黃桃果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及香氣成分分析

李明瑕，劉春鳳，王 壬，鄭飛云，王金晶，鈕成拓，李 崎

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

桃屬于薔薇科，李屬，起源于我國的西北高原，后廣泛分布于亞、非、歐、美、澳等5個大洲[1]。桃品種按照果肉的顏色可以分為白肉桃、紅肉桃、黃肉桃[2]。其中黃肉桃因顏色鮮艷、香氣濃郁，在國內(nèi)外市場上有很強的競爭力。黃桃果肉含有大量的碳水化合物、有機酸、維生素、膳食纖維和飲食抗氧化劑，營養(yǎng)價值十分豐富[3]。然而，黃桃的可用性受到季節(jié)和貨架期的限制[4]，嚴重影響了我國黃桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。黃桃的深加工可以滿足無桃季節(jié)市場的需求，現(xiàn)階段我國黃桃的加工產(chǎn)品主要是黃桃罐頭、桃汁、速凍桃片、黃桃酸奶等低值產(chǎn)品[5-6]。因此，為了避免黃桃上市時大量的資源浪費，有必要開展黃桃深加工技術(shù)，提升黃桃的附加值和市場競爭力。

果酒是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵釀制而成的一類低酒精度飲料[7]，是水果的主要加工途徑之一。黃桃果酒是黃桃較理想的食用途徑和深加工模式，它可以最大限度地保留黃桃中的營養(yǎng)成分，減少損失，還可以滿足果酒市場多樣化的需求。

目前國內(nèi)外對黃桃的研究主要集中在生物活性物質(zhì)的測定[3，8-9]和黃桃去皮工藝[10]等方面，只有少量關(guān)于發(fā)酵工藝的研究[11]，但都沒有關(guān)注發(fā)酵參數(shù)對感官品質(zhì)的影響。同時市面上僅有的幾款黃桃酒類產(chǎn)品也都是配制酒，缺乏黃桃發(fā)酵酒類型產(chǎn)品。作者選用濃縮黃桃汁，通過對影響果酒發(fā)酵的主要參數(shù)進行單因素實驗結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法獲得黃桃果酒最優(yōu)發(fā)酵工藝，隨后對實驗室制得的黃桃果酒與市售產(chǎn)品的抗氧化能力和風味物質(zhì)進行了分析和比較，以期為黃桃果酒的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母YP-01：作者所在實驗室保藏。

1.1.2 試劑 黃桃濃縮汁參數(shù)：可溶性固形物44.5%，總酸（18.05±0.11） g/L；白砂糖，檸檬酸，碳酸鈣：市售。

1.1.3 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱BSP-250：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；精密數(shù)顯PH計FE20：北京Hanna公司；超凈工作臺SW-CJ2D：蘇州空氣凈化設(shè)備廠；高速冷凍離心機5804R：Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃桃果酒發(fā)酵流程 黃桃濃縮汁→調(diào)整成分（酸度、糖度）→滅菌（105 ℃、10 min）→接種→主發(fā)酵→離心→成品

1.2.2 黃桃果酒發(fā)酵條件優(yōu)化

1）單因素實驗 調(diào)整黃桃濃縮汁成分至糖質(zhì)量濃度為120 g/L，可滴定酸5.68 g/L，分別以初始糖質(zhì)量濃度 140、160、180、200、220 g/L，主發(fā)酵溫度19、22、25、28、31 ℃，初始 pH 3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，酵母接種量 3×106、6×106、9 ×106、12 ×106、15×106CFU/mL，氮添加量 100、200、300、400、500 mg/L 進行黃桃果酒發(fā)酵單因素實驗，當24 h失重小于0.1 g/dL時結(jié)束發(fā)酵，對黃桃果酒進行感官品評和乙醇體積分數(shù)檢測。

2）產(chǎn)品類型 黃桃果酒發(fā)酵后平均含糖8.5 g/L，總酸8.5 g/L，口感偏酸，不符合大多數(shù)人的口味。調(diào)整發(fā)酵后果酒至糖質(zhì)量濃度 13、18、23、28、33、38、43 g/L。對調(diào)整的黃桃果酒進行感官品評，以確定該黃桃果酒最適的產(chǎn)品類型。

