殼聚糖及其衍生物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展*

陳 浩，秦曉飛，馮 昆

（遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東 珠海 519090）

甲殼素是自然界中僅次于纖維素的第二大生物活性多糖，不溶于有機(jī)溶劑，具有高度有序的結(jié)晶化結(jié)構(gòu)及較低化學(xué)活性［1］。甲殼素最早由法國(guó)化學(xué)家Henri 于1811 年提出，源于希臘語(yǔ)單詞“chiton”，意為覆蓋、涵蓋之意，其基本單元是N- 乙酰氨基-D- 葡萄糖，由β-1，4糖苷鍵連接［2］。雖然在自然界中含量豐富，但水不溶性極大地限制了其應(yīng)用。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物（常把脫乙酰度大于40%的甲殼素稱為殼聚糖，商業(yè)中售賣的殼聚糖脫乙?；潭葹?0%～90%）［3］，具有良好的生物相容性、生物降解性、親水性、無(wú)毒無(wú)害性、抗氧化性及與離子、染料結(jié)合的性質(zhì)，可作為抗菌劑、藥物載體、組織工程材料等廣泛使用。目前多數(shù)文獻(xiàn)側(cè)重于對(duì)殼聚糖單一的修飾或應(yīng)用，關(guān)于殼聚糖的完整報(bào)道較少。在此對(duì)殼聚糖的來(lái)源、修飾改性、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，旨在為后續(xù)研究提供參考。

1 殼聚糖的來(lái)源

全球每年產(chǎn)生6 × 109～8 × 109kg 蝦蟹殼［4］，但利用并不充分，不僅造成了資源浪費(fèi)，也帶來(lái)環(huán)境污染［5］。甲殼動(dòng)物殼中甲殼素的含量為15%～40%［6］，如能得到充分利用，將帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

目前，關(guān)于自然界中直接獲得殼聚糖的報(bào)道較少，還有待發(fā)掘。漁業(yè)廢棄物蝦蟹殼、魚鱗等是目前殼聚糖的主要來(lái)源［1，7］，大多數(shù)昆蟲（如甲蟲、蝗蟲、蠶和食蟲）及真菌靈芝菌、植物唐菖蒲等中均含有甲殼素。近年來(lái)殼聚糖的各種生物來(lái)源及其表征方法見表1（表中，F(xiàn)T-IR 為傅里葉變換紅外光譜法，XRD 為X 射線衍射法，TGA為熱重分析法，DSC為差示掃描量熱法，DTA為差示熱分析法，SEM 為掃描電鏡法，EDS 為X 射線能譜分析法，NMR為核磁共振法）。

表1 殼聚糖的來(lái)源及表征方法Tab.1 Sources and characterization methods of chitosan

海產(chǎn)廢棄物利用率低，所致環(huán)境污染問(wèn)題嚴(yán)重。利用海產(chǎn)廢棄物生產(chǎn)殼聚糖不僅能減少資源浪費(fèi)，提高經(jīng)濟(jì)效益，還能保護(hù)環(huán)境，是目前殼聚糖的主要來(lái)源［3］。此外，陸地甲殼動(dòng)物的外骨骼、真菌及部分植物也是殼聚糖的重要來(lái)源，且不同來(lái)源的殼聚糖的理化性質(zhì)不盡相同，應(yīng)用方式也存在差異，更多的殼聚糖來(lái)源還有待發(fā)現(xiàn)。

2 殼聚糖的修飾改性

2.1 理論基礎(chǔ)

殼聚糖為線性陽(yáng)離子多糖，呈白色片狀或粉末狀固體，無(wú)毒，不溶于普通有機(jī)溶劑。甲殼素脫乙?；笫箽ぞ厶欠肿又泻杏坞x的氨基，故殼聚糖能溶于酸性水溶液，且有陽(yáng)離子特性，能與聚陽(yáng)離子相互作用，形成聚電解質(zhì)的配合物［8］。殼聚糖的脫乙?；潭仍礁撸肿渔溨邪被馁|(zhì)子化程度越高，溶解越容易，殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量越大，其聚合物鏈內(nèi)和分子間氫鍵就越多，分子間相互糾纏，難以溶解［20］。殼聚糖中存在α，β 和γ 3種不同的晶體結(jié)構(gòu)，與甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)相同。

