16S與gyrB基因聯(lián)合建樹快速鑒定一株蠟樣芽孢桿菌

傅 奇，甘美裕，王 艷，林俊杰，盧源欽，肖玉娟

（廈門華廈學(xué)院，福建 廈門 361024）

作為細菌鑒定最常用的方法，16S rDNA/RNA測序具有快速、簡便、準確等優(yōu)點，但在部分類群中16S序列存在高度相似性，無法準確定位到種[1]。尤其在芽孢桿菌屬中，由于種間序列高度相似，無法單獨依靠16S序列對菌種進行鑒定，通常需要結(jié)合其他數(shù)據(jù)進行分析，如通過3′端16S rDNA和5′端16S-23S ITS核苷酸序列結(jié)合構(gòu)建進化樹進行分類[2]，再結(jié)合 DNA 雜交進行分析[3]；或 16S、gyrA、gyrB基因序列分別比對、建樹[4]。

蠟樣芽孢桿菌作為一種條件致病菌，可產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致腹瀉或嘔吐[5]，是食品中的一類重要致病菌，施用動物肥的果蔬容易受污染。目前蠟樣芽孢桿菌主要通過生化實驗進行鑒定，耗時較長，開發(fā)快速準確的分子鑒定方法有助于縮短檢測周期。gyrB基因作為一種細菌中的常見保守序列，可編碼DNA促旋酶的B亞單位，進化速度快于16S，可用于細菌的鑒定[6]。張慧娟等人采用gyrB與多個毒力基因結(jié)合進行多重PCR進行快速檢測，但其中特異性gyrB基因在部分蘇云金芽孢桿菌也呈擴增陽性[7]。本研究利用16S序列與gyrB基因拼接序列聯(lián)合建樹，以較少的序列數(shù)和進化樹數(shù)實現(xiàn)對篩選菌株的快速鑒定，提高數(shù)據(jù)的利用率，減少數(shù)據(jù)沖突，為芽孢桿菌種群的分子生物學(xué)鑒定方法開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣本 廈門同安國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)竹壩農(nóng)場采集，該種植區(qū)施用動物肥。

1.1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆羊血瓊脂培養(yǎng)基、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基：購自青島海博生物科技有限公司。

1.1.3 PCR反應(yīng) 細菌基因組DNA提取試劑盒：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；16S擴增引 物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（F），5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′（R）；gyrB 擴 增 引物 ：5′-ATTTGG CGCTGGCGGTTAT-3′（F），5′-GGTTTCGGCTGGGC TGGTA-3′（R）：購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 于農(nóng)場施用動物肥的蔬菜種植區(qū)采集土壤，取土壤25 g加入225 mL蛋白胨生理鹽水稀釋均質(zhì)后涂布營養(yǎng)瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h，取疑似芽孢桿菌的單菌落進行劃線純化。

1.2.2 16S與gyrB序列提取 用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化菌株的總DNA；分別用16S與gyrB引物擴增，所得PCR產(chǎn)物電泳純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 16S與gyrB序列比對與進化分析 將16S與gyrB基因測序所得結(jié)果在Genbank進行比對。為保障數(shù)據(jù)的準確性和有效性，避免錯誤信息干擾，選擇Genbank中g(shù)yrB相似度前1 000個序列中的ATCC菌株進行比對，且選擇16S與gyrB序列同時可得的菌株進行比對。16S與gyrB基因序列用BioEdit[8]進行比對，去除兩端不整齊序列，用ClustalX[9]進行格式轉(zhuǎn)換后，取有效區(qū)間拼接[10]，用Paup*4.0基于最大簡約算法，構(gòu)建拼接序列進化樹[11-12]，選擇大腸桿菌ATCC 25922[13]作為外群。

1.2.4 生理生化驗證 參考國標《飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢測》[14]和《伯杰細菌鑒定手冊》[15]進行驗證。

1.2.5 聯(lián)合建樹方法適用性分析 為分析16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法是否適用于其他蠟樣芽孢桿菌的鑒定，于Genbank下載16S與gyrB基因均可得的蠟樣芽孢桿菌序列，按照上述方法進行序列拼接。選擇《伯杰細菌鑒定手冊》[14]中芽孢桿菌屬模式菌株，于Genbak和和EZBiocloud下載16S和gyrB序列，選擇大腸桿菌ATCC 25922作為外群，構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