3）Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化黃桃果酒發(fā)酵條件在單因素實驗的基礎(chǔ)上[12-14]，選定主發(fā)酵溫度、初始pH和接種量3個影響較大的因素，以感官評分為評價指標，進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，各因素及水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

1.2.3 黃桃果酒的評價

1)感官評分標準 感官評分標準按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]中介紹的方法進行，由11名具有感官品評經(jīng)驗的專業(yè)人員根據(jù)表2中的評分標準進行評價。在（22±1）℃的室溫下，將黃桃酒樣品裝入品評杯中呈遞給小組成員，對每個黃桃酒樣的得分取11人平均值，即該酒的感官得分。

表2 感官評定表Table 2 Sensory evaluation

2）理化指標檢測方法 乙醇、總酸、揮發(fā)酸、總糖和總SO2測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；總酚和DPPH清除率的測定參照楊冬梅等[16]的方法；維生素C測定參照鄭京平等[17]的方法；羥自由基（OH-）清除率參照劉亞娜等[18]的方法。

3）揮發(fā)性化合物測定 通過SPME-GC-MS測定黃桃果酒中揮發(fā)性化合物，GC-MS條件參照李凱[19]等的方法。未知化合物的定性通過與NIST 05質(zhì)譜庫中標準譜圖比對確定，化合物的定量通過在體積分數(shù)為10%的乙醇溶液中配制待測化合物標準溶液，根據(jù)定量化合物與內(nèi)標化合物峰面積的比值與定量化合物的濃度繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物的質(zhì)量濃度。

香氣活力值[19]（OAV）用于評價香氣物質(zhì)對樣品整體香氣的貢獻，OAV的計算值等于某種揮發(fā)性化合物的質(zhì)量濃度與該物質(zhì)閾值的比，通常認為OAV≥1的物質(zhì)是果酒中主要呈味化合物。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 10.0軟件進行試驗設(shè)計，采用origin 2018、SPSS軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

初始糖質(zhì)量濃度的高低直接影響發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)和風味物質(zhì)質(zhì)量濃度，進而影響黃桃果酒的品質(zhì)。不同初始糖質(zhì)量濃度對黃桃果酒乙醇體積分數(shù)及感官品質(zhì)的影響見圖1（a）。發(fā)酵后果酒的乙醇體積分數(shù)隨初始糖質(zhì)量濃度的增加而增加，當初始糖質(zhì)量濃度為180 g/L時，發(fā)酵果酒乙醇體積分數(shù)為10.6%，酒體相對豐滿，同時感官得分最高。但當初始糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，乙醇體積分數(shù)升高的幅度逐漸減小，同時感官評分也在降低。

圖1 不同發(fā)酵條件對黃桃果酒感官品質(zhì)和乙醇體積分數(shù)的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the sensory quality and alcohol content of yellow peach wine

不同發(fā)酵溫度對黃桃果酒乙醇體積分數(shù)及感官品質(zhì)的影響見圖1（b）。發(fā)酵溫度低于22℃時，發(fā)酵時間相對延長，發(fā)酵不徹底；而發(fā)酵溫度高于28℃時，發(fā)酵速度較快，但感官得分相對降低。低溫發(fā)酵能夠增加果酒的花香和水果香氣，但會抑制酵母的生長，降低糖的消耗速率；隨著溫度的升高，酵母生長速率提高，但高溫會導致酵母自溶，存活細胞減少[20]。發(fā)酵溫度為25℃時，酒體豐滿，乙醇體積分數(shù)為 10.67%，感官評分最高，為78.9。因此，選擇25℃為最適發(fā)酵溫度。

不同初始pH對黃桃果酒乙醇體積分數(shù)及感官品質(zhì)的影響見圖1（c）。不同pH下發(fā)酵時間沒有差別，說明pH 3.0～4.2的環(huán)境對酵母的發(fā)酵活性沒有顯著影響。當初始pH為3.0時，發(fā)酵后果酒酸味較為尖銳，感官評分略低；當初始pH較高時，發(fā)酵后果酒有明顯的苦澀感。綜合發(fā)酵速度、乙醇體積分數(shù)、感官評分，選擇pH 3.3為最適初始pH。

