銀杏活腦膠囊高效液相色譜指紋圖譜研究*

覃鴻恩，漆立軍，徐元翠，夏永芳，彭磊，黃華斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥劑科，恩施 445000)

銀杏活腦膠囊是根據我院神經內科名老中醫(yī)的經驗方自主研制的中藥復方制劑，由銀杏葉提取物、刺五加、制首烏及三七四味中藥組成。具有活血散瘀、益氣健腦、補腎安神、改善腦供血、增強免疫等功能。主要用于神經衰弱、腦動脈硬化、腦震蕩、高血脂等的作用顯著，療效確切，且在我院相關?？剖褂幂^廣泛，作為我院產業(yè)化拳頭產品之一，給醫(yī)院和社會帶來顯著的效益[1-4]。銀杏活腦膠囊主要有效成分有紫丁香苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、蘆丁、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及大黃素等化學成分，這些主要成分對治療心腦血管疾病有一定的藥理作用[5-8]。目前，該制劑質量控制標準較低，且有關該制劑的質量控制標準及主要成分的基礎研究鮮有報道[9-10]，為了全面控制制劑質量，保證臨床用藥質量及效果，并為以后的深入研究提供參考，本實驗對銀杏活腦膠囊進行高效液相色譜指紋圖譜研究[11]。

1 材料

1.1儀器 Shimadu LC20A高效液相色譜儀(LC-20AD四元泵，SPD-M20A檢測器，SIL-20A進樣器日本島津公司)，YOKO-2X紫外線分析儀(武漢藥科新技術開發(fā)公司)，KQ-500VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，CPA225D電子天平(德國賽多利斯，感量為0.01mg)，HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海寶藍實驗儀器制造有限公司)。

1.2試藥 槲皮素對照品(批號：00081-201408，含量：99.1%)，山李酚對照品(批號：110861-201310，含量：93.2%)，異鼠李素對照品(批號：110860-201410，含量：99.9%)，紫丁香苷對照品(批號：111574-200603，含量：96.4%)，大黃素對照品(批號：0922-201506，含量：99%)，蘆丁對照品(批號：1008-201601，含量：98%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rb1對照品(批號：160106，含量：98%)，三七皂苷R1對照品(批號：160520，含量：98%)，均購于北京萬佳首化生物科技有限公司；人參皂苷Rg1對照品(批號：15121303，含量：98%，購于河南省標物生物科技有限公司)。

銀杏活腦膠囊(本院制劑室自制，批準文號：鄂藥制字Z20180310，批號：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：25～30 ℃；檢測波長：254 nm；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，見表1所示。

表1 流動相梯度洗脫

2.2供試品的制備 按照處方比例，取刺五加全量，制首烏0.7倍處方量加水煎煮，煎煮兩次，第一次加水10倍量，煎煮2 h，第二次加水8倍量，煎煮1.5 h，合并兩次煎煮液，濾過，濾液濃縮至浸膏(相對密度1.20～1.35)，備用；取剩余制首烏、三七干燥，粉粹成細粉，與銀杏葉提取物混勻，備用；上述浸膏與藥粉混合后制成顆粒，裝入膠囊，即得。同法制得4批銀杏活腦膠囊，即20180801，20180814，20180821，20180825。

分別取以上4批銀杏活腦膠囊內容物約0.5 g置于10 mL量瓶，加入甲醇定容至刻度，超聲提取15 min，濾過，粗濾，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試樣品溶液，每批取3個平行樣品。

2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取紫丁香苷、大黃素、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1，分別制成每毫升甲醇中含有以上對照品0.23，0.33，0.28，0.37，0.17，0.49，0.40，0.3，0.22 mg的溶液，冷藏，備用。

