抗壞血酸插層鐵鋯氧化物的制備及急性毒性評價

楊玉潔，張毅偉，彭達，趙爽，張慶樂，王浩

(山東第一醫(yī)科大學藥學院臨床藥學教研室，泰安 271016)

抗壞血酸在治療壞血病、增強免疫力、預防惡性腫瘤等方面具有良好的效果[1-3]，但由于穩(wěn)定性較差，易溶于水而損失[4]，需制成緩釋制劑以保證其治療效果。與纖維素衍生物、殼聚糖和膠原等傳統(tǒng)的藥物緩釋材料相比[5]，層狀雙金屬氧化物具有特殊的層狀結構和較大的比表面積、良好的生物相容性和穩(wěn)定性，成為極具開發(fā)潛力的新型藥物緩釋載體[6-9]。以植物提取液為軟模板合成層狀雙金屬氧化物是國際先進合成方法，該方法利用植物提取液中含有的多酚、黃酮、還原糖和蛋白質等生物活性成分作為還原劑和穩(wěn)定劑，在相對溫和的反應條件下對材料的形貌結構進行人工調控，從而提高對目標藥物的負載率和緩釋性能[10-12]。

樹葉來源廣泛，品種繁多，成為合成納米金屬或金屬氧化物的首選模板材料，如MACHADO等[11]利用桑樹葉、蘋果葉、檸檬葉等26種葉片提取液合成納米鐵，陳波等[12]利用紅背桂葉、桉樹葉和樟樹葉的提取液綠色合成氧化鐵。筆者在本文以松針提取液為軟模板合成鐵鋯雙金屬氧化物，探討材料的制備條件對抗壞血酸負載能力的影響；利用體外實驗評價抗壞血酸插層鐵鋯氧化物在模擬胃液和腸液中的緩釋效果，并利用急性毒性實驗評價該材料的生物安全性。

1 材料與儀器

1.1試驗材料 抗壞血酸(批號：20180622，含量>99.7%)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTMAB)(批號：57-09-0)、三氯化鐵(批號：7705-08-0)和氯氧化鋯(批號：13520-92-8)等均為分析純，購自南京細諾化工科技有限公司。

1.2試驗儀器 Spectrumlab752s紫外-可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)；HY-5A型回旋式振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；PHS-25C酸度儀(杭州奧立龍有限公司)；HH-6J數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

2 試驗方法

2.1松針水提液的制備 將采摘的松針洗凈，置于60 ℃的烘箱內干燥24 h，用粉碎機粉碎，松針粉和純化水按質量比1：20的比例加入到蒸餾燒瓶中，80 ℃的恒溫水浴鍋加熱1 h，真空抽濾后得松針水提液。

2.2鐵鋯氧化物的制備 將一定量的三氯化鐵、氯氧化鋯和十六烷基三甲基溴化銨加入到盛有松針水提液100 mL的燒杯中，置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌60 min，使其混勻。0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液逐滴滴定，調節(jié)溶液的pH值為9.5。將燒杯封口置于80 ℃的烘箱內陳化24 h，抽濾后將濾渣置于105 ℃下干燥24 h。殘渣在500 ℃下煅燒2 h，得到鐵鋯氧化物。改變鐵鋯氧化物中鐵和鋯的含量及比例、十六烷基三甲基溴化銨的加入量、反應溫度和烘干時間等條件制備一系列的鐵鋯氧化物。

2.3抗壞血酸負載方法 將鐵鋯氧化物0.1 g加入到盛有濃度為20 mg·L-1抗壞血酸100 mL的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進行震蕩反應，待反應達到平衡后，抽濾。利用紫外-可見分光光度計在波長245 nm處測定濾液的吸光度，利用下式(1)計算抗壞血酸的負載率：

R=C0-CeC0×100% (1)

式中：R為抗壞血酸負載率(%)；C0為抗壞血酸初始濃度(mg·L-1)；Ce為抗壞血酸平衡濃度(mg·L-1)。

2.4抗壞血酸緩釋量的測定 參照2010年版《中華人民共和國藥典》中方法配制人工胃液和腸液來模擬人體內環(huán)境。利用最佳條件下合成的鐵鋯氧化物對抗壞血酸進行負載，制備抗壞血酸插層鐵鋯氧化物復合材料。將抗壞血酸插層鐵鋯氧化物復合材料0.1 g放入盛有人工胃液和腸液20 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進行緩釋實驗，分別于5，10，15，30，45，60，90，120，180，240，330和450 min取樣，測其吸光度，并計算抗壞血酸的緩釋量。

2.5急性毒性試驗 配制濃度為9.88，14.82，22.22和33.33 mg·mL-1鐵鋯復合物的混懸液。取健康昆明種小鼠[購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：11400700221315，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2016-0011，實驗動物使用許可證號：SYXK(魯)2012-0005]，雌雄各半，體質量22～24 g，分為4組(n=6)，采用口服灌胃法一次性依次給藥，灌胃劑量以20 mL·kg-1。每天記錄小鼠的體質量、食量變化情況，并觀察其排便情況及有無嗜睡的現(xiàn)象，連續(xù)觀察10 d，對鐵鋯復合物的急性毒性進行初步觀察。

3 結果

3.1制備條件對抗壞血酸負載率的影響

3.1.1鐵鋯摩爾比的影響 在100 mL松針提取液、0.5 g CTMAB中，依次添加不同摩爾質量的三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比分別為8：1，4：1，1：1、1：4，1：8)，使二者的總量為0.01 mol，采用化學沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進行負載。由圖1可知：當鐵鋯摩爾比為8：1時，該復合氧化物對抗壞血酸的負載率達到最大值91.76%。隨著鐵鋯摩爾比的增加，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負載率逐漸降低到76.11%。因此，選擇鐵鋯摩爾比為8：1時制備該復合氧化物效果較好。

