紅茶菌發(fā)酵制備特色酸香型煙草浸膏

葉建斌，齊曉娜，張婷婷，孫福艷，楊宗燦，王高杰，張 展，艾 丹，劉文召，馮穎杰*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州 450016）

煙草浸膏是卷煙重要的香原料，可以提高煙草主體香氣，賦予卷煙更為自然、飽滿的香氣量，有效彌補國內(nèi)一些煙葉香味不足、特征香氣不突出的缺點[1-2]。通過對物理或化學(xué)法制備的煙草浸膏的研究表明[3-5]，這類煙草浸膏的香味成分基本來源于煙葉原料，香型特征一般受制于原料的種類。因此，此類煙草浸膏還無法滿足各企業(yè)的針對性需求。此外，卷煙中添加煙草浸膏后，雖然香氣量和勁頭有所提升，但由于煙堿的增加，煙氣對喉部的刺激感也有所增加。因此，如何制備一種既可提供新型香氣，又能解決煙堿對喉部刺激的煙草浸膏成為本領(lǐng)域亟須解決的技術(shù)難題。

近年來，生物產(chǎn)香技術(shù)在食品和煙草加工領(lǐng)域的應(yīng)用研究有不少報道。一些微生物或酶用于釀造、調(diào)味品、功能飲料、煙草等食品領(lǐng)域發(fā)酵后可產(chǎn)生讓人喜悅的特征性香味[6-8]，利用生物酶或微生物發(fā)酵技術(shù)處理煙草原料制備煙草浸膏的研究也有報道[9-12]。這些研究證實了酶或微生物在輔助制備特色煙草浸膏方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而尋找開發(fā)特色的生物材料是成功制備煙草浸膏的關(guān)鍵。

“紅茶菌”是一種民間傳統(tǒng)功能性茶飲料，其中包含有酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等益生菌。乳酸菌和酵母菌常用于煙草加工，以提升煙草原料的內(nèi)在品質(zhì)[13-15]。另外，發(fā)酵成熟的“紅茶菌”液中含有活的有益微生物，又含有其代謝產(chǎn)物，如茶多酚、氨基酸、維生素、有機酸、D-葡萄糖二酸-1，4內(nèi)酯等，可賦予良好的醫(yī)療保健功能[16]。應(yīng)用紅茶菌菌種進行發(fā)酵時，微生物自身生長代謝過程中可產(chǎn)生豐富的酶系，可能會分解轉(zhuǎn)化原料中某些成分而生成新的活性物質(zhì)，同時植物浸出物作為誘導(dǎo)物可刺激菌體產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，最終會使發(fā)酵液活性提高[17]。鑒于“紅茶菌”中的醋酸桿菌在發(fā)酵后可產(chǎn)生一定量的酸性物質(zhì)，而酵母和乳酸菌發(fā)酵煙草原料可以產(chǎn)生香氣物質(zhì)，作者利用紅茶菌發(fā)酵煙草浸提液，以期制備一種特色的酸香型煙草浸膏。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 紅茶菌：作者所在實驗室保存；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，磷酸二氫鈉4 g，檸檬酸 1.15 g，去離子水定容至1 L，121℃滅菌 10 min。

1.1.2 煙末與煙絲 煙末：收集自黃金葉生產(chǎn)制造中心某牌號卷煙退出煙末；試驗煙絲：黃金葉品牌二類卷煙葉組配方。

1.1.3 試劑 聚乙氧基月桂醚：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉：分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；二氯甲烷：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；乙酸苯乙酯：優(yōu)級純，北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；酒石酸鉀鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；次氯酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水楊酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 流動分析儀（AutoAnalyzer3）：德國布朗盧比公司產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890-5975C）：美國Agilent公司產(chǎn)品；恒溫恒濕箱 （KBF240）：德國Binder公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52AA）：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；氨基酸分析儀（Biochrom 30）：大昌華嘉商業(yè)有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（1260 Infinity ELSD）：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水式真空泵（SHL-D）：北京凱亞儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機（Hicen FR）：德國英雄實驗儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紅茶菌種子制備 作者所在實驗室保存的紅茶菌混合菌種在無菌環(huán)境下按接種體積分?jǐn)?shù)6%接種于種子培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d。

1.2.2 優(yōu)質(zhì)煙草浸膏制備工藝流程 煙草浸提液滅菌后接種紅茶菌種子液，根據(jù)紅茶菌特性[17-18]設(shè)置轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度30℃振蕩培養(yǎng)6 d。離心、過濾取上清液，70℃減壓濃縮至密度為（1.200±0.005）g/cm3，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇后放置于-20℃沉降24 h，離心取上清液，55℃減壓濃縮至密度為（1.200±0.005） g/cm3，得到優(yōu)質(zhì)煙草浸膏。

