解淀粉芽胞桿菌TS-12 03對蘋果炭疽葉枯病菌的抗生作用

朱娜　張樹武　徐秉良等

中圖分類號：S 436. 611. 12 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2020174

蘋果炭疽葉枯?。℅lomerella leaf spot）是蘋果樹近年來嚴(yán)重發(fā)生的一種病害。1988年，Leite等首次報道該病害是由病愿菌有性態(tài)圍小叢殼Glomerella cingulata，無性態(tài)膠孢炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides引起。該病害主要發(fā)生在‘金冠‘嘎啦和‘喬納金等蘋果品種的葉片上，還可危害‘金冠‘富士和‘秦冠等品種的果實。同時，該病害的病原菌寄主范圍較廣，可侵染1000多種植物，發(fā)生嚴(yán)重時可導(dǎo)致蘋果樹葉片快速干枯脫落，果面形成大量褐色圓形小斑點，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)和經(jīng)濟損失。目前，國內(nèi)外有關(guān)蘋果炭疽葉枯病的防治已有報道，主要以化學(xué)防治為主。宋梁棟等研究發(fā)現(xiàn)波爾錳鋅與代森錳鋅對蘋果炭疽葉枯病防效理想。韓文啟等發(fā)現(xiàn)波爾多液，溴菌腈與甲基硫菌靈與吡唑醚菌酯對蘋果炭疽葉枯病具有很好防效。但隨著化學(xué)藥劑長時間的大量使用，病原菌抗藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致防治效果大幅降低。Spalding等研究發(fā)現(xiàn)芒果炭疽菌對苯菌靈產(chǎn)生高水平抗性;陳聃等報道浙江省葡萄炭疽菌Colleto trichum gloeosporioides對甲基硫菌靈與乙霉威產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性。同時，化學(xué)殺菌劑的長期大量使用造成的農(nóng)藥殘留和生態(tài)環(huán)境污染問題也很嚴(yán)重。

鑒于化學(xué)防治存在的不足，急需尋求安全且對蘋果炭疽葉枯病高效的防治措施。因此，生物防治已成為國內(nèi)外蘋果炭疽葉枯病防治研究的新趨勢。張穎等研究表明，水楊酸可通過提高葉片中防御酶活性以及調(diào)節(jié)SA信號途徑相關(guān)基因的表達量，誘導(dǎo)‘嘎啦蘋果葉片對炭疽葉枯病的抗性。朱學(xué)明等的研究結(jié)果表明，內(nèi)生放線菌A-1對蘋果炭疽葉枯病的防效達70. 42%，但是目前應(yīng)用生防菌對蘋果炭疽葉枯病的防治主要集中于誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性，而且報道較少。因此，本試驗通過生防菌株解淀粉芽胞桿菌TS-1203對蘋果炭疽葉枯病菌菌落及孢子萌發(fā)抑制作用的室內(nèi)和離體測定，旨在為蘋果炭疽葉枯病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試病原菌和生防菌：蘋果炭疽葉枯病菌Glomerella cin.gulata和解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens（TS-1203）均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)實驗室提供。

1.2試驗方法

1.2.1 TS-1203菌液與發(fā)酵液制備

參考侯寶宏等的方法。將NA培養(yǎng)基上活化24 h的TS-1203菌株取一環(huán)接種于100 mL NB培養(yǎng)液中，置于黑暗，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)12 h后獲得種子液。取5 mL種子液接種于無菌NYBD培養(yǎng)基中，置于黑暗，28℃，180r/min振蕩48 h后得到菌液。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)4℃ 10000r/min，離心30 min，2次離心后將上清液用無菌的微孔濾膜過濾器（孔徑0. 22μm）過濾2次，最終獲得液體為發(fā)酵液無菌原液，4℃保存待用。

1.2.2 TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

采用濾紙片擴散法測定TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌抑制活性。將直徑為5 mm的濾紙片經(jīng)121℃滅菌25 min后干燥備用。然后，將經(jīng)滅菌的濾紙片置于TS-1203菌液中浸泡，待其完全浸濕后置于無菌超凈工作臺中晾干備用。同時，將25℃光照條件下培養(yǎng)5d的蘋果炭疽葉枯病菌菌餅（d=0.5 cm）接種于PDA培養(yǎng)基中央，沿菌餅四周等距離（距菌餅2cm處）放置4個浸有菌液的濾紙片，并置于25℃，L∥D=16 h∥8h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗以等距離浸有等量無菌水的濾紙片作為對照，且每個處理和對照均為3個重復(fù)。培養(yǎng)24、48、72、96 h后采用“十字交叉法”測定蘋果炭疽病菌的菌落直徑，并計算其抑菌率。培養(yǎng)96 h后，挑取處理和對照中的蘋果炭疽病菌的菌絲，比較和觀察其形態(tài)特征。