圖1 鐵鋯摩爾比對抗壞血酸負載率的影響

3.1.2CTMAB加入量的影響 在100 mL松針提取液、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(鐵鋯摩爾比為8：1)溶液中，依次加入CTMAB 0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g，采用化學沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進行負載。由圖2可知：隨著CTMAB質量從0.1 g增加到0.5 g，鐵鋯復合物對抗壞血酸的負載率從73.73%逐漸增加到 90.31%。繼續(xù)增加CTMAB質量，鐵鋯復合物對抗壞血酸負載率基本趨于穩(wěn)定。所以，CTMAB的適宜質量為0.5 g。

圖2 CTMAB加入量對抗壞血酸負載率的影響

3.1.3反應溫度的影響 燒杯中加入100 mL松針提取液、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比為8：1)和0.5 g CTMAB，置于溫度分別為20，40，60，80和100 ℃的磁力攪拌器上持續(xù)攪拌60 min，采用化學沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進行負載。由圖3可知：隨著反應溫度的增加，鐵鋯復合物對抗壞血酸的負載率呈現(xiàn)明顯的先增加后降低的趨勢，當反應溫度為60 ℃時，鐵鋯復合氧化物對抗壞血酸的負載率達到最大值為96.71%。所以，鐵鋯復合物最適宜的反應溫度為60 ℃。

圖3 反應溫度對抗壞血酸負載率的影響

3.1.4烘干時間的影響 燒杯中分別加入松針提取液100 mL、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比例為8：1)和CTMAB 0.5 g，置于60 ℃的磁力攪拌器上持續(xù)攪拌60 min，改變烘干時間分別為0，1，2，4，8，12，24，36和48 h，采用化學沉淀法合成鐵鋯復合氧化物，并對抗壞血酸進行負載。由圖4可知，當烘干時間為0～24 h時，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負載率隨著烘干時間的延長從73.08%增加到97.82%，當烘干時間36和48 h時，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負載率分別為97.89%和97.96%，僅有略微增加。綜合考慮藥物負載率和烘干時間，確定最適宜的烘干時間為24 h。

圖4 烘干時間對抗壞血酸負載率的影響

3.2抗壞血酸緩釋量的測定 由圖5可知，在人工胃液中，制劑中抗壞血酸的釋放量隨著時間推移逐漸增加。在0～240 min范圍內，釋放量增速較明顯，此后增速放緩，在450 min時釋放量達到極大值73.43%。在人工腸液中，制劑中抗壞血酸的釋放量隨著時間延長逐漸增加，在0～200 min范圍內，抗壞血酸的釋放量增速較明顯，此后增速放緩，在450 min時釋放量達到極大值63.74%?？傮w來看，不同時間內在人工胃液中抗壞血酸的釋放量均高于人工腸液中抗壞血酸的釋放量。

圖5 抗壞血酸在模擬胃液和腸液中的緩釋量

3.3急性毒性實驗 納米金屬氧化物在生物和醫(yī)學領域廣泛應用，如氧化鐵因其良好的生物相容性和獨特的超順磁性，被用作緩釋藥物的載體材料；氧化鋯應用于牙科和人工支架領域，均被證實無明顯細胞毒性和動物急性毒性[13-14]。本文鐵鋯復合氧化物合成工藝中未加入任何有毒試劑，為進一步確證其安全性，進行了復合物急性毒性的初步實驗。以質量濃度為1.976和2.964 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時，小鼠體征變化均正常；以質量濃度為4.44 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時，小鼠食欲稍有下降；以質量濃度為6.666 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時，小鼠僅食欲稍有下降且短時少動，但并無死亡。根據2005年《化學藥物急性毒性試驗技術指導原則》最大給藥量法，給藥量>5 g·kg-1未有動物死亡，可初步推測鐵鋯化合物無明顯的急性毒性，結果見表1。但鐵鋯化合物對于機體各組織器官有無病理學損傷，還有待進一步研究。

表1 小鼠急性毒性實驗結果

4 討論

松針提取液含有黃酮、多糖、多酚、蛋白質、莽草酸等多種有效成分，可改變鐵鋯氧化物的形貌結構，從而影響其對抗壞血酸的載藥率。CTMAB是一種典型的陽離子表面活性劑，可減少鐵鋯氧化物顆粒在溶液中的聚集，提高其比表面積和對抗壞血酸的載藥率。通過單一因素的實驗結果可以看出，當三氯化鐵和氯氧化鋯的摩爾比為8：1、加入0.5 g CTMAB、反應溫度為60 ℃、烘干時間為24 h時，合成的鐵鋯氧化物對抗壞血酸的最大負載率為97.82%。隨著反應時間的延長，抗壞血酸插層鐵鋯氧化物中的藥物向模擬胃液和腸液中逐漸釋放，從而使藥物釋放率隨時間延長而逐步增加，當反應時間為450 min時，最大釋放率分別為73.43%和 63.74%?；诩毙远拘缘膶嶒灲Y果可以看出，鐵鋯氧化物并無明顯急性毒性，適宜作為抗壞血酸的緩釋材料。

5 結論

利用松針提取液為綠色溶劑合成鐵鋯氧化物具有良好的生物相容性、對抗壞血酸具有較高的載藥率和緩釋性能，是一種較好的抗壞血酸類藥物的緩釋載體。