不同酵母接種量對黃桃果酒乙醇體積分數(shù)及感官品質(zhì)的影響見圖1（d）。當酵母接種量低于6×106CFU/mL時，發(fā)酵時間相對延長，接種量達到15×106CFU/mL時，乙醇體積分數(shù)明顯降低。酵母接種量較低時，代謝繁殖速度緩慢，污染雜菌的風險增加；酵母接種量過多時，菌群大量繁殖消耗營養(yǎng)成分，破壞發(fā)酵環(huán)境致使酵母提前衰老并發(fā)生自溶，影響果酒風味[21]。綜合發(fā)酵時間、乙醇體積分數(shù)和感官品評結(jié)果，選擇9×106CFU/mL為黃桃果酒發(fā)酵最適接種量。

不同的主發(fā)酵溫度、初始糖質(zhì)量濃度、pH、接種量對發(fā)酵時間均有影響，但總的來說，黃桃果酒發(fā)酵速度偏慢，氮含量成為酵母發(fā)酵限制因子。不同氮添加量對黃桃果酒乙醇體積分數(shù)及感官品質(zhì)的影響見圖1（e）所示。提高氮添加量后，發(fā)酵速率和感官得分明顯提高。綜合發(fā)酵速率和感官評分，發(fā)酵前氮的最適添加量為200 mg/L。

2.2 產(chǎn)品類型

根據(jù)每日失重監(jiān)測發(fā)酵速度，當24 h失重小于0.1 g/dL時結(jié)束發(fā)酵，所得黃桃果酒平均糖質(zhì)量濃度和總酸質(zhì)量濃度均為8.5 g/L，口感偏酸，表明該濃縮黃桃汁發(fā)酵黃桃果酒不適合發(fā)酵成干型、半干型。不同類型的黃桃果酒感官評分見表3。

表3 不同產(chǎn)品類型感官得分Table 3 Sensory scores for different product types

根據(jù)感官評分結(jié)果，當發(fā)酵后總糖為23 g/L時，糖酸比為2.71，酸甜平衡程度最好。因此，該濃縮黃桃汁適合制成糖質(zhì)量濃度為23 g/L的半甜型黃桃酒。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，考慮發(fā)酵后乙醇體積分數(shù)為10.67%左右，糖質(zhì)量濃度在23 g/L時感官評分最佳。國家標準GB 2758—2012《食品安全國家標準 發(fā)酵酒及其配制酒》[22]中規(guī)定乙醇體積分數(shù)≥10%的發(fā)酵酒可免于標示保質(zhì)期，說明乙醇體積分數(shù)在10%以上有利于果酒貯藏。氮添加量為200 mg/L時感官評分最高，再提高添加量感官評分降低，還會增加生產(chǎn)成本。為生產(chǎn)乙醇體積分數(shù)10.67%左右，糖質(zhì)量濃度23 g/L的半甜型黃桃果酒，固定初始糖質(zhì)量濃度為195 g/L，氮添加量200 mg/L。選擇初始pH、接種量、主發(fā)酵溫度3個因素為分析對象，發(fā)酵過程監(jiān)測總糖變化，當糖質(zhì)量濃度為23 g/L時結(jié)束發(fā)酵，以感官評分為響應(yīng)值，利用Design Expert 10軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實驗，實際方案和結(jié)果見表4。通過軟件對數(shù)據(jù)進行了回歸擬合，得到感官評分與初始pH（A）、接種量（B）、主發(fā)酵溫度（C）的回歸方程：

感官評分=87.50+2.23A+0.65B-0.94C-0.29AB-0.80AC-1.19BC-6.14A2-7.38B2-0.90C2

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Behnken experiment design and results

