黃芪多糖對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

李 晶，姜麗麗*，李沐軒，鄧 鳳，徐宋瑤，薛 昕，扈瑞平，薛慧婷

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110）

痛風(fēng)是由持續(xù)的高尿酸血癥引發(fā)的代謝類疾病，表現(xiàn)為炎性反應(yīng)，近年來發(fā)病率呈迅速上升趨勢，嚴(yán)重影響人類健康[1]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是尿酸生成的關(guān)鍵酶，普遍存在于各種生物體中，因其在體內(nèi)發(fā)生氧化作用產(chǎn)生尿酸，時間長了還會引起各種并發(fā)癥[2-3]。臨床上常將黃嘌呤氧化酶抑制劑用作治療高尿酸血癥的藥物。別嘌呤醇是典型的黃嘌呤氧化酶抑制劑，目前廣泛應(yīng)用于痛風(fēng)的臨床治療，但是長期使用別嘌呤醇會有肝損害等各種不同程度的毒副作用產(chǎn)生，用藥安全性一直困擾著人們，而安全無毒的中草藥是目前開發(fā)和研究的方向[4]。

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黃芪藥材的主要成分之一，屬于大分子有機(jī)化合物，由葡萄糖、鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成，是水溶性的淡黃色粉末，有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用[5-6]。目前多糖在降尿酸的作用方面逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)報道的有甘草多糖、鼠尾藻多糖和海帶多糖等，通過抑制黃嘌呤氧化酶活性阻礙尿酸合成，從而減少體內(nèi)尿酸濃度[3，7]。茯苓多糖可能是通過上調(diào)高尿酸血癥大鼠的腎臟尿酸相關(guān)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體 1（rOAT1）的表達(dá)和下調(diào)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（rURAT1）的表達(dá)，從而增加了尿酸的排泄[8]。黃芪多糖對黃嘌呤氧化酶的抑制作用及抗高尿酸血癥的機(jī)理研究未見報道。鑒于當(dāng)前天然產(chǎn)物及活性提取物在痛風(fēng)病中的作用已逐漸成為研究熱點(diǎn)，結(jié)合黃芪多糖的功效范圍廣、副作用低、多靶點(diǎn)作用等特點(diǎn)，通過考察黃芪多糖對黃嘌呤氧化酶的抑制作用機(jī)理，探討其降尿酸作用的酶反應(yīng)機(jī)制，為今后指導(dǎo)臨床用藥提供新的參考，同時為開發(fā)道地黃芪的生物學(xué)功能及產(chǎn)品的深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取內(nèi)蒙古道地藥材蒙古黃芪的干燥根，粉碎過篩，60℃烘干至恒質(zhì)量，密封保存?zhèn)溆谩｜S嘌呤氧化酶（XOD） ，黃嘌呤（xanthine）：Sigma 公司產(chǎn)品；別嘌呤醇（純度98%）：羅恩試劑；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、EDTA-2Na、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)藥品。

1.2 儀器與設(shè)備

RE212-B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司制造；Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司制造；TU1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司制造；QE-1000型高速萬能粉碎機(jī)：上海新諾儀器設(shè)備有限公司制造；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造；TD5M型多管架自動平衡離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司制造；SHHW21.600AⅡ型三用恒溫水箱：天津泰斯特儀器有限公司制造；PX224ZH型電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司制造。

1.3 方法

1.3.1 黃芪多糖的制備 采用水提醇沉法提取黃芪多糖，參考文獻(xiàn)[9-12]優(yōu)化改進(jìn)，蒙古黃芪干燥根用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩子后于60℃烘干至恒質(zhì)量，按相應(yīng)液料體積比1∶11加純水，80℃浸提2 h，旋蒸濃縮后，經(jīng)8 g/dL三氯乙酸除蛋白質(zhì)3次，再用無水乙醇醇沉過夜，4 000 r/min離心5 min，沉淀經(jīng)無水乙醇清洗后真空冷凍干燥，得黃芪多糖，用硫酸-苯酚法測得黃芪多糖提取純度大于70%，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 黃芪多糖對XOD抑制作用的測定 在酶促反應(yīng)過程中，XOD通過催化底物黃嘌呤反應(yīng)生成尿酸，尿酸在294 nm處具有特征吸收峰。將文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行改進(jìn)，分為4個處理組，按照表1進(jìn)行加樣。在反應(yīng)體系中依次加入磷酸緩沖液（pH 7.5、0.2 mol/L）、底物黃嘌呤溶液（1 mmol/L）、不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖溶液，加樣完畢后于25℃水浴10min，再加入25℃預(yù)溫后的酶液（8 μg/mL），混合均勻，從加入酶液開始計時，反應(yīng)時間1 min，紫外分光光度計測定吸光度值（A294）。

