì)南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長(zhǎng)影響顯著。南瓜炭疽病菌CCCM12在12h光暗交替條件下生長(zhǎng)較好，在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)5d，菌落平均直徑分別為55、62、65 mm（表3）。

2.1.4 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

測(cè)量菌落直徑，不同pH條件對(duì)南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲的生長(zhǎng)影響顯著。南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長(zhǎng)適宜pH為6～9，菌落直徑范圍為54～61mm。最適pH=9，病原菌菌落直徑達(dá)到61. 67 mm（圖3）。pH為10～12，或pH=3，菌落直徑<42mm。

2.1.5病原菌菌絲致死溫度的測(cè)定

使用不同溫度的水浴處理南瓜炭疽病菌CCCM12的菌餅，結(jié)果表明，菌餅在35～45℃水浴處理10 min后，置于PDA平板上培養(yǎng)，5d后均可長(zhǎng)出新的菌絲，而經(jīng)50、55、60'C處理下，培養(yǎng)10 d后仍未觀察到菌絲生長(zhǎng)，由此可知南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲的致死溫度為sooc、10min。

2.1.6碳氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

南瓜炭疽病菌CCCM12在7種不同碳源和9種不同氮源的培養(yǎng)基質(zhì)條件下都能夠生長(zhǎng)，但對(duì)不同碳、氮源的利用程度不同。在不同碳源中，病原菌對(duì)可溶性淀粉的利用效果最好，培養(yǎng)5d后菌落直徑為5. 17cm，顯著大于其他碳源處理，其次是甘油和葡萄糖，而對(duì)甘露醇、蔗糖、果糖和麥芽糖利用效果差。不同氮源中，菌株CCCM12對(duì)L-胱氨酸的利用效率最高，培養(yǎng)5d后的菌落直徑為2. 73cm，顯著大于其他氮源處理，其次為牛肉膏和DL甲硫氨酸，對(duì)硝酸銨利用效果較差，而對(duì)L-精氨酸利用效果最差，生長(zhǎng)緩慢（表4）。

2.2殺菌劑對(duì)南瓜炭疽病菌CCCM12的抑制活性

室內(nèi)生物活性測(cè)定表明（圖4和表5），南瓜炭疽病菌CCCM12對(duì)供試殺菌劑均有一定的敏感性，13種藥劑中，福美雙和百菌清對(duì)南瓜炭疽病菌的抑制效果較差，其EC50均大于20μg/mL（表5）。腈菌唑、己唑醇和吡唑醚菌酯對(duì)南瓜炭疽病菌的抑制效果一般，而多菌靈、抑霉唑、甲基硫菌靈毒力較高，EC₅₀分別為0.060 2、0.186 2、0.339 6μg/mL。

3討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于南瓜炭疽病菌研究的報(bào)道較少。人們普遍認(rèn)為Colletotrichum orbiculare是引起瓜類炭疽病的主要病原菌，寄主植物為西瓜、甜瓜和黃瓜等葫蘆科植物。而青皮南瓜作為C.brevispo-rum的寄主植物在2018年首次報(bào)道以來(lái)，其生物學(xué)特性及其藥劑防治研究尚未進(jìn)行。

在寄主范圍測(cè)定中，C.brevisporum除了可使葫蘆科南瓜、西葫蘆、西瓜、甜瓜等植物致病，也可使十字花科辣椒、紫甘藍(lán)、青椒、大白菜等植物，仙人掌科火龍果，薔薇科黑布林、紅布林致病，寄主范圍較廣泛。在炭疽菌屬中，C.gloeosporioides的寄主范圍廣泛，是引起多種經(jīng)濟(jì)作物炭疽病的病原菌，如芒果、枸杞、大棗和人參等的炭疽病，該種引起的病害一旦發(fā)生，防治特別困難，而C.brevisporum是與之完全不同的另一寄主范圍較廣泛的種，為了預(yù)防C brevisporum在田間暴發(fā)，本試驗(yàn)開(kāi)展其生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選研究。研究表明，C.brevisporum的菌絲生長(zhǎng)適宜pH為6～9，最適pH=9;光暗交替利于菌絲生長(zhǎng);適宜溫度20～30℃;致死溫度50℃，10 min;適宜菌絲生長(zhǎng)的最佳碳、氮源分別為可溶性淀粉和L-胱氨酸。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了13種殺菌劑對(duì)其的室內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)供試藥劑中效果較好的為多菌靈、抑霉唑和甲基硫菌靈。目前，南瓜炭疽病的發(fā)生范圍逐年擴(kuò)大，而篩選合適的化學(xué)農(nóng)藥迫在眉睫。本研究可為合理選擇田間化學(xué)農(nóng)藥及合適的施用濃度提供依據(jù)，并為今后研究該病的抗藥性機(jī)制提供理論依據(jù)。