盡管殼聚糖來(lái)源廣泛，但其自身固有理化性質(zhì)也限制了對(duì)其的利用，故對(duì)其修飾改性必不可少［21］，殼聚糖獨(dú)特的結(jié)構(gòu)為其修飾改性提供了豐富的思路。殼聚糖結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)活性基團(tuán)：C—2位的氨基、C—3位的初級(jí)羥基和C—6位的次級(jí)羥基，初級(jí)羥基空間位阻較小可自由旋轉(zhuǎn)，而次級(jí)羥基空間位阻較大，不能轉(zhuǎn)動(dòng)［20］。因此3 個(gè)活性基團(tuán)的活躍順序?yàn)榘被? 初級(jí)羥基>次級(jí)羥基［22］。殼聚糖可在氨基和羥基上進(jìn)行?；?、烷基化、羧化、四元化、接枝共聚等化學(xué)改性和物理改性。通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行物理化學(xué)修飾，以獲得具有更好的溶解度、生物相容性、抑菌活性及其他活性優(yōu)異的衍生物，同時(shí)還能改善殼聚糖的熱穩(wěn)定性、流變性和抗氧化性等。

2.2 常見方法

2.2.1 化學(xué)方法

酰化：殼聚糖的?；侵笟ぞ厶桥c有機(jī)酸及其衍生物發(fā)生反應(yīng)，在分子鏈上引入脂肪基團(tuán)或芳香基團(tuán)［23］。?；菤ぞ厶亲畛Ｒ姷男揎椃椒?，能破壞其分子內(nèi)和分子間的氫鍵，降低結(jié)晶度，提高水溶性。與氨基發(fā)生酰化形成酰胺的反應(yīng)稱為N-?；?，當(dāng)C—2位存在保護(hù)基團(tuán)時(shí)，?；磻?yīng)發(fā)生在C— 6 位的羥基上，這稱為O-?；-?；瘹ぞ厶瞧茐牧藲ぞ厶堑臍滏I結(jié)構(gòu)，提高了殼聚糖的脂溶性和疏水性，而使其可溶解于吡啶、氯仿等有機(jī)溶劑中［24］。O-酰化殼聚糖常見于高分子材料的薄膜中，可以提高材料的疏水性和穩(wěn)定性。N- 酰化殼聚糖衍生物具有良好的生物相容性、抗凝血性和血液相容性，且不會(huì)引起機(jī)體的炎性反應(yīng)［25］。N-?；瘹ぞ厶堑娜芙舛热Q于取代度和側(cè)鏈長(zhǎng)度。研究表明，當(dāng)取代度小于50%時(shí)，殼聚糖的取代度越大，溶解度也越大，且其側(cè)鏈越長(zhǎng)，結(jié)晶度越高，溶解度越低［26］。N-酰化殼聚糖的溶解度較高，故可作為疏水性藥物的載體；結(jié)晶度較高，能提高纖維韌性和熱穩(wěn)定性，故可用于制備聚氯乙烯纖維薄膜材料［25］。殼聚糖的酰化改性通常用來(lái)提高其溶解度，增加與材料結(jié)合的能力。

烷基化：原理與?；嗤鶠槠茐臍ぞ厶堑臍滏I以提高其溶解度［27］。不同的是，烷基為疏水基團(tuán)，其溶解度在引入過(guò)長(zhǎng)的烷基時(shí)不增反減，表明殼聚糖烷基化衍生物的溶解度可通過(guò)調(diào)節(jié)烷基的長(zhǎng)度來(lái)控制［28］。在殼聚糖的3 個(gè)活性位點(diǎn)中，C — 2 位的基團(tuán)具有很強(qiáng)的親核孤對(duì)電子，因此更易發(fā)生N- 烷基化反應(yīng)。WEI 等［29］設(shè)計(jì)并合成了一系列以6-O-氯代乙酰殼聚糖為原料的殼聚糖衍生物，發(fā)現(xiàn)隨著烷基鏈的延長(zhǎng)，季銨鹽殼聚糖衍生物對(duì)真菌的抗菌性能下降。殼聚糖烷基化衍生物還能用于藥物傳遞載體材料和制備生物膜等。殼聚糖的N-烷基化反應(yīng)，不僅改變了自身的溶解度，也改變了殼聚糖的活性。

