碳氮源優(yōu)化提高兼養(yǎng)三角褐指藻生物量和巖藻黃素產(chǎn)量

王 珊，楊潤(rùn)青，宋培欽，魏 東

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

巖藻黃素（fucoxanthin）是一種廣泛存在于大型褐藻、硅藻和金藻等海洋藻類中的類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗腫瘤、減肥、預(yù)防阿茲海默癥、調(diào)節(jié)血糖和血脂等多種生物活性[1]，在生物醫(yī)藥、功能性食品等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。目前，巖藻黃素的主要商業(yè)來(lái)源是從海帶等大型褐藻中提取，提取物中巖藻黃素含量低、生產(chǎn)成本高、藻油穩(wěn)定性差、生產(chǎn)受季節(jié)性局限等固有缺陷，無(wú)法滿足快速增長(zhǎng)的國(guó)際市場(chǎng)需求。

海洋硅藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者，其胞內(nèi)巖藻黃素的含量是大型褐藻的上百倍[2]，被認(rèn)為是藻基巖藻黃素的新來(lái)源。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一種生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)的海洋硅藻，可進(jìn)行利用CO2的光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，也可利用外源有機(jī)碳氮源（甘油、醋酸鈉、蛋白胨、尿素等）進(jìn)行兼養(yǎng)（光發(fā)酵）生長(zhǎng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，與其它有機(jī)碳源（如葡萄糖、果糖、甘露糖等）相比，以甘油為有機(jī)碳源兼養(yǎng)培養(yǎng)三角褐指藻可以獲得最大生物量和色素含量[5]。在半連續(xù)補(bǔ)料模式下，以0.14 mol/L甘油為碳源對(duì)三角褐指藻進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)，生物量產(chǎn)率最高可達(dá)1.50 g/（L·d）；在分批補(bǔ)料模式下，添加0.10 mol/L甘油時(shí)胞內(nèi)類胡蘿卜素含量達(dá)到最高，約占干質(zhì)量的0.45%[4]。與自養(yǎng)相比，以甘油為有機(jī)碳源的兼養(yǎng)培養(yǎng)可顯著提高三角褐指藻的生物量，但胞內(nèi)類胡蘿卜素含量普遍偏低，其中巖藻黃素的含量更低[5]，亟須開發(fā)有效手段在兼養(yǎng)培養(yǎng)中提高巖藻黃素的含量。

巖藻黃素是海洋硅藻的重要捕光色素，它與蛋白質(zhì)和葉綠素組成FCP復(fù)合物，共同存在于光合膜系統(tǒng)[6]。氮素是海洋硅藻中參與蛋白質(zhì)和葉綠素合成的重要營(yíng)養(yǎng)元素，尿素循環(huán)在硅藻氮代謝途徑中至關(guān)重要[7]。三角褐指藻可利用多種氮源進(jìn)行快速生長(zhǎng)并積累巖藻黃素。有研究發(fā)現(xiàn)，尿素可顯著促進(jìn)三角褐指藻生物量積累，但對(duì)巖藻黃素積累無(wú)顯著促進(jìn)作用[8]。以云杉水解物（葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)2.00 g/L）為碳源、酵母提取物 （總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.60%）為氮源培養(yǎng)三角褐指藻，可獲得最大生物量和巖藻黃素產(chǎn)量分別為3.31 g/L和0.52 mg/L[9]。另有研究[10]發(fā)現(xiàn)，在f/2培養(yǎng)基中添加10倍的硝酸鈉培養(yǎng)三角褐指藻，可獲得最高巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.20 mg/g。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在氮充足條件下多數(shù)編碼巖藻黃素合成的基因會(huì)被上調(diào)，從而促進(jìn)巖藻黃素的積累[11]。因此，充足的氮源濃度與合適的氮源種類是促進(jìn)三角褐指藻中巖藻黃素積累的必要條件。