利用軟件對模型進行了方差分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表5。由表5可知，響應(yīng)面優(yōu)化后的模型P＜0.000 1，說明該模型可信。失擬項P＞0.05，說明該模型與試驗結(jié)果擬合較好，能反映實際情況。由回歸方程和方差分析可知，一次項A（pH）、C（溫度）、二次項A2、B2和交互項BC對感官得分的影響達到極顯著水平（P＜0.01），一次項B（接種量）、二次項C2、交互項AC對感官得分的影響達到顯著水平（P＜0.05）。根據(jù)F值的大小，可知3個因素對黃桃果酒感官評分影響的程度是：初始pH＞主發(fā)酵溫度＞接種量。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

根據(jù)Design-Expert 10.0軟件，獲得了主發(fā)酵溫度、初始pH、接種量交互作用對感官品質(zhì)影響的三維響應(yīng)面曲線，見圖2。可以看出，溫度和pH、溫度和接種量等高線圖呈明顯的橢圓形，表明兩因素交互作用較明顯，與表5方差分析結(jié)果一致。通過回歸模型的預測，得到黃桃果酒發(fā)酵最優(yōu)工藝條件為：初始 pH 3.367、接種量 9.281×106CFU/mL、主發(fā)酵溫度22.967℃，在該條件下黃桃酒感官評分預測值為88.101，實際操作時根據(jù)操作條件修正主發(fā)酵溫度為23℃，初始pH 3.4，接種量9.3×106CFU/mL。

圖2 發(fā)酵條件對感官評分交互影響的曲面圖Fig.2 Surface plot of interactive effects of fermentation conditions on sensory scores

2.4 響應(yīng)面驗證實驗及理化指標分析

在主發(fā)酵溫度為23℃、初始pH 3.4，接種量9.3×106CFU/mL的工藝條件下進行3次黃桃果汁發(fā)酵驗證實驗，同時對制得的黃桃果酒和3款市售的黃桃酒產(chǎn)品的理化指標進行了比較，結(jié)果見表6。

表6 黃桃果酒的理化指標分析Table 6 Analysis of physical and chemical indexes of yellow peach wine

目前，國內(nèi)市售黃桃酒絕大部分為配制酒。由表6可以看出，發(fā)酵型樣品1糖質(zhì)量濃度為22.41 g/L，屬于半甜型酒，樣品2～4的糖質(zhì)量濃度均大于50 g/L，屬于甜型酒；其中樣品4中揮發(fā)酸是GB 15037—2006《葡萄酒》[23]中規(guī)定最高含量的3.9倍，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度過高會帶來尖酸感和不快的醋味，這可能是其感官得分較低的重要原因。樣品1感官評分為88.20分，與3.3中軟件預測值相近；樣品3在市售3種配制酒中得分最高為72.34，但其抗氧化物質(zhì)總酚的質(zhì)量濃度僅為樣品1的17.8%，并且不含維生素C。相比之下，發(fā)酵型樣品1中抗氧化物質(zhì)總酚和維生素C質(zhì)量濃度均較高，分別達351.07 mg/L和100.65 mg/L；同時，樣品1的體外抗氧化力較高，DPPH和羥基自由基清除率分別為31.44%和98.84%。綜上所述，優(yōu)化工藝下制得的黃桃果酒的口感和抗氧化能力均優(yōu)于市售的3款配制型黃桃酒。

2.5 黃桃果酒香氣成分分析

2.5.1 主要香氣化合物定量分析 采用SPMEGC-MS對最優(yōu)工藝條件下制得的黃桃果酒 （樣品1）與3種市售黃桃酒（樣品2～4）中主要揮發(fā)性化合物進行定量分析，結(jié)果見表7。其中醇類物質(zhì)8種、酯類物質(zhì)16種、脂肪酸類物質(zhì)4種以及萜烯/內(nèi)酯類物質(zhì)4種。

表7 黃桃果酒揮發(fā)性化合物定量分析Table 7 Quantitative analysis of volatile compounds in yellow peach wine