羧化：主要利用氯代鏈烷酸或乙醛酸與殼聚糖基上C—2位的氨基或C—6位的羥基發(fā)生反應(yīng)，生成含羧基的殼聚糖［30］，以此來(lái)提高殼聚糖的溶解性、保濕性和成膜性，擴(kuò)大殼聚糖的應(yīng)用范圍。目前，殼聚糖的羧化反應(yīng)多以羧甲基化的形式進(jìn)行。C—6位的羥基最易取代，其次是C — 3 位的羥基，難度最大的是C— 2 位的氨基。N- 羧甲基化、O- 羧甲基化或N，O- 羧甲基化殼聚糖可通過(guò)不同的反應(yīng)條件和試劑制備［31］。O- 羧甲基化殼聚糖反應(yīng)在一氯乙酸和氫氧化鈉的存在下，以異丙醇/ 水為溶劑，在室溫或冰浴中發(fā)生。N- 羧甲基化和N，O- 羧甲基化主要發(fā)生在溫度升高時(shí)。N-羧甲基化和N，N-羧甲基化可通過(guò)殼聚糖與乙醛酸反應(yīng)，并使用氰基硼氫化鈉還原制備［32］。殼聚糖的羧化反應(yīng)是大多數(shù)殼聚糖修飾的第一步，且較易發(fā)生，從而提高其活性。

四元化：殼聚糖中含游離氨基，故可制備為季銨鹽衍生物。殼聚糖季銨化的方法主要有直接季銨鹽取代法、N-烷基化法和環(huán)氧衍生物開環(huán)法，均是在氨基上引入具有較大的空間位阻及較強(qiáng)親水性的季銨鹽基團(tuán)。因此，四元化的殼聚糖溶解度明顯提高［33］。季銨鹽殼聚糖衍生物還具有良好的生物相容性、生物降解性、抗菌性能、無(wú)毒性，以及優(yōu)秀的黏附性能和穿透黏液層與上皮結(jié)合的能力，在生物醫(yī)學(xué)、能源等方面廣泛應(yīng)用。

接枝共聚：殼聚糖分子中前述3個(gè)活性基團(tuán)均可作為接枝反應(yīng)位點(diǎn)，與酚類化合物、聚醚鏈、烷基鏈等結(jié)合后，引入相應(yīng)基團(tuán)［34］。當(dāng)通過(guò)化學(xué)改性引入各種側(cè)鏈時(shí)，位點(diǎn)特異性的定量引入成為難點(diǎn)，而殼聚糖3 個(gè)位點(diǎn)的反應(yīng)活性差異很小，反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化也很困難，限制了殼聚糖的應(yīng)用［35］。因此，合適的反應(yīng)試劑、溫和的反應(yīng)條件和高效的分離方法已成為殼聚糖接枝改性的研究熱點(diǎn)。常用的引發(fā)劑有過(guò)硫酸鉀、過(guò)硫酸銨、硝酸鈰銨、硫酸亞鐵銨等。ORTIZ 等［36］以硝酸鈰銨為引發(fā)劑，制備了馬來(lái)酸瓊脂糖乙烯基接枝共聚物，提高了產(chǎn)物的含氮量。

其他：殼聚糖修飾改性的其他化學(xué)方法還有酯化、硫醇化、羥基烷基化、磺化等［37］。殼聚糖的改性均是圍繞殼聚糖的溶解度、與材料的結(jié)合能力、生物活性進(jìn)行修飾，期望得到活性更高、應(yīng)用范圍廣泛、安全無(wú)毒的殼聚糖衍生物。