從土壤中篩選得到一株革蘭氏陽性桿菌，菌落呈灰白色，細胞成鏈狀排列，編號為HX2016002。

2.2 16S與gyrB基因測序

PCR擴增所得16S序列有效區(qū)共1 439 bp，gyrB序列有效區(qū)共1 386 bp。

2.3 序列比對與進化樹構(gòu)建

16S序列比對結(jié)果中，高相似度菌株過多，且多數(shù)菌株無gyrB序列；而gyrB序列比對結(jié)果中，高相似菌株遠少于16S比對結(jié)果，且多數(shù)菌株同時可獲取16S序列，因此，以gyrB相似菌株作為建樹群，其中ATCC菌株均為全基因組測序，因此16S與gyrB基因序列號相同，見表1。

表1 Genbank中擁有相似16S與gyrB序列的菌株Table 1 Strains in Genbank with similar 16S and gyrB sequences

16S和gyrB序列比對后去除頭尾不整齊片段，均保留中心區(qū)域1 335 bp，將同一菌株的16S與gyrB拼接后建樹，見圖1。計算次數(shù)為1 000，樹長為5 680，一致性指數(shù)（CI）為 0.685，保留指數(shù)（RI）為 0.754，同型指數(shù)（HI）為 0.315。

圖1 基于16S與gyrB合并序列的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on merged sequences of 16S and gyrB

全樹各分支自展值均高于96，表明該樹結(jié)構(gòu)可靠，其中HX2016002與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）聚為一支，自展值為100，表明其很可能為蠟樣芽孢桿菌菌株。

2.4 生理生化驗證

HX2016002菌株接種至MYP瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h后菌落呈粉紅色，周圍有暈圈；接種至胰酪胨大豆羊血瓊脂，30℃培養(yǎng)24 h后，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)；穿刺接種至動力-硝酸鹽培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后沿穿刺線呈擴散生長；蛋白質(zhì)結(jié)晶毒素染色試驗呈陰性。確認該菌株為蠟樣芽孢桿菌，與進化分析結(jié)果一致，命名為 Bacillus cereus HX2016002。

2.5 聯(lián)合建樹方法適用性

在Genbank中選擇符合以下條件的蠟樣芽孢桿菌下載16S與gyrB序列：一是16S與gyrB序列均已上傳Genbank；二是鑒定結(jié)果較為可靠。共有滿足條件的菌株52株，另選擇親緣關(guān)系較近的芽孢桿菌屬其他菌種模式菌株15株，拼接16S與gyrB基因序列后構(gòu)建進化樹，見圖2。其中所有的蠟樣芽孢桿菌均聚合在一簇，表明如這52株菌中的任意一株菌種在還未鑒定的情況下，利用該方法建樹時與其他51株蠟樣芽孢桿菌均聚合在一支，可準確鑒定為蠟樣芽孢桿菌。16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方法適用于已知的52株蠟樣芽孢桿菌鑒定，可以預(yù)測該方法在蠟樣芽孢桿菌鑒定中具有普適性。

圖2 Genbank已知菌株基于16S與gyrB序列的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S and gyrB in Genbank

3 結(jié) 語

芽孢桿菌是生活中常見也是非常重要的一類微生物，研究人員經(jīng)常需要對其中的某一個或多個菌株進行鑒定，而分子生物學(xué)鑒定具有快速、簡便且準確的優(yōu)點，是目前常用的菌種鑒定手段，但芽孢桿菌之間保守序列的高度相似性為分子生物學(xué)鑒定帶來了困擾，往往需要對多個基因甚至全基因組進行測序來定位到種。在研究過程中，本課題組先通過16S序列將菌株定位至芽孢桿菌分類簇，設(shè)計gyrB引物擴增、測序后縮小比對范圍。同時，為了保障數(shù)據(jù)的準確性，避免無效甚至錯誤數(shù)據(jù)，選擇ATCC保藏的菌株進行分析。本課題組認為，在單基因測序的基礎(chǔ)上，單純的增加測序基因數(shù)量并對多個基因分別比對和建樹的方法有時并不能提高鑒定的準確性，甚至可能造成分析結(jié)果的紊亂和沖突，因此，選擇了16S與gyrB基因聯(lián)合建樹的方式進行分析，將HX2016002準確鑒定為蠟樣芽孢桿菌。經(jīng)驗證，該方法在蠟樣芽孢桿菌的鑒定中具有較普遍的適用性，下一步將繼續(xù)研究該方法在其他保守序列相似度高的菌群鑒別中應(yīng)用的有效性。