1.2.3 煙末水提優(yōu)化

1）單因素試驗設(shè)計 稱取一定量煙末按照比例與去離子水混合，恒溫水浴提取，離心后得到煙草浸提液。

A 為按照料液質(zhì)量體積比（g∶mL）分別為 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，60 ℃浸提2 h，檢測提取率和總糖質(zhì)量濃度；

B為料液質(zhì)量體積比 （g∶mL）為1∶12，分別在30、40、50、60、70、80、90、99 ℃下浸提 2 h，檢測提取率和總糖質(zhì)量濃度；

C 為料液質(zhì)量體積比（g∶mL）為 1∶12，在 60 ℃下分別提 取 15、30、60、90、120、180、240、300 min，檢測提取率和總糖質(zhì)量濃度。

綜合考慮提取率和總糖質(zhì)量濃度，確定最佳料液比、浸提溫度和浸提時間。浸提液提取率：煙末提取前烘干稱質(zhì)量記為W0，煙末提取后烘干稱質(zhì)量記為W1，浸提液離心后沉淀烘干稱質(zhì)量記為W2，浸提液提取率R=（W0-W1-W2）/W0。 浸提液總糖質(zhì)量濃度：連續(xù)流動分析法檢測[19]。

2）響應(yīng)面法對水提條件的優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken原理，以料液比（A）、浸提溫度（B）和浸提時間（C）為自變量，提取率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。應(yīng)用Design Expert10軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行回歸及方差分析，確定各個因素的顯著性。

表1 因素水平Table 1 Factor levels

1.2.4 香味成分分析

1）前處理 量取1 g發(fā)酵后的煙草浸膏加入10 mL二氯甲烷中，并加入質(zhì)量濃度為1.032 mg/mL的乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)，常溫振蕩混合1 h，靜置后

2）GC-MS分析條件 色譜柱：DB-5MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm） ；進樣溫度：250 ℃；分流比：5∶1；延遲：5 min；載氣：He；載氣流量：1 mL/min；升溫程序：50℃（1 min） 以 5℃ /min升至 250℃（5 min）；傳輸線溫度：270℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：35～600 AMU；圖譜庫：NIST11。

1.2.5 感官評價 參比卷煙為黃金葉未加香加料卷煙，以未加任何香料的卷煙為空白（CK），未經(jīng)發(fā)酵的煙草浸膏（其余步驟和條件與紅茶菌發(fā)酵后的煙草浸膏的制備方法完全相同）添加的卷煙作為對照（T0），加入紅茶菌發(fā)酵的煙草浸膏的卷煙為試驗組（T1）。煙草浸膏添加量為50 μg/g，混勻后于溫度22℃、濕度65%環(huán)境中平衡48 h，卷制成卷煙。對卷煙進行評價時，總共11個指標(biāo)，每個指標(biāo)滿分5分，滿分55分，空白統(tǒng)一要求按照3分打，總計33分。共7位評委打分，對所有評委評分計算平均分?；诶走_圖的感官質(zhì)量評價步驟如下：1）評價數(shù)據(jù)前期處理，包括數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和數(shù)據(jù)變換；2）繪制雷達圖；3）利用雷達圖綜合評價法對卷煙感官質(zhì)量進行定量評價。倒入分液漏斗，取有機相。重復(fù)萃取5次，合并有機相，經(jīng)旋蒸濃縮至體積為2～5 mL之間，測量濃縮后體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙末水提條件優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗 浸提物含量的多少直接影響后續(xù)制備煙草浸膏的品質(zhì)，其中浸提率和糖質(zhì)量濃度是考察浸提效果的兩個重要指標(biāo)。作者對浸提料液比、浸提時間和溫度進行單因素實驗，結(jié)果見圖1-3。隨著料液質(zhì)量體積比的降低，煙末浸提率呈現(xiàn)明顯上升趨勢。在料液質(zhì)量體積比為1∶12時，提取率為31.66%，糖質(zhì)量濃度為9.86 g/L，之后隨浸提率上升，提取率和糖質(zhì)量濃度提升不明顯。由于含水量的增加，浸提液中糖質(zhì)量濃度整體呈現(xiàn)下降的趨勢。料液質(zhì)量體積比過高，煙末提取率低，料液質(zhì)量體積比過低則導(dǎo)致糖質(zhì)量濃度降低。另外，浸提液中過高的含水量會提高后期濃縮成本。因此，綜合考慮浸提率和工藝成本，可選擇1 g∶12 mL作為最佳料液比。

圖1 料液質(zhì)量體積比對浸提效果的影響Fig.1 Influence of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency

圖2 浸提溫度對浸提效果的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on extraction efficiency