2.2.2 物理方法

目前主要使用化學(xué)方法對(duì)殼聚糖改性，但隨著研究的深入，其物理改性方法也越發(fā)受到重視。例如，機(jī)械研磨可產(chǎn)生高度均勻的納米結(jié)構(gòu)材料，可優(yōu)化材料的力學(xué)性能［38］；輻照主要用于引發(fā)接枝共聚，比化學(xué)方法簡(jiǎn)單，且無(wú)須催化劑的參與［39］；超聲可有效破壞多糖聚合物的分子間或分子內(nèi)氫鍵，使得聚合物斷裂，分子量降低。物理改性過(guò)程中無(wú)有毒試劑參與，最大優(yōu)勢(shì)是安全無(wú)毒。

2.2.3 酶法

酶法反應(yīng)條件溫和，且能避免化學(xué)試劑的使用［40］。

3 殼聚糖及其衍生物的應(yīng)用

3.1 抑菌劑

殼聚糖由于自身優(yōu)秀的抗菌性能、來(lái)源廣、產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是理想的抗菌材料。目前關(guān)于其糖抗菌機(jī)制［20］（圖1）有以下推論：1）作為螯合劑，選擇性地結(jié)合金屬離子，抑制微量元素和營(yíng)養(yǎng)素的吸收，從而抑制毒素的產(chǎn)生和微生物的生長(zhǎng)；2）活化結(jié)合細(xì)胞壁成分，使細(xì)菌因細(xì)胞壁分解而死亡；3）所帶正電荷能與帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌生物膜破裂，引發(fā)蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分外泄，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；4）進(jìn)入微生物細(xì)胞核中與DNA 相結(jié)合，干擾和抑制蛋白質(zhì)的合成［20，41］。

圖1 殼聚糖的抑菌機(jī)制Fig.1 Antibacterial mechanism of chitosan

中性或堿性殼聚糖懸浮液的抑菌活性低于酸性殼聚糖溶液。殼聚糖的最佳抑菌pH 為6.0，且隨殼聚糖脫乙?；潭鹊脑黾佣龃螅?2］。與低分子殼聚糖一樣，高分子殼聚糖的抑菌活性也是由其分子側(cè)鏈在酸性溶液中氨基質(zhì)子化和陽(yáng)離子化而產(chǎn)生的，其長(zhǎng)分子鏈有利于包覆和結(jié)合細(xì)菌，間接提高了抗菌活性，細(xì)菌首先被殼聚糖抑制，然后細(xì)胞壁逐漸斷裂和分解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［43］。殼聚糖中的電荷密度也是影響抗菌活性的關(guān)鍵因素，這和殼聚糖與細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層電荷表面的強(qiáng)靜電作用有關(guān)［44］。YAN 等［45］制備的新型殼聚糖衍生物顯示出對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的良好抑菌活性，能破壞細(xì)胞膜的完整性，同時(shí)也證明殼聚糖能降低細(xì)胞表面的疏水性、細(xì)胞活力和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)。

殼聚糖及其衍生物抗菌活性好，被廣泛應(yīng)用于制備抗菌材料、組織工程材料等。殼聚糖支架材料正是研究的熱點(diǎn)之一。殼聚糖及其衍生物因其抗菌活性也被制備為各種制劑如納米粒、薄膜、水凝膠、復(fù)合敷料等［46］。ALQAHTANI 等［47］用離子凝膠法制備了殼聚糖納米粒，表現(xiàn)出對(duì)淋球菌的抑菌活性，同時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用，具有治療淋病的潛力。

抗菌劑是目前殼聚糖應(yīng)用的研究熱點(diǎn)之一（見表2）。關(guān)于殼聚糖抑菌劑的研究較多，但大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

表2 殼聚糖及其衍生物的抑菌作用Tab.2 Antibacterial function of chitosan and its derivatives

3.2 藥物載體

利用最新的納米技術(shù)開發(fā)聚合物給藥系統(tǒng)在醫(yī)藥領(lǐng)域引起關(guān)注。殼聚糖是一種很有前途的天然聚合物［65］，可用于納米給藥系統(tǒng)。殼聚糖具有抑菌作用、殺菌作用、止血性、抗?jié)?、抗炎、抗氧化、抗糖尿病和神?jīng)保護(hù)作用，其結(jié)構(gòu)與膠原相似，可用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)［66］。以殼聚糖為基礎(chǔ)的藥物遞送系統(tǒng)，可用于蛋白質(zhì)/肽、生長(zhǎng)因子、抗炎藥、抗生素、抗癌藥物、疫苗［67］等的傳遞，也可用于基因治療［68］。