表1 酶活力測定體系的組成Table 1 Composition of enzyme reaction system

以公式 I（%）=[1-（A1-A2）/（A3-A4）]×100% 計算不同質(zhì)量濃度黃芪多糖對XOD的抑制率（I）。其中：A1～A4為處理組1—4在 294 nm處測得的吸光度值。以多糖質(zhì)量濃度對抑制率作圖，線性擬合得擬合方程，計算抑制率為50%時對應(yīng)的黃芪多糖質(zhì)量濃度，即為半抑制濃度（IC50）。

1.3.3 黃芪多糖對XOD抑制動力學(xué)研究 酶活力測定體系中，設(shè)定底物黃嘌呤溶液濃度為1 mmol/L，加入不同質(zhì)量濃度黃芪多糖溶液 （0.4、0.8、1.2 mg/mL），測定在不同質(zhì)量濃度酶液（6、8、10、12 μg/mL）反應(yīng)條件下多糖對酶活力的影響。以加入的酶質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)的速率為縱坐標(biāo)作圖，得到一組直線，若直線平行為不可逆抑制；若直線通過原點(diǎn)則為可逆抑制。

酶活力測定體系中，酶質(zhì)量濃度（8 μg/mL）不變，加入不同質(zhì)量濃度黃芪多糖溶液（0.4、0.8、1.2 mg/mL），測定在不同濃度底物黃嘌呤（0.6、0.8、1、1.2 mmol/L）條件下的反應(yīng)速率，通過雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度倒數(shù)對反應(yīng)速率倒數(shù)作圖，根據(jù)所得曲線的形狀判斷黃芪多糖對XOD的抑制類型。按照Dixon作圖法，計算得到抑制常數(shù)Ki值。

1.3.4 黃芪多糖與別嘌呤醇對XOD的聯(lián)合作用探究 采用等毒法評價黃芪多糖與別嘌呤醇對XOD的聯(lián)合作用效果[14]。首先測定黃芪多糖和別嘌呤醇單獨(dú)使用時對XOD抑制率達(dá)到25%時各自的質(zhì)量濃度，按照該質(zhì)量濃度配制黃芪多糖和別嘌呤醇，將二者1∶1混合加入反應(yīng)體系，測定混合物對XOD的抑制率，并按如下公式計算得到共毒系數(shù)，對黃芪多糖與別嘌呤醇對XOD的聯(lián)合作用效果進(jìn)行評價。

式中：X表示共毒系數(shù)；I實(shí)表示實(shí)測抑制率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中所有樣品平行操作3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對XOD的抑制作用

黃芪多糖對XOD表現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)黃芪多糖溶液質(zhì)量濃度為0～0.4 mg/mL時，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，黃芪多糖對XOD的抑制率呈線性逐漸升高，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系；在0.4～1.4 mg/mL時，抑制率隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增大，但增長趨勢變緩；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于1.4 mg/mL時抑制率趨于恒定。對圖1曲線進(jìn)行線性擬合，計算得黃芪多糖對XOD的半抑制質(zhì)量濃度為1.37 mg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度黃芪多糖對XOD活力的影響Fig.1 Effect of APS concentration on XOD activity

2.2 黃芪多糖對XOD抑制動力學(xué)分析

固定底物濃度不變，在酶活力測定體系中加入不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖，酶促反應(yīng)的速率V隨酶質(zhì)量濃度的變化而變化，以酶質(zhì)量濃度對反應(yīng)速率作圖，得到一組相交于原點(diǎn)的直線，并且直線斜率隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增大而減小，見圖2。說明黃芪多糖對XOD屬于可逆抑制，黃芪多糖分子是通過非共價鍵與XOD結(jié)合導(dǎo)致了酶活性的降低，這種抑制作用是可逆的，使用物理方法可以使酶恢復(fù)活性。