圖3 浸提時間對浸提效果的影響Fig.3 Influence of extraction time on extraction efficiency

進一步考察浸提溫度對浸提效果的影響，可以看出，隨著溫度的升高，浸提率和糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。浸提溫度低于60℃時，糖質(zhì)量濃度上升幅度較高。浸提溫度為60℃時，提取率為52.33%，糖質(zhì)量濃度為11.16 g/L。在溫度為60～90℃區(qū)間隨著溫度升高，糖質(zhì)量濃度增加不明顯。綜合考慮浸提成本和浸提效果，選擇60℃為最優(yōu)浸提溫度。

隨著浸提時間的增加，提取率和糖質(zhì)量濃度呈逐漸上升的趨勢。浸提時間在0～2 h時，提取率和糖質(zhì)量濃度增加明顯。浸提時間為2 h時，提取率高達55.34%，糖質(zhì)量濃度為13.14 g/L。之后隨著浸提時間的增加，糖質(zhì)量濃度緩慢增加，提取率保持穩(wěn)定，故浸提時間2 h為最優(yōu)。綜上，料液比和浸提時間對浸提效果的影響較大，浸提溫度對浸提效果的影響較小。

2.1.2 響應(yīng)面實驗 以料液質(zhì)量體積比、浸提溫度和浸提時間為自變量，以提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析，確定3種不同因素對提取效率的影響程度，結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

對表2的結(jié)果進行多元回歸擬合及方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significant test

由表3可知，模型的 P值小于 0.05，表明該模型回歸顯著；失擬項 P值為0.748 198＞0.1，表明該項檢驗不顯著，該實驗方法可靠。該模型的決定系數(shù)R2=0.933 7，表明模型在93.37%程度上能夠解釋提取率與變量之間的關(guān)系。對提取率進行二次多項回歸擬合分析，可得到Y(jié)（提取率）對A（浸提時間）、B（料液比）、C（浸提溫度）的二次多項回歸方程：

Y=45.87-0.47A+0.42B-0.12C+0.18AB+0.19AC+0.17BC-1.81A2-1.43B2+0.15C2。

為了更加直觀地觀察各因素間的交互作用，利用Design-Expert軟件做出回歸方程中交互的響應(yīng)曲面圖，見圖 4（a）—（c）。 可以看出，3 個因素對提取率影響的先后順序為浸提時間、料液質(zhì)量體積比、浸提溫度。因此，嚴(yán)格控制浸提時間和料液比是保證水提效果的關(guān)鍵。運行軟件的期望函數(shù)優(yōu)化程序，以提取率達到最大值為目標(biāo)，獲得優(yōu)化水提工藝參數(shù)為：浸提時間1.823 5 h、料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12.156、浸提溫度 60 ℃，預(yù)測提取率可達到46.209 7%，見圖4（d）。考慮到實際操作的局限性，選取浸提時間 2 h、料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12、浸提溫度60℃為最優(yōu)水提條件，這一結(jié)論進一步驗證了單因素實驗條件優(yōu)化的結(jié)果。

圖4 響應(yīng)面優(yōu)化確定煙草浸提最優(yōu)條件Fig.4 Optimal conditions for tobacco extraction were determined by response surface optimization

2.2 煙草浸膏香味成分分析

以上述最優(yōu)條件下浸提獲得的煙草浸提液為底物，利用紅茶菌進行發(fā)酵。結(jié)果表明：經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，煙草浸膏香味成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加明顯。其中，香味物質(zhì)種類由39種增加到70種（表格未全列出），部分特征性香味物質(zhì)列于表4。

表4 煙草浸膏發(fā)酵前后主要香味成分變化Table 4 Changes of main aroma components of tobacco extract before and after fermentation

與未發(fā)酵煙草浸膏相比，大部分酸類香味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵浸膏中顯著增加。其中苯乙酸發(fā)酵后質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到141.95 μg/g，苯乙酸具有香葉和玫瑰樣的香氣，而且天然存在于煙草中，因此常作為煙用香精[20]。發(fā)酵后還新增了3-甲基丁酸、乳酸、丁二酸、戊二酸、2-甲基己酸等有機酸，有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高可以有效緩解煙堿對喉部的刺激感。其中乳酸帶有輕微的酸氣和味道，在煙草中常用作調(diào)味劑，可提調(diào)香氣，改善刺激性和辛辣雜味；3-甲基丁酸能在煙草制品中增添酒味、水果和乳酪樣甜香味道。丁二酸、2-甲基己酸、香草酸等都是國標(biāo)允許的煙用或食用香料，有利于提升煙草品質(zhì)[20]。此外發(fā)酵后的煙草浸膏中還增加了高級脂肪酸，如9，12-十八碳二烯酸、α-亞麻酸、硬脂酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加到 22.45、24.72、36.24 μg/g。 這些酸性物質(zhì)的提高可能與紅茶菌中的醋酸桿菌及乳酸菌發(fā)酵相關(guān)。之前有研究表明，具有香氣的煙葉，酸性組分含量高；缺乏香氣的煙葉，酸性組分含量低。因此，通過紅茶菌發(fā)酵后的煙草浸膏是一種具有酸香特征煙用香料。