抑菌率=對照菌落直徑-處理菌落直徑/對照菌落直徑-0.5×100%。

1.2.3不同濃度rlrS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

采用菌落生長速率法測定。取0.1、0.2、0.5、1、2、3 mL發(fā)酵原液，分別加入19.9、19.8、19.5、19、18、17 ml_未冷卻的PDA中，其終濃度分別為0. 5%，1%、2.5%、5%、10%、15%。在病原菌菌落邊緣打取菌餅（d=0.5cm）將其接種于上述培養(yǎng)基中央，在25℃下光照培養(yǎng)。以加入與發(fā)酵原液等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)Sd后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算其抑菌率。

1.2.4 TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌孢子萌發(fā)的影響

用無菌水將炭疽葉枯病菌的分生孢子配制成1×10⁶個/ml_的孢子懸浮液備用。然后，將孢子懸浮液與發(fā)酵原液按1：1的比例混勻，取60μL均勻涂布于水瓊脂培養(yǎng)基，置于25 0C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以孢子懸浮液與無菌水按1：1的比例混勻為對照，分別于處理后6、12、18、24h觀察分生孢子形態(tài)，計算萌發(fā)抑制率及芽管生長抑制率。試驗共設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察5個視野。

1.2.5 TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

選取‘富士蘋果樹枝條前端完全展開的葉片，用1%次氯酸鈉溶液進行表面消毒30s，無菌水沖洗2～3次，在超凈工作臺上自然晾干，用滴有無菌水的無菌脫脂棉包裹葉柄基部。于葉面（直徑5 mm的圓形區(qū)域內(nèi)）采用“針刺法”進行傷口處理，刺傷部位避開葉片主脈，將發(fā)酵液均勻涂抹在葉片表面待風(fēng)干后將培養(yǎng)好的蘋果炭疽葉枯病菌菌餅（d=5 mm）接種于傷口處，試驗設(shè)無菌水處理作為對照，每個處理3個重復(fù)，于25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后觀察病斑擴展情況。接種5d后采用“十字交叉法”測量病斑大小，并計算抑制率。

抑制率=對照病斑直徑-處理病斑直徑/對照病斑直徑×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用SPSS軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1 TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

與對照相比，TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著的抑制作用（圖1）。處理24h時，TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑菌率為62. 5%，隨著時間延長抑菌率顯著增加，處理96 h的抑制率為70.4%（表1），蘋果炭疽葉枯病菌菌落生長至靠近濾紙片后菌絲停止向濾紙片方向生長（圖1a和b），而對照菌落生長正常，近乎長滿整個培養(yǎng)皿（圖1c和d）。

培養(yǎng)96 h后挑取處理組菌絲及對照菌絲觀察發(fā)現(xiàn)，對照菌絲生長正常（圖2a），而TS-1203菌液處理組菌絲出現(xiàn)畸形膨大（圖2b）和部分消解斷裂（圖2c）。

2.2不同濃度TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

不同濃度TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌生長具有顯著的抑制作用，而且隨著濃度的增加其抑制作用顯著增加（圖3）。與對照相比，經(jīng)濃度為0.5%、1%、2.5%、5%、10%、15%的TS-1203發(fā)酵液處理5d后的病原菌菌落直徑均顯著小于對照，隨著濃度增加其菌落直徑顯著減小，不同濃度之間存在顯著差異。當(dāng)TS-1203發(fā)酵液濃度為15%時，對蘋果炭疽葉枯病菌抑菌率最高，為59.0%（表2）。

2.3 TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌孢子萌發(fā)及芽管長度的影響

TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌分生孢子萌發(fā)和芽管的生長具有明顯的抑制作用。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵原液處理6h后分生孢子開始萌發(fā)，但芽管的生長受到顯著抑制（圖4A），而無菌水對照處理的孢子芽管長度是發(fā)酵原液處理的2倍（圖4a）。發(fā)酵原液處理12h后，孢子與對照處理（圖4b）相比芽管生長緩慢（圖4B）。隨著處理時間增加，發(fā)酵液處理與無菌水處理的孢子萌發(fā)率和芽管長度均增加，但發(fā)酵原液處理18 h后，病原菌的芽管明顯受到了抑制（圖4C），而對照芽管生長正常（圖4c）。發(fā)酵原液處理24h后，病原菌芽管出現(xiàn)粗細不均、生長緩慢的現(xiàn)象（圖4d），而無菌水處理的芽管生長速度較快且生長正常（圖4d）。