目前對(duì)于三角褐指藻兼養(yǎng)培養(yǎng)的研究大多集中在油脂生產(chǎn)方面，關(guān)于兼養(yǎng)條件下巖藻黃素的高效生產(chǎn)的報(bào)道極少。作者以三角褐指藻為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究兼養(yǎng)條件下有機(jī)碳源（甘油）濃度、氮源種類及濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、生物量和巖藻黃素積累的影響，篩選獲得優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)策略，為利用三角褐指藻高效生產(chǎn)巖藻黃素提供新技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

三角褐指藻藻株CCMP 2561由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所胡晗華研究員惠贈(zèng)。藻種用f/2人工海水培養(yǎng)基[12]，在恒溫光照培養(yǎng)箱（溫度：20℃，光照強(qiáng)度：2 000 lx）中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，于4℃ 冰箱中保存。

1.2 試劑與儀器

巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；胰蛋白胨：購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；總氮試劑：購(gòu)于美國(guó)HACH公司；乙腈、叔丁基甲醚、甲醇：色譜純，購(gòu)于廣州卯林儀器有限公司；甘油、尿素、硝酸鈉、丙酮等：均為分析純，購(gòu)于廣州卯林儀器有限公司；1339R型光照強(qiáng)度測(cè)定儀：購(gòu)于臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司；DRB200型消解器：購(gòu)于美國(guó)HACH公司；BD Accuri C6型流式細(xì)胞儀：購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司；Modulyod冷凍干燥機(jī)：購(gòu)于美國(guó)熱電公司；6890-5975型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技有限公司；TDL-4013型高速離心機(jī)：購(gòu)于上海安享科學(xué)儀器廠。

1.3 研究方法

1.3.1 種子液制備 從改良的f/2培養(yǎng)基 （表1）[13]斜面上挑取三角褐指藻藻苔，接種至含有已滅菌改良的f/2培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，置于持續(xù)光照的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（20±1） ℃，冷白日光燈光照強(qiáng)度為（2 000±500） lx，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)10 d。

表1 改良的f/2培養(yǎng)基組成Table 1 Composition of modified f/2 medium

1.3.2 甘油濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)量的影響 將培養(yǎng)好的三角褐指藻種子液轉(zhuǎn)接至新的f/2培養(yǎng)基，以硝酸鈉為氮源（含氮量0.01 mol/L），加入不同濃度甘油為有機(jī)碳源，濃度分別設(shè)置為 0、0.05、0.10、0.15 mol/L。 控制初始細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，調(diào)節(jié) pH 8.0，每組 3個(gè)平行樣，在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，冷白日光燈光照強(qiáng)度為（2 000±500）lx，轉(zhuǎn)速 150 r/min，培養(yǎng)10 d。每?jī)商烊?，測(cè)定三角褐指藻細(xì)胞密度。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測(cè)定其生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集剩余藻液，并于5 000 r/min離心3 min，棄上清液，將藻泥進(jìn)行真空冷凍干燥以獲得藻粉，藻粉于-20℃冰箱中儲(chǔ)存作后續(xù)分析檢測(cè)使用。

1.3.3 氮源種類對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)量的影響 將培養(yǎng)好的三角褐指藻種子液轉(zhuǎn)接至新的無(wú)氮f/2培養(yǎng)基，以0.10 mol/L甘油為碳源，分別加入不同種類的氮源 （硝酸鈉0.85 g/L、尿素 0.30 g/L、胰蛋白胨 1.17 g/L），使總氮濃度均為0.01 mol/L。其余培養(yǎng)條件和分析測(cè)試同1.3.2。

1.3.4 胰蛋白胨濃度對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)及巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)量的影響 將培養(yǎng)好的三角褐指藻種子液轉(zhuǎn)接至新的無(wú)氮f/2培養(yǎng)基，以0.10 mol/L甘油為碳源，分別加入不同質(zhì)量濃度胰蛋白胨（0.58、1.17、1.75、2.33 g/L）為氮源，使含氮量分別達(dá)到 0.005、0.010、0.015、0.020 mol/L，其余培養(yǎng)條件和分析測(cè)試同1.3.2。