2.4混合對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對照品2.88 mg、大黃素對照品3.12 mg、蘆丁對照品1.78 mg、槲皮素對照品3.05 mg、異鼠李素對照品2.38 mg、山奈酚對照品2.42 mg、人參皂苷Rg1對照品3.75 mg、人參皂苷Rb1對照品3.20 mg及三七皂苷R1對照品2.89 mg，混合置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，溶解完全，備用。

2.4方法學考察

2.4.1精密度考察 取“2.2”項下同批次(批號：20180801)銀杏活腦膠囊供試溶液，按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次測定，記錄色譜圖。以重復性和分離度均較好的31號峰大黃素為參照峰S，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算二者RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.001%～0.034%，相對峰面積的RSD為0.010%～0.161%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性考察 取“2.2”項下同批次(批號：20180801)銀杏活腦膠囊供試溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別于制樣后0，2，4，8，12 h，吸取該供試品溶液10 μL，進樣，測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算二者RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.003%～0.050%，相對峰面積的RSD為0.014%～0.108%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復性考察 取銀杏活腦膠囊(批號：2018105)樣品，按照“2.2”項下方法制備6份供試品，并依據“2.1”項下色譜條件進樣，測定，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD，結果各共有峰相對保留時間的RSD為0.004%～0.026%，相對峰面積的RSD為0.019%～0.133%，表明該方法重復性良好。

2.5指紋圖譜的建立及主要色譜峰的化學指認 取6批銀杏活腦膠囊樣品(批號：2018005，2018025，2018069，2018105，2018141，2019029)，分別按照“2.2”項下方法制備，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣，得到銀杏活腦膠囊的HPLC指紋圖譜，根據相對保留時間和相對峰面積的比對，標記共有峰為33個，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD，結果見表2和表3。在相同的色譜條件下，測定對照品和混合對照品的特征指紋圖譜，并與銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜進行比對分析，最終確定9個特征共有峰的歸屬，見圖1。

表2 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相對保留時間結果

表3 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相對峰面積結果

2.6銀杏活腦膠囊HPLC指紋圖譜相似度評價 將“2.5”項下的6批銀杏活腦膠囊樣品的指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012 A版)進行相似度評價分析[12]，色譜峰自動匹配后，生成對照指紋圖譜，見圖2。以樣品4作為對照指紋圖譜，以其他樣品指紋圖譜作為對比，進行匹配，采用平均值法得到對照HPLC指紋圖譜，通過匹配分析后得到33個共有峰，即為銀杏活腦膠囊的共有指紋峰，并以31號特征峰(化學指認為大黃素)作為參照，設其保留時間和峰面積均為1，自動匹配，計算得到6批銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度，其結果依次為0.897，0.894，0.933，0.925，0.916，0.940。6批不同批次銀杏活腦膠囊樣品指紋圖譜相似度均在0.894～0.940之間，說明銀杏活腦膠囊各批次之間相似度較好，質量穩(wěn)定性較好。結果見表4。

表4 6批銀杏活腦膠囊指紋圖譜相似度結果

S1.供試品；S2.混合對照品；1.紫丁香苷；2.蘆丁；3.槲皮素；4.山奈酚；5.異鼠李素；6.人參皂苷Rb1；7.人參皂苷Rg1；8.三七皂苷R1；9.大黃素。

圖2 6批銀杏活腦膠囊供試品指紋圖譜及對照圖譜

3 討論

3.1供試品的制備 一方面，為了保證臨床療效，方中重要藥材三七、銀杏葉提取物及0.3倍處方量的制首烏均以原粉入藥，其余用水煎煮，通過提取工藝優(yōu)化后，確定以兩次水煎煮最佳；另一方面，因該方已經被申報為院內制劑，正在被批量生產用于臨床，實驗工藝應與生產工藝同步，從而降低制劑與實驗樣品的質量差異，使本次研究結果更能直觀地反映制劑質量。在制備樣品溶液時，考察了1%，2%，3%，5%，6%，8%的不同濃度，考察了甲醇、水、乙醇等不同溶劑，同時考察了不同提取方法，綜合考慮，最終確定最佳方法為濃度為5%，甲醇作為溶劑，超聲15 min。