續(xù)表7

揮發(fā)性化合物在酒類產(chǎn)品的質(zhì)量中起重要作用，通過GC-MS分析了黃桃果酒中的揮發(fā)性化合物組成。在黃桃果酒的各類揮發(fā)性化合物中，醇類和酯類在數(shù)量上是果酒中最大的芳香族化合物。醇類物質(zhì)是果酒醇甜和助香劑的重要來源[24]，樣品1中醇類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高為 （81.45±7.07）mg/L，樣品3最低，僅為樣品1的45%。黃桃果酒中質(zhì)量濃度較高的醇類物質(zhì)有異戊醇、異丁醇、正丙醇和苯乙醇，占定量的醇類化合物的99.32%～99.46%。酯類物質(zhì)在果酒中呈現(xiàn)出花香和果香，樣品4中酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高為（135.07±5.01）mg/L，其中乙酸乙酯占總酯的62.9%。樣品1酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度最低，為（21.45±1.33） mg/L。 但從酯的種類來看，樣品1中乙酸辛酯、乙酸己酯、2-糠酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯等9種酯類物質(zhì)均高于其他3款產(chǎn)品，多種化合物的共同作用可能導致樣品1有更高的風味復雜性。脂肪酸類化合物中含量較多的有正癸酸、己酸和辛酸，占定量的脂肪酸類化合物的97.49%～97.70%。萜烯/內(nèi)酯類化合物也是重要風味物質(zhì)[25]，含量相對較低，但在風味的構(gòu)成中起到重要的作用。

2.5.2 香氣活力值及主成分分析 揮發(fā)性化合物對果酒香氣的貢獻取決于化合物在果酒中的閾值，OAV＞1的成分是樣品主體呈香化合物。定量的30種揮發(fā)性化合物中，有11種化合物的OAV值大于1，可能是黃桃果酒的主體香氣成分，見表8。

表8 黃桃果酒香氣活力值比較Table 8 Comparison of odor activity value of yellow peach wine

對OAV值大于1的11種化合物進行主成分分析能夠區(qū)分這4種黃桃果酒，見圖3。前兩個主成分的貢獻率為81.8%，表明前兩個主成分解釋了原香氣特征變量81.8%的方差信息。與第一主成分呈現(xiàn)正相關(guān)的物質(zhì)有異戊醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇和正癸酸，樣品1主成分得分在PC1的正向，說明與市售果酒相比，樣品1與異戊醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇和正癸酸有很強的相關(guān)性，推測由于多種香氣化合物的共同作用導致樣品1的香氣更為協(xié)調(diào)，因此有更高的感官得分。樣品4與乙酸乙酯和異戊酸乙酯有很強的相關(guān)性，其質(zhì)量濃度分別是其他果酒的3.8倍和1.38倍，可能因此造成了果酒風味的失衡。樣品2與乳酸乙酯和己酸有很強的相關(guān)性。樣品3與丙位癸內(nèi)酯相關(guān)性較高，揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度都略低于其他3款產(chǎn)品，可能因此導致樣品3風味不突出。

圖3 主成分載荷和得分雙重圖Fig.3 Loading plot and score plot of principal components analysis

3 結(jié)語

通過單因素實驗探究了初始糖質(zhì)量濃度、主發(fā)酵溫度、酵母接種量和氮添加量對黃桃果酒發(fā)酵的影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到糖質(zhì)量濃度23 g/L的半甜型黃桃果酒發(fā)酵的最佳工藝條件為：初始糖質(zhì)量濃度195 g/L，主發(fā)酵溫度23℃，初始pH 3.4，接種量9.3×106CFU/mL，氮添加量200 mg/L。實驗室制備黃桃果酒與市售產(chǎn)品相比，自制果酒的抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度及抗氧化能力均優(yōu)于市售產(chǎn)品。通過SPME-GC-MS定量分析和香氣活力值確定了異戊醇、正丙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、正癸酸、己酸、辛酸和丙位癸內(nèi)酯等11種化合物為黃桃果酒的主要風味化合物，主成分分析顯示實驗室制備果酒與多種醇和酯有很強的相關(guān)性，風味更加協(xié)調(diào)。該優(yōu)化黃桃果酒發(fā)酵工藝為黃桃果酒的開發(fā)和品質(zhì)調(diào)控提供了一定的借鑒作用。