1.3.5 混合氮源對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)量的影響 將培養(yǎng)好的三角褐指藻種子液轉(zhuǎn)接至新的無(wú)氮f/2培養(yǎng)基，以0.10 mol/L甘油為碳源，加入不同種類氮源，分別設(shè)置純胰蛋白胨（2.33 g/L）、胰蛋白胨：尿素（1.17 g/L 和 0.30 g/L，含氮量 1∶1）、胰蛋白胨：硝酸鈉（1.17 g/L 和 0.85 g/L，含氮量1∶1）?；旌系窗吹饶柡?∶1進(jìn)行混合，總氮濃度為0.02 mol/L，其余培養(yǎng)條件和分析測(cè)試同1.3.2。

1.4 分析測(cè)試

1.4.1 細(xì)胞密度 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞密度測(cè)定。吸取2 mL三角褐指藻培養(yǎng)液于2 mL離心管中離心，去除上清液，用超純水洗滌、重懸至上機(jī)濃度（約 1×106個(gè)/mL～5×106個(gè)/mL），經(jīng) 300 目尼龍篩絹過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞密度絕對(duì)計(jì)數(shù)[14]。

1.4.2 生物量 采用烘干差重法測(cè)定生物量。測(cè)量已烘至恒質(zhì)量的離心管質(zhì)量，記為空管質(zhì)量M1。吸取2 mL藻液于該離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄上清液，蒸餾水洗滌離心兩次后將藻泥置于烘箱中，80℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定并記錄總質(zhì)量M2。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差[15]。

1.4.3 比生長(zhǎng)速率 以生物量計(jì)算比生長(zhǎng)速率μ（d-1）[16]，比生長(zhǎng)速率計(jì)算公式如下：

式中：W2、W1分別是在 t2、t1時(shí)測(cè)定的生物量，g/L。

1.4.4 培養(yǎng)基總氮質(zhì)量濃度 培養(yǎng)基總氮質(zhì)量濃度采用哈希DR2700分光光度計(jì)測(cè)定[17]，配套試劑為No.2714100。取待測(cè)培養(yǎng)基上清液，稀釋質(zhì)量濃度至總氮為2～150 mg/L，加入配套試劑后在消解器DRB200上105℃消解30 min。消解完成后冷卻至室溫，加入粉劑包（TNA、TNB）反應(yīng) 5 min 后，用分光光度計(jì)DR2700進(jìn)行測(cè)定，直接讀出總氮質(zhì)量濃度。

1.4.5 巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù) 將準(zhǔn)確稱量的藻粉10 mg裝入有陶瓷珠的凍存管中，加入事先預(yù)冷的提取溶劑（V甲醇∶V丙酮=1∶1），用量為 1 mL/次，凍存管在細(xì)胞破碎振蕩器上振蕩30 s，用液氮浸提5 min，離心收集上清液于15 mL離心管中，多次反復(fù)提取直至藻粉變成白色[18]。合并所有上清液，在通風(fēng)櫥內(nèi)用氮?dú)饬鲗㈦x心管內(nèi)有機(jī)溶劑吹干，用甲醇和叔丁基甲醚（MTBE）混合液（體積比 1∶1，含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%BHT）準(zhǔn)確定容至1 mL，用于巖藻黃素的HPLC分析，全程在無(wú)光或弱光條件下進(jìn)行。

巖藻黃素采用HPLC測(cè)定 （HPLC系統(tǒng)采用Waters雙1525泵和2996二極管陣列檢測(cè)器）：采用YMC色譜柱（Carotenoid column C 30柱，4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相流速為 0.80 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。PDA檢測(cè)器上設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm，測(cè)定巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。流動(dòng)相由甲醇（A）和叔丁基甲醚MTBE（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件為：0～6 min，95%→80%A、5% →20%B；6～12 min，80%→60%A、20%→40%B；12～19 min，60%→55%A、40%→45%B；19～20 min，55%→95%A、45%→5%B；20～23 min，95%A、5%B。以巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和可見光特征吸收光譜進(jìn)行定性，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)色譜圖中巖藻黃素峰進(jìn)行定量分析[13]，計(jì)算藻粉中的巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/g）。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 9.0和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析法和成對(duì)數(shù)據(jù)t-檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，不同字母之間表示顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘油濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響