另外，巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、麥芽酚等煙草特征香味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有所增加，發(fā)酵后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：31.54、20.17、5.83、6.30 μg/g。巨豆三烯酮有甜潤而又持久的煙草樣香氣和干果香氣，具有煙草香和辛香底蘊，是煙草中重要的香味成分。β-大馬酮具有濃而甜潤的花香，在煙草中能使卷煙香氣甜醇，改善粗劣氣，增加天然感和厚實感。β-紫羅蘭酮有紫羅蘭花香氣，在卷煙中可以增強清甜香韻。麥芽酚具有甜香味的增效作用，能與煙草香味諧和，使煙氣吸味有柔和醇厚的口感[20]。2，3-丁二醇、1-（2-呋喃基）乙二醇、1-羥基-2-丙酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，分別增加592.45%、686.67%、172.67%。2，3-丁二醇可以賦予煙氣清香，羥基丙酮可以使煙氣更加柔順、賦予煙氣酒香。發(fā)酵后新增α-苯甲基-苯乙醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭酮等香氣物質(zhì)，都是可以明顯提高煙草酸香氣息和果香嗅香的重要香氣物質(zhì)。研究結(jié)果表明，浸提液發(fā)酵后香味物質(zhì)明顯增多，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物增加，推測紅茶菌發(fā)酵浸提液可以促進美拉德反應(yīng)的發(fā)生。已知美拉德反應(yīng)是在中性和微酸性條件下進行的[21-23]，而紅茶菌發(fā)酵會產(chǎn)生大量有機酸，正好提供酸性環(huán)境。

2.3 卷煙感官評價

對制備的卷煙進行感官評價，評吸結(jié)果計算平均分，見表5。CK為空白組，T0為對照組（添加未發(fā)酵煙草浸膏），T1為實驗組（添加發(fā)酵煙草浸膏）。由表5可知，加入紅茶菌發(fā)酵得到的煙草浸膏后，雜氣減輕，潤感提升，香氣質(zhì)、香氣量、回甜、余味等均有提高。

表5 卷煙評吸結(jié)果平均值Table 5 Average value of cigarette smoking evaluation results

以上述數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過雷達圖進一步分析卷煙感官質(zhì)量的改進。從圖5可看出，CK的濃度較高，其余各指標(biāo)明顯低于T0和T1，香氣質(zhì)、香氣量等指標(biāo)較低，其感官質(zhì)量較差。T0的大部分指標(biāo)高于CK，但低于T1，其中余味、勁頭、刺激性等指標(biāo)較低。T1各指標(biāo)值較為接近，可見其指標(biāo)比較協(xié)調(diào)，其感官質(zhì)量要優(yōu)于其他兩個樣品。為了比較各樣品間感官質(zhì)量指標(biāo)的差異大小，根據(jù)圖5計算出雷達圖的特征量。雷達圖面積為 S，邊長平方和為L。3個卷煙樣品雷達圖S和L的值分別為：

圖5 樣品感官質(zhì)量評價雷達圖Fig.5 Radar chart of sensory quality evaluation of sample

樣品 CK的 S=2.284，樣品 T0的 S=4.078，樣品T1的 S=11.797；樣品 CK 的 L=11.323，樣品 T0的 L=17.907，樣品 T1的 L=48.255。

3 結(jié) 語

利用紅茶菌發(fā)酵煙草浸提液，經(jīng)濃縮制備酸性特征煙草浸膏，對其提取工藝進行優(yōu)化，開展浸膏香味成分分析并應(yīng)用于卷煙進行感官評價，得到結(jié)論如下：

1）優(yōu)化結(jié)果顯示，煙末水提的最優(yōu)條件為料液質(zhì)量體積比（g∶mL）1∶12，60 ℃恒溫提取 2 h，煙草浸提液提取率和含糖質(zhì)量濃度可分別達到55.34%、13.14 g/L；

2）經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，浸提液中酸性香味成分的種類和含量增加明顯，巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、麥芽酚等煙草特征香味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有提高；

3）紅茶菌發(fā)酵制備得到的煙草浸膏具有酸香性質(zhì)，將其添加到卷煙中，香氣質(zhì)、香氣量等均有提高，并明顯優(yōu)于未發(fā)酵煙草浸膏。