圖2 黃芪多糖對XOD的抑制作用機(jī)理Fig.2 Inhibition mechanism of APS on XOD

在酶促反應(yīng)過程中，體系中酶質(zhì)量濃度固定不變，改變底物黃嘌呤溶液的質(zhì)量濃度，測定不同質(zhì)量濃度多糖溶液加入時對酶活力的影響。雙倒數(shù)作圖法得到一組直線，見圖3。隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，直線斜率逐漸減小，且縱軸上的截距基本不變，符合酶的競爭性抑制的特征，因此，黃芪多糖為XOD的一種競爭性可逆抑制劑。采用Dixon作圖法，選取2個不同濃度的底物反應(yīng)體系，以黃芪多糖質(zhì)量濃度對酶反應(yīng)速率倒數(shù)作圖，得到2條直線，見圖4。根據(jù)兩直線的交點(diǎn)坐標(biāo)計算求得抑制常數(shù) Ki值為 0.59 mg/mL。

圖3 黃芪多糖對XOD的抑制類型的測定Fig.3 Determination of inhibition types of APS on XOD

圖4 黃芪多糖對XOD抑制常數(shù)的測定Fig.4 Determination of XOD inhibition constants of APS

2.3 黃芪多糖與別嘌呤醇對XOD的聯(lián)合作用效果評價

將黃芪多糖與別嘌呤醇單獨(dú)使用時對XOD抑制率達(dá)到25%的劑量混合，混合物對XOD的聯(lián)合抑制作用結(jié)果見表2?；旌衔飳OD的聯(lián)合抑制率為26.67%±1.15%，共毒系數(shù)為-46.66±2.65。根據(jù)共毒系數(shù)理論，黃芪多糖與別嘌呤醇的聯(lián)合作用類型為拮抗作用，說明二者同時使用會降低各自對XOD的抑制效果。

表2 混合物對XOD活性的聯(lián)合作用效果Table 2 Combined effect of mixture on XOD activity

3 結(jié) 語

近年來，有關(guān)中藥提取物對XOD抑制作用的研究已有相關(guān)報道，李英等研究了金銀花水提物對XOD的抑制作用，經(jīng)測定其IC50為1.95 mg/mL[15]；王亞楠等發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物對XOD具有抑制作用，IC50為5.8 mg/mL[16]。申啟榮研究了17種中藥的水提物和醇提物對XOD的抑制作用，這些抑制劑的IC50基本處于0.5～5.5 mg/mL范圍內(nèi)[17]。綜合這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目前中藥來源對XOD具有抑制作用的活性物質(zhì)主要集中于水提物或醇提物，多糖對XOD的抑制作用研究較少。本研究的特色在于采用了三氯乙酸除蛋白質(zhì)3次，有效降低了生物體中主要成分蛋白質(zhì)對結(jié)果的干擾，更能真實(shí)體現(xiàn)多糖對XOD的抑制作用。

研究了黃芪多糖在體外對XOD活性的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對XOD具有顯著抑制作用，IC50為1.37 mg/mL。與其他中藥提取物相比，黃芪多糖具有較高的XOD抑制活性。對黃芪多糖的動力學(xué)分析表明，黃芪多糖對XOD的抑制作用類型為競爭性可逆抑制，即黃芪多糖與底物黃嘌呤結(jié)構(gòu)相似，二者共同競爭酶的結(jié)合部位，抑制劑與酶形成可逆復(fù)合物，但這類復(fù)合物不能分解形成產(chǎn)物尿酸，這種抑制作用可以通過增加底物黃嘌呤的質(zhì)量濃度得到解除。此抑制類型與別嘌呤醇作用類型相同，但毒副作用卻大大降低，具有開發(fā)前景。

作者還探究了黃芪多糖和別嘌呤醇的聯(lián)合抑制作用，結(jié)果顯示黃芪多糖和別嘌呤醇的聯(lián)合抑制作用表現(xiàn)為拮抗作用，說明二者合用的效應(yīng)小于它們分別作用的總和，但在臨床治療過程中有時也可將具有拮抗作用的藥物有意識的配伍使用，以糾正主藥的副作用和突出主藥的主要作用。基于別嘌呤醇在臨床治療痛風(fēng)的過程中產(chǎn)生的毒副作用較嚴(yán)重，未來有望將二者同時使用以減輕別嘌呤醇的毒副作用，具體用量與方法還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，雖然黃芪多糖作為一種XOD抑制劑與目前臨床應(yīng)用的化學(xué)合成類XOD抑制劑類藥物相比抑制活性較低，但是黃芪作為一種本地大量栽培種植的道地中藥材，其來源廣泛，性溫?zé)o毒副作用，可以考慮用于痛風(fēng)患者的預(yù)防輔助治療。在本研究的基礎(chǔ)上，未來黃芪多糖在體內(nèi)對XOD的抑制效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，同時多糖相對分子質(zhì)量的大小及分布對黃嘌呤氧化酶的抑制率有無影響也有待于進(jìn)一步研究。