甘油濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖1。由圖1可知，與自養(yǎng)培養(yǎng)（甘油為0 mol/L）相比，添加甘油濃度為 0.05、0.10、0.15 mol/L，可顯著提高三角褐指藻的細(xì)胞密度（P＜0.05）。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，0.15 mol/L甘油條件下細(xì)胞密度及比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，分別為1.72×108個(gè)/mL和0.26 d-1，是自養(yǎng)的 1.35 倍和 1.18 倍（P＜0.05），見表2。如圖1所示，隨著甘油濃度的增加，藻細(xì)胞的生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)出先升高、后下降的變化趨勢(shì)。在0.10 mol/L甘油濃度下，生物量和產(chǎn)率、巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量分別達(dá)到最高值，比自養(yǎng)分別提高了 30.40%、43.49%、200.00% 和291.52%。

圖1 甘油濃度對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度、生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of glycerol concentrations on thecell density，biomassconcentration and fucoxanthin content in P.tricornutum

表2 甘油濃度對(duì)三角褐指藻生產(chǎn)性能的影響Table 2 Production capability of P.tricornutum under different glycerol concentrations

Ceron Garcia等人利用0.10 mol/L甘油培養(yǎng)三角褐指藻，可以獲得最大的生物量產(chǎn)率為168.96 mg/（L·d），是自養(yǎng)條件下的 7 倍[5]。 Liu 等人發(fā)現(xiàn)三角褐指藻在0.10 mol/L甘油的平均比生長(zhǎng)速率和生物量分別是光自養(yǎng)條件下的1.64倍和1.60倍[3]，均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。通過(guò)同位素標(biāo)記法，利用13C-甘油研究三角褐指藻中甘油的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)甘油通過(guò)消耗光合磷酸化產(chǎn)生的ATP代謝為磷酸二羥丙酮（DHAP）和 3-磷酸甘油醛（GAP），并進(jìn)入卡爾文循環(huán)參與中心碳代謝[19]。這表明在兼養(yǎng)條件下，三角褐指藻可以通過(guò)質(zhì)體和線粒體之間廣泛的能量交換將呼吸作用和光合作用耦合在一起，從而驅(qū)動(dòng)三角褐指藻中CO2和有機(jī)碳的同化[19-20]。研究還發(fā)現(xiàn)，在混養(yǎng)條件下，胞內(nèi)50%氨基酸合成的碳骨架來(lái)源于甘油代謝[19]，這可能導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的高效積累，從而促進(jìn)巖藻黃素合成。本研究結(jié)果表明，選取甘油濃度為0.10 mol/L為最適甘油濃度，可促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)和提高巖藻黃素的產(chǎn)量。

2.2 氮源種類對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響

不同種類氮源對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響見圖2。由圖2（a）可知，相對(duì)于等摩爾氮素的硝酸鈉和尿素，細(xì)胞利用胰蛋白胨進(jìn)行生長(zhǎng)的延滯期縮短了2 d。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為1.21×108個(gè)/mL，分別是硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)的2.16倍3.00倍 （P＜0.05）。同時(shí)，平均比生長(zhǎng)速率為0.39 d-1，顯著高于硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)（P＜0.05），見表3。梁英等人發(fā)現(xiàn)，在自養(yǎng)條件下以尿素為氮源培養(yǎng)三角褐指藻，其平均比生長(zhǎng)速率顯著高于硝酸鈉和氯化銨（P＜0.05），這表明有機(jī)氮源可以顯著促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)[21]。如圖2（b）和表3所示，胰蛋白胨為氮源時(shí)，生物量和產(chǎn)率、巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量都達(dá)到最高值，顯著高于硝酸鈉和尿素為氮源時(shí)（P＜0.05）。

圖2 氮源種類對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻細(xì)胞密度、生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on cell density，biomass concentration and fucoxanthin content inmixotrophic P.tricornutum

