上游刺激因子1對腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及體外血管生成的影響

李宇 劉宇翔 薩麗波

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)的原發(fā)性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，臨床治療以手術(shù)、放療及化療為主，但效果不佳[1]。既往研究表明，血管生成在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[2]。據(jù)報道MOV10結(jié)合circ-DICER1通過miR-103a-3p/miR-382-5p途徑介導(dǎo)ZIC4的表達改變進而調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成[3]。在膠質(zhì)瘤中血管素（Vasorin，VASN）高表達會刺激腫瘤惡性進展及血管生成[4]。 FUS/circ_002136/miR-138-5p/SOX13反饋環(huán)在膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)血管生成[5]。因此，抗血管生成被認為是治療腦膠質(zhì)瘤的重要方法，需要對腦膠質(zhì)瘤的血管生成進行深入研究。

腦膠質(zhì)瘤的進展取決于腫瘤血管的生長。膠質(zhì)瘤細胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等促血管生成因子來促進血管內(nèi)皮細胞的生長。此外，膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細胞也分泌許多促進腫瘤生長的因子，這些因子的相互作用可以促進腦膠質(zhì)瘤的生長[6]。上游刺激因子（Upstream stimulating factors，USF）基因主要包括USF1和USF2[7]，具有高度保守的bHLH-LZ結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合E-box的一致序列CANNTG來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[8～10]。USF1基因 定位于chr1q22-23，能夠編碼含有310個氨基酸殘基的蛋白，共有10個外顯子，總長4kb。USF1在腦膠質(zhì)瘤細胞中能夠與組織蛋白酶B啟動子區(qū)的E-box序列結(jié)合，增加其啟動子活性，促進其表達，調(diào)控腫瘤的侵襲和進展[11]。

在前期工作中發(fā)現(xiàn)USF1在腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞（Glioma microvascular endothelial cell，GEC）中的表達水平顯著高于其在人腦微血管內(nèi)皮細胞（Human cerebral microvascular endothel cell，EC）中的。而USF1對GEC的增殖、遷移和體外血管生成等方面的影響目前尚不十分清楚，值得深入研究，我們的研究將可能為腦膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療提供一個新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3 和人膠質(zhì)瘤細胞系U87均購自上海富衡生物科技有限公司；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基ECM （ScienCell）、DMEM培養(yǎng)基（HyClone）、胎牛血清（Gibco）、USF1過表達和沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒均購自蘇州吉瑪公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX and PLUS Reagents購自Life公司； CCK-8 Kit購自日本同仁公司；吉姆薩染液、胰蛋白酶均購自北京索萊寶公司；基質(zhì)膠購自BD公司；兔抗人USF1多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的抗鼠IgG抗體均購自Proteintech公司； SDS-PAGE配膠試劑盒、一抗稀釋液、ECL超敏發(fā)光液均購自上海碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立人GEC模型 用直徑100mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)U87細胞，近融合時棄去DMEM高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清），用無血清培養(yǎng)液沖洗兩次，然后加入無血清ECM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用50ml離心管收集，4℃ 離心10min，收集上清液，加入5%胎牛血清，配成膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，用其培養(yǎng)hCMEC/D3（EC）細胞72h后，人GEC模型建立成功。

1.2.2 建立USF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系 sh-USF1質(zhì)粒（序列 為GCAGATTCAGGAAGGTGCAGT）的載體為pGPU6/GFP/Neo， USF1過表達質(zhì)粒的載體為pcDNA3.1（+），陰性對照為相應(yīng)質(zhì)粒的空載體。GEC細胞生長狀態(tài)良好時將其接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine LTX and PLUS，將USF1過表達和表達沉默的質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對照質(zhì)粒分別進行轉(zhuǎn)染，大約4周后經(jīng)G418篩選培養(yǎng)得到USF1過表達和表達沉默的GEC系，收集細胞，提取細胞中的蛋白質(zhì)進行樣品制備，Western blot檢測USF1蛋白的表達，BCA法測定蛋白樣品濃度，電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、抗體孵育、洗膜、ECL發(fā)光，驗證轉(zhuǎn)染效率。在后續(xù)進行的實驗中將其分為5組：①對照（Control）組；②USF1（+）NC組；③USF1（+）組；④USF1（-）NC組；⑤USF1（-）組。

1.2.3 細胞生長抑制實驗（CCK-8法） 轉(zhuǎn)染后分組的GEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，密度為2 000 個/孔，每孔加入200μl膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后換液，每孔加100μl培養(yǎng)液及10μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2h后酶標(biāo)儀檢測OD值，波長450nm。細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白OD值）/（對照組OD值-空白OD值）×100%。獨立進行3次實驗，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，取平均值計算分析。

1.2.4 細胞遷移實驗 24孔細胞培養(yǎng)板中Transwell小室的上室分別加入100μl密度為5×105/ml無血清膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后分組的GEC細胞，下室加入600ml含5%胎牛血清的膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育24h后取出Transwell小室，上表面的細胞用棉簽輕輕擦拭去除，固定液由甲醇和冰醋酸按照3∶1比例配制，細胞固定30min，然后用10%吉姆薩染液染色30min，PBS充分沖洗，每孔至少3次，在高倍鏡視野中隨機選取5個視野，計數(shù)細胞遷移的數(shù)目。獨立進行3次實驗，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，取平均值進行分析。