殼聚糖的一個(gè)重要特點(diǎn)是其黏附力強(qiáng)，原因是聚合物鏈上帶正電荷的氨基與富含唾液酸和磺酸的帶負(fù)電荷的黏蛋白殘基之間的靜電相互作用［69］。殼聚糖基納米載體具有體積小、比表面積大、黏附性能好等優(yōu)點(diǎn)，能促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)藥物的控釋、緩釋或降低藥物的細(xì)胞毒性［70-71］。殼聚糖無(wú)論是單用還是作為復(fù)合材料使用，均適合于制備不同類型的載藥制劑，如納米粒、水凝膠、復(fù)合材料、微球、創(chuàng)面材料等［72-73］，相關(guān)研究進(jìn)展見表3。殼聚糖基藥物載體有緩釋控釋作用，間接提高了藥效，同時(shí)還具有靶向性及提高黏附能力的特性。

表3 殼聚糖載藥制劑研究進(jìn)展Tab.3 Research progress of chitosan drug loaded preparations

3.3 組織工程材料

生物材料在組織工程中的研究越發(fā)深入。生物工程材料是在金屬或高分子材料的基礎(chǔ)上形成不同的結(jié)構(gòu)，并能引起特定組織的特定反應(yīng)，因此它們需要有良好的物理、生物和力學(xué)性能［96］。殼聚糖基材料不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，還具有能形成不同結(jié)構(gòu)、與多種生物活性材料結(jié)合等優(yōu)異性能，是理想的生物活性材料［97］。目前殼聚糖基組織工程材料主要應(yīng)用于軟骨組織工程、骨組織工程、椎間盤組織工程、血管組織工程、角膜再生、皮膚組織工程、牙周組織工程等［98］。殼聚糖基組織工程材料在皮膚、血管、角膜、骨等組織和器官中的應(yīng)用，預(yù)示著其在修復(fù)、固定和再生方面的應(yīng)用前景。但相互作用過(guò)程機(jī)制研究較少，形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不夠，還有待更深入的研究。

MAHARJAN 等［99］將再生纖維素納米纖維引入殼聚糖水凝膠制備了再生纖維/ 殼聚糖復(fù)合支架，結(jié)果表明，該支架有更高的抗壓強(qiáng)度，能增強(qiáng)前成骨細(xì)胞活性、附著能力和增殖能力，具有良好的成骨分化能力。SHAABANI 等［100］開發(fā)了一種新型親水性半導(dǎo)電殼聚糖衍生物，將其作為新型成骨劑，表現(xiàn)出良好的形狀記憶性能和形狀恢復(fù)率，有良好的自愈合價(jià)值。這些多功能工程材料均為組織工程中有廣泛應(yīng)用前途的生物材料。

4 結(jié)語(yǔ)

甲殼素與殼聚糖在自然界中含量豐富，深受人們的關(guān)注。目前，殼聚糖的主要來(lái)源仍是海產(chǎn)廢棄物，如蝦蟹殼等。同時(shí)，人們也致力于開發(fā)殼聚糖的其他來(lái)源，如陸地甲殼動(dòng)物的外骨骼、蠶繭及真菌和植物來(lái)源，但此部分研究有待進(jìn)一步開展。殼聚糖的修飾改性主要以其溶解性、藥理活性、抑菌活性及與材料結(jié)合的能力作為改性方向，旨在擴(kuò)大殼聚糖的應(yīng)用范圍。殼聚糖作為抑菌劑、藥物載體和組織工程材料得到廣泛使用，但在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的機(jī)制探索層次較淺，復(fù)雜程度較低，要實(shí)現(xiàn)實(shí)際應(yīng)用還需更深入地研究。