表3 氮源種類對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻的生產(chǎn)性能的影響Table 3 Production capability of mixotrophic P.tricornutum under different nitrogen sources

張文源等人發(fā)現(xiàn)在自養(yǎng)條件下以尿素為氮源時(shí)，三角褐指藻的生物量顯著高于硝酸鈉條件下，但巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異[8]。有研究表明，微藻細(xì)胞在相同條件下吸收利用尿素所需的能量消耗比硝酸鹽更少，因此尿素可顯著促進(jìn)三角褐指藻的生物量積累[7]。三角褐指藻在尿素條件下的生物量與硝酸鈉無(wú)顯著性差異，見圖2（b）。這可能是因?yàn)樵诩骛B(yǎng)條件下以甘油為碳源時(shí)，三角褐指藻細(xì)胞通過(guò)甘油代謝產(chǎn)生大量的ATP和NADPH，為硝酸鹽的轉(zhuǎn)化提供能量與還原力，從而促進(jìn)了三角褐指藻對(duì)硝酸根的吸收，導(dǎo)致尿素作為有機(jī)氮源的優(yōu)勢(shì)并不明顯。同時(shí)，巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在硝酸鈉和尿素條件下無(wú)顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。研究中還發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻更傾向于利用胰蛋白胨中的游離氨基酸，可以促進(jìn)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和巖藻黃素積累。因此，確定胰蛋白胨為最適宜三角褐指藻生長(zhǎng)及巖藻黃素積累的氮源種類。

2.3 胰蛋白胨濃度對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量的影響

胰蛋白胨濃度對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻的生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響見圖3。由圖3（a）可知，細(xì)胞密度隨著胰蛋白胨濃度升高而提高。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在0.02 mol/L胰蛋白濃度下細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為 1.61×108個(gè)/mL，顯著高于其他濃度（P＜0.05）。如圖3（b）所示，隨著胰蛋白胨濃度的提高，生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之增加。在0.02mol/L胰蛋白胨條件下，生物量和產(chǎn)率、巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量均達(dá)到最大值，見圖3（b）和表4。與低濃度胰蛋白胨 （0.005 mol/L）相比，分別提高了110.71%、112.50%、156.89% 和441.11%。因此，提高胰蛋白胨濃度能夠顯著促進(jìn)三角褐指藻的生物量和巖藻黃素產(chǎn)量。

圖3 胰蛋白胨濃度對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻細(xì)胞密度、生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響Fig.3 Effects of tryptone concentrations on the cell density，biomassconcentration and fucoxanthin content in mixotrophic P.tricornutum

表4 不同胰蛋白胨濃度對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)性能的影響Table 4 Production capability of mixotrophic P.tricornutum under different tryptone concentrations

與本研究結(jié)果類似，以高質(zhì)量濃度硝酸鈉（64.29 mg/L）為氮源培養(yǎng)三角褐指藻獲得的生物量產(chǎn)率是低質(zhì)量濃度硝酸鈉（32.09 mg/L）的1.44倍[22]；在高氮（300 mg/L硝酸鈉）時(shí)三角褐指藻的生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是低氮（75 mg/L硝酸鈉）下的1.75倍和1.30倍[15]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮條件下，大多數(shù)氨基酸的合成途徑及編碼色素合成的基因均受到抑制，導(dǎo)致胞內(nèi)葉綠素a和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低[11]，這說(shuō)明充足的氮是三角褐指藻生物量及巖藻黃素快速積累的必要條件。因此，確定0.020 mol/L胰蛋白胨是最適宜三角褐指藻生長(zhǎng)及巖藻黃素積累的氮源濃度。