處理6、12、18和24 h后，發(fā)酵原液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制率均高于60%，其中處理6h的孢子萌發(fā)抑制率最低，為66. 7%;處理12h和18 h的孢子萌發(fā)抑制率分別為68. 2%和72.4%，處理24 h后孢子萌發(fā)抑制率最高，達78. 2%（表3）。隨著處理時間增加，對芽管生長抑制率逐漸增大，處理24h后芽管生長抑制率最高，為64. 3%（表4）。

2.4 TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制作用

經(jīng)TS-1203發(fā)酵液處理的蘋果離體葉片接種炭疽葉枯病菌后保濕培養(yǎng)3d后，蘋果葉片均未出現(xiàn)明顯病斑，5d后蘋果葉片發(fā)病但病斑面積較小，且擴展緩慢。而以無菌水作為對照處理的蘋果葉片發(fā)病較快，接種3d后葉片出現(xiàn)褐色病斑，發(fā)病率為100%，5d后出現(xiàn)不規(guī)則形褐色壞死斑，病斑直徑為18.4 mm;TS-1203發(fā)酵原液處理組發(fā)病輕且緩慢，5d后病斑直徑僅5.5 mm（圖5，表5）。同時，與對照相比，處理5d后，TS-1203發(fā)酵原液對蘋果炭疽葉枯病菌的抑制率高達70.1%（表5）。

3討論

解淀粉芽胞桿菌Bacillus

amylolique faciens-是一種安全且對逆境條件有良好耐受力和抵抗力的菌株，它與枯草芽胞桿菌極為相似，可作為根圍有益菌促進植物生長。同時也可以產(chǎn)生抗生素和抑菌蛋白等活性物質(zhì)抑制植物病原菌。陳成等報道解淀粉芽胞桿菌HN06對黑曲霉Aspergillus niger、稻瘟菌Magnaporthe oryzae、水稻紋枯菌Rhizoctonia solani和苦瓜枯萎病菌Fusarium orysporum f.sp.momdicae均有良好的抑制作用。陳士云等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌菌株CH-2不僅可以抑制油菜核盤菌Sclerotinia sclerotiorum菌絲的生長，而且能抑制菌核的形成。解淀粉芽胞桿菌的抑菌機理主要包括抑制菌絲生長使其菌絲畸形消融、變細，原生質(zhì)體滲漏，以及抑制孢子萌發(fā)。

關(guān)于解淀粉芽胞桿菌的抑菌作用，劉超等報道解淀粉芽胞桿菌菌株BA-26使灰葡萄孢Botrytiscinerea菌絲生長受阻、膨大變粗、并能抑制其孢子萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌TS-1203菌液對蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著地抑制作用（70.1%）;顯微觀察發(fā)現(xiàn)病原菌菌絲出現(xiàn)畸形、膨大、縊縮、斷裂等現(xiàn)象，表明解淀粉芽胞桿菌TS-1203可通過接觸病原菌菌絲使其菌絲不能正常生長從而達到抑制病原菌的作用。TS-1203發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌的孢子萌發(fā)以及芽管生長均具有顯著的抑制作用，且抑制率隨著發(fā)酵液濃度的增加而上升。不同時間段顯微觀察發(fā)現(xiàn)，TS-1203發(fā)酵液可導(dǎo)致病菌分生孢子萌發(fā)時間延遲、萌發(fā)率降低，芽管畸形、生長緩慢。隨著萌發(fā)時間的延長，孢子的萌發(fā)抑制率與芽管的生長抑制率也顯著增加。說明菌株TS-1203發(fā)酵液可通過抑制病原菌的孢子萌發(fā)及生長達到抑制病原菌的目的。李揚等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌ZJ01對棗黑斑病菌Alternaria alternata的抑制率達到53. 3%，且發(fā)酵液處理過的病原菌菌絲出現(xiàn)了頂端膨大、原生質(zhì)割裂、孢子萌發(fā)受抑制等現(xiàn)象。

另外，在芽胞桿菌對病斑擴展的抑制作用研究中，紀(jì)兆林等發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌Bacillus lichen-iformis W10對炭疽病菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)都有明顯的破壞或抑制作用，且對病斑擴展具有明顯的抑制作用。本試驗中TS-1203發(fā)酵液處理蘋果樹離體葉片并接種病原菌后發(fā)病遲緩且發(fā)病較輕，說明解淀粉芽胞桿菌可以有效地抑制植物病原菌的侵染并對離體葉片上的病斑擴展有顯著的抑制作用。

因此，本試驗研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌TS-1203菌株及其發(fā)酵液對蘋果炭疽葉枯病菌具有顯著的抑制作用，研究結(jié)果為后期的生物防治提供了基礎(chǔ)，但是對TS-1203菌株的抑菌機理和抑菌活性物質(zhì)的研究及TS-1203菌株在田間防治蘋果炭疽葉枯病尚需進一步研究。