3.2流動相的選擇 本次研究考察的流動相有甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈-水作為流動相時，峰型尖細修長，但是由于乙腈洗脫能力強，導致峰聚集，分離度較差，不利于相似度的分析；甲醇-水作為流動相時，峰型較差，時有肩峰出現，洗脫效果稍差；甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時，峰型最佳，肩峰較少，分離度較好。故最終確定以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫作為本次指紋圖譜研究的最佳流動相系統。同時，考察了0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL·min-1的流速條件，最終確定以流速為1.0 mL·min-1最為合適。由于成分較復雜，所產生的峰較多，故采用0～120 min內梯度洗脫，各峰分離效果較好，分布較均勻。

3.3波長的選擇 通過查閱文獻[13-17]，并且通過實驗，表明紫丁香苷的最大吸收波長是265 nm，大黃素的最大吸收波長為254 nm，蘆丁在257 nm處有最大吸收，槲皮素、山奈酚和異鼠李素的最佳吸收波長是360 nm，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的最佳吸收波長是203 nm。本實驗采用全波長掃描，通過3D色譜工作站進行分析，初步判斷吸收較好的波長范圍在230～275 nm之間。選擇230，254，275 nm再進一步進行分析比較，當波長為230 nm時，色譜圖中峰較少，分布不均勻，有部分拖尾峰出現；當波長為275 nm時，色譜圖出峰較晚，峰形差，雜質峰較多，分離度差；當檢測波長為254 nm時，色譜峰分離較好，峰形較好，且能夠較多的檢測到峰，因此確定以254 nm作為最佳檢測波長。

3.4進樣量和柱溫的考察 分別考察了2，4，6，8，10，12 μL的進樣量，比較各進樣量下的色譜圖，進樣量為10 μL的色譜峰，比較穩(wěn)定，雜質峰較少，因此采用的進樣量為10 μL；同時，考察了色譜柱溫度對色譜峰的影響，當柱溫在25～30 ℃范圍內，色譜峰峰形較好，穩(wěn)定性較好，故將柱溫確定在25～30 ℃之間為最佳。

3.5色譜峰的歸屬及相似度分析 本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”將銀杏活腦膠囊的供試品HPLC圖譜與混合對照品HPLC圖譜進行比較，初步確認出9個峰的化學歸屬，并將這9個峰進行藥材歸屬分析，其中，1號峰紫丁香苷主要來自刺五加，2號峰蘆丁、3號峰槲皮素、4號峰山奈酚和5號峰異鼠李素主要來自銀杏葉提取物，6號峰人參皂苷Rb1，7號峰人參皂苷Rg1，8號峰三七皂苷R1主要在三七藥材中顯著突出，9號峰大黃素來自于制何首烏。所建立的HPLC指紋圖譜，通過確認和分析，產生共有峰33個，說明不同批次有較多的相近的組成成分，可以說明該生產工藝和制備方法具有較高的穩(wěn)定性和成分保留率高。在對6個不同批次的指紋圖譜進行相似度分析時發(fā)現，有兩批樣品的相似度稍低(<0.900)，其他4批樣品的相似度均高于0.900，說明該產品的質量比較穩(wěn)定，差異較小，質量一致性好。

綜上所述，該指紋圖譜能夠表達出銀杏活腦膠囊的所有原藥材的主要成分，而這些主要成分也是銀杏活腦膠囊發(fā)揮藥效的關鍵，因此通過本次研究得到的銀杏活腦膠囊HPLC指紋圖譜，可作為銀杏活腦膠囊質量控制的指標之一。本次HPLC指紋圖譜的研究也為未來銀杏活腦膠囊的進一步研究提供基礎，有助于推動銀杏活腦膠囊的臨床評價研究，促使該藥品得到更廣泛的應用。