2.4 混合氮源對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響

混合氮源對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻的生長(zhǎng)和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與產(chǎn)量的影響見圖4。由圖4（a）可知，在使用胰蛋白胨與尿素為混合氮源下，細(xì)胞密度在培養(yǎng)第10天時(shí)達(dá)到最大值，為1.82×108個(gè)/mL，是純胰蛋白胨條件下細(xì)胞密度的1.13倍（P＜0.05）。平均比生長(zhǎng)速率在不同氮源下無(wú)顯著性差異，見表4。以胰蛋白胨和尿素為混合氮源時(shí)，三角褐指藻的總氮消耗速率為16.10 mg/（L·d），是以純胰蛋白胨為氮源時(shí)的1.14倍（P＜0.05），但與胰蛋白胨和硝酸鈉為混合氮源條件下無(wú)顯著性差異，見表5。三角褐指藻的生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在兩組混合氮源條件下無(wú)顯著差異，但均顯著高于純胰蛋白胨（P＜0.05）。在胰蛋白胨與硝酸鈉和尿素為混合氮源的條件下，三角褐指藻的生物量、生物量產(chǎn)率、巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量分別達(dá)到 3.94 g/L、389.52 mg/（L·d）、20.83 mg/g和81.97 mg/L，分別是使用純胰蛋白胨時(shí)的1.07倍、1.36倍、1.28倍和1.08倍，見表5。結(jié)果表明，三角褐指藻細(xì)胞在混合氮源下的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于單一氮源組，可能是在純胰蛋白胨條件下培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的胞外分泌物抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)積累。已有研究報(bào)道，使用混合氮源培養(yǎng)微藻較單一種類氮源培養(yǎng)微藻，對(duì)微藻的生長(zhǎng)和生物量的積累有更好的效果[23]。王菊芳等人[24]的研究表明，與單一氮源相比，以蛋白胨和硝酸鉀為混合氮源培養(yǎng)隱甲藻可以獲得最大的生物量，這與本研究結(jié)果類似。因此，以胰蛋白胨和尿素為混合氮源獲得的三角褐指藻生物量和巖藻黃素產(chǎn)量最高，可作為三角褐指藻生長(zhǎng)及巖藻黃素積累的最適混合氮源。

圖4 混合氮源對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻細(xì)胞密度、總氮濃度、生物量和巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of mixed nitrogen sources on the cell density，total nitrogen concentration，biomass concentration and fucoxanthin content in mixotrophic P.tricornutum

表5 不同氮源種類對(duì)兼養(yǎng)三角褐指藻生產(chǎn)性能的影響Table 5 Production capability of mixotrophic P.tricornutum under different nitrogen sources

目前，三角褐指藻在混養(yǎng)培養(yǎng)方式下，以0.10 mol/L甘油、0.01 mol/L尿素為初始碳氮源進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，可獲得最高的生物量為15.40 g/L，是目前報(bào)道中最高的生物量，但該條件下獲得的類胡蘿卜素只占干質(zhì)量的0.49%[25]。本研究通過(guò)對(duì)三角褐指藻混養(yǎng)體系中的碳氮源進(jìn)行優(yōu)化，可顯著提高三角褐指藻的生物量、巖藻黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量。結(jié)果表明，以0.10 mol/L的甘油為碳源、以含氮量0.02 mol/L的胰蛋白胨和尿素混合氮源（1∶1）為氮源進(jìn)行混養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，三角褐指藻獲得的最終細(xì)胞密度、生物量、巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量分別是1.82×108個(gè)/mL、3.94 g/L、20.83 mg/g和 81.97 mg/L，分別是優(yōu)化前的14.80倍、3.15倍、11.64倍和36.59倍。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件下三角褐指藻獲得的巖藻黃素產(chǎn)量（81.97 mg/L）已經(jīng)達(dá)到目前已報(bào)道的最高水平。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)系統(tǒng)比較和優(yōu)化甘油濃度、氮源種類與濃度及其組合，確定了三角褐指藻生長(zhǎng)的最佳兼養(yǎng)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)策略，極大提高了細(xì)胞生長(zhǎng)速率、生物量和巖藻黃素產(chǎn)量。采用建立的兼養(yǎng)條件（0.10 mol/L甘油為碳源，含氮量0.02 mol/L的胰蛋白胨和尿素混合氮源（1∶1）為氮源），獲得的巖藻黃素產(chǎn)量（81.97 mg/L）是目前已知報(bào)道的最高水平，為后續(xù)規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)藻基巖藻黃素提供了技術(shù)支撐。