1.2.5 體外血管生成實驗 將96孔板進行預(yù)冷處理，每孔加入100μl基質(zhì)膠，37℃放置30min使其聚合，每孔分別加入100μl膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后分組的hCMEC/D3細胞，密度為4×105/ml，培養(yǎng)箱中孵育24h后隨機取5個高倍鏡視野進行拍照，計數(shù)微血管的長度及分支數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件對采集的數(shù)據(jù)進行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量資料，兩組間數(shù)據(jù)的分析采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)的分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USF1過表達和表達沉默對GEC增殖能力的影響與對照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組細胞增殖能力增強（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組細胞增殖能力降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 USF1過表達和表達沉默對GEC增殖能力的影響

2.2 USF1過表達和表達沉默對GEC遷移能力的影響與對照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細胞遷移能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組細胞的遷移能力增強（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組細胞的遷移能力降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 USF1過表達和表達沉默對GEC遷移能力的影響

2.3 USF1過表達和表達沉默對GEC血管生成能力的影響與對照組比較，USF1（+）NC組和USF1（-）NC組的細胞體外血管生成能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與USF1（+）NC組比較，USF1（+）組內(nèi)皮細胞的體外血管生成能力增強（P<0.05）；與USF1（-）NC組比較，USF1（-）組內(nèi)皮細胞的體外血管生成能力降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 USF1過表達和表達沉默對GEC血管生成能力的影響

3 討論

上調(diào)GEC中USF1的表達后，GEC的增殖、遷移和血管生成能力均增強；下調(diào)GEC中USF1的表達后，GEC的增殖、遷移和血管生成能力均減弱。上述結(jié)果說明了USF1過表達能夠增強GEC的增殖、遷移和血管生成能力，抑制USF1的表達能夠降低GEC增殖、遷移和血管生成能力。

在各種組織細胞中，USF基因表達廣泛，是一種重要的調(diào)節(jié)因子，各種蛋白的轉(zhuǎn)錄過程都有其參加調(diào)節(jié)[12]。在人血管平滑肌細胞中，USF1與cGMP依賴蛋白激酶1的啟動子區(qū)的E-box序列結(jié)合，增加其啟動子活性，調(diào)控其表達進而調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的生長和分化[13]。USF1參與調(diào)控40余種心血管相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

在腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細胞的抗血管生成治療是治療高級別膠質(zhì)瘤的有效方法。然而，由于血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry，VM）的存在，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療在改善患者總體中位生存率方面沒有顯著效果。研究發(fā)現(xiàn)USF1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中的表達上調(diào)。敲除USF1通過刺激 SNHG16和linc00667 抑制膠質(zhì)瘤細胞中VM相關(guān)蛋白的表達。通過SNHG16/miR-212-3p和linc00667/miR-429軸抑制腦膠質(zhì)瘤細胞血管生成擬態(tài)[15]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HAS2-AS1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中高表達，與預(yù)后不良顯著相關(guān)。沉默 HAS2-AS1 表達能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲。USF1在膠質(zhì)瘤中高表達，與HAS2-AS1水平呈正相關(guān)。USF1通過結(jié)合HAS2-AS1啟動子區(qū)域激活HAS2-AS1的轉(zhuǎn)錄，從而增強膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移能力[16]。膠質(zhì)母細胞瘤是最具侵襲性和致命性的腫瘤之一。MUC13 是一種膜結(jié)合粘蛋白，在膠質(zhì)母細胞瘤干細胞 （Glioblastoma stem cell，GSC）中的表達顯著增強。MUC13的過表達顯著增強了GSC的侵襲和遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)USF1可以結(jié)合 MUC13 的啟動子區(qū)域，從而增強 MUC13的激活。研究證明USF1 主要通過激活 MUC13來增強GSC的增殖和自我更新進而促進膠質(zhì)母細胞瘤的進展[17]。研究發(fā)現(xiàn)USF1不僅在腦膠質(zhì)瘤中在其他癌癥中對癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、侵襲等方面也有調(diào)控作用。據(jù)報道在膽管癌中ZFAS1的上調(diào)提示膽管癌預(yù)后不佳，ZFAS1通過miR-296-5p調(diào)控USF1的表達促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。在皮膚鱗狀細胞癌中USF1通過誘導(dǎo)LINC01048上調(diào)促進癌細胞增殖，并且通過結(jié)合TAF15轉(zhuǎn)錄激活YAP1誘導(dǎo)癌細胞的凋亡[19]。在肺癌中USF1通過誘導(dǎo)長鏈非編碼RNA WDFY3-AS2過表達并通過靶向調(diào)節(jié)miR-491-5p/ZNF-703軸促進肺癌的發(fā)展[20]。USF1還能通過上調(diào)TGF-β信號通路進而促進黑色素瘤的發(fā)生[21]。USF1在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，通過LncRNA LOXL1-AS1/ miR-708-5p/USF1通路來進行調(diào)節(jié)[22]。 USF1還能通過介導(dǎo)的lncRNA GAS6-AS2上調(diào)并通過miR-934/BCAT1軸促進骨肉瘤的進展[23]。在宮頸癌中USF1主要通過轉(zhuǎn)錄激活p65的表達促進宮頸癌細胞的惡性發(fā)展[24]。

綜上所述，USF1可能在調(diào)控GEC的生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用。具體的調(diào)控機制還有待進一步深入研究，以為腦膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新靶點和新策略。