調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤放療聯(lián)合免疫治療中的研究進(jìn)展

郭茹玥，韓高華

1大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧大連116044

2泰州市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇泰州225300

放療是治療惡性腫瘤最常用的一種手段，主要是通過直接輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤患者生存率的影響通常表現(xiàn)為局部控制腫瘤，減少全身轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，放療除了直接損傷腫瘤細(xì)胞外，還可改變腫瘤微環(huán)境，誘導(dǎo)具有治療意義的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)也激活了免疫抑制途徑，腫瘤放療后的療效與免疫網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。輻射腫瘤微環(huán)境可觀察到多層次調(diào)控，包括腫瘤血管系統(tǒng)損傷、免疫微環(huán)境改變、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）浸潤增多等。在各種類型的腫瘤中，Treg細(xì)胞的高浸潤與低生存率有關(guān)，可使多種免疫細(xì)胞失活、凋亡，為腫瘤細(xì)胞的生長浸潤提供庇護(hù)所。因此，需要尋找最佳的治療方法減少Treg細(xì)胞或減弱其在腫瘤組織中的抑制活性，同時(shí)激活腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞，提高放療的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

1 Treg的概述

Treg細(xì)胞是一類抑制性T細(xì)胞的功能亞群，最早追溯到1970年就有研究者提出抑制性T細(xì)胞這一概念，1980年有學(xué)者在小鼠模型中證實(shí)了該細(xì)胞具有免疫抑制的作用，1995年Sakaguchi等正式確認(rèn)其作用并發(fā)表報(bào)道。目前許多不同類型的Treg細(xì)胞已被鑒定，最突出的類型是自然發(fā)生在胸腺的Treg（natural Treg，nTreg）和外周誘導(dǎo)型Treg（induced Treg，iTreg）。

胸腺T細(xì)胞在成熟階段開始表達(dá)T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）序列，通過陽性和陰性的選擇產(chǎn)生有功能的T細(xì)胞識(shí)別外來抗原發(fā)揮其免疫功能。陽性選擇的目的是使那些表達(dá)TCR識(shí)別自身（或宿主）主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的T細(xì)胞存活下來，陰性選擇主要導(dǎo)致與自身MHC-抗原肽親和力高的T細(xì)胞被排除。然而，一些具有自身反應(yīng)性TCR的T細(xì)胞在與具有高親和力的自身抗原肽相互作用后可以發(fā)育成Treg。這種自然發(fā)育的Treg占外周CD4T細(xì)胞群的5%～10%，并以CD25的高表達(dá)和CD45RB亞型的低表達(dá)水平為特征，在維持自我免疫耐受和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。iTreg主要來源于外周免疫系統(tǒng)中的CD4T細(xì)胞，其形成較為復(fù)雜，決定iTreg細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因素包括抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）的類型、分化狀態(tài)以及激活過程中的細(xì)胞因子環(huán)境。腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞在分化的未成熟階段被阻斷并具有耐受性，可以刺激Treg細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1（indoleamine 2,3-dioxy-genase 1，IDO-1）等也可明顯促進(jìn)CD4T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。

2 Treg介導(dǎo)的免疫抑制

Treg細(xì)胞是外周對(duì)自身和非自身抗原耐受的重要介質(zhì)，通過多種抑制機(jī)制實(shí)現(xiàn)這種免疫調(diào)節(jié)控制。①細(xì)胞接觸依賴機(jī)制：Treg細(xì)胞表面可表達(dá)特異性蛋白分子——叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、TGF-β、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）等。FOXP3是Treg細(xì)胞產(chǎn)生、維持免疫抑制功能的主要調(diào)控基因，在原始T細(xì)胞中表達(dá)FOXP3可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫抑制。研究發(fā)現(xiàn)，具有FOXP3基因移碼突變的小鼠由于缺乏Treg細(xì)胞可使效應(yīng)T細(xì)胞活化增加，轉(zhuǎn)染FOXP3的CD4CD25原始T細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為CD4CD25Treg細(xì)胞，產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子并表達(dá)主要的Treg細(xì)胞表面分子，如CD25、CTLA-4、TGF-β、GITR等，這些分子的具體免疫抑制機(jī)制將于下文提到。②分泌抑制性細(xì)胞因子：Treg細(xì)胞通過分泌包括TGF-β、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白細(xì)胞介素-35（interleukin-35，IL-35）等抑制性細(xì)胞因子顯示其抑制活性。TGF-β、IL-10主要通過抑制樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)CD8T細(xì)胞的功能并促進(jìn)CD4T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞發(fā)揮作用；IL-10可影響巨噬細(xì)胞的分化削弱其殺死腫瘤細(xì)胞的能力，其受體缺失的Treg細(xì)胞無法維持FOXP3的表達(dá)；IL-35是Treg細(xì)胞分泌的一種新型免疫抑制分子，在進(jìn)入組織后通過“感染耐受”使接觸到的非Treg細(xì)胞具備抑制其他細(xì)胞的能力。③腫瘤微環(huán)境中特定代謝產(chǎn)物如IDO-1、腺苷的局部積累可抑制效應(yīng)T細(xì)胞，促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝的加速導(dǎo)致葡萄糖的消耗和脂肪酸的增加，脂肪酸代謝促進(jìn)Treg的發(fā)育。④Treg細(xì)胞通過分泌穿孔素、顆粒酶A/B等對(duì)B細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞（natural killer T cell，NKT）產(chǎn)生抑制作用，此外Treg細(xì)胞還能抑制Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的激活。

3 放療對(duì)Treg的影響

作為臨床上常用的一種治療方法，放療主要通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、阻斷腫瘤血管再生及改變腫瘤免疫微環(huán)境等發(fā)揮其對(duì)惡性腫瘤的殺傷效應(yīng)，后者表現(xiàn)為射線殺傷腫瘤細(xì)胞以后釋放抗原物質(zhì)進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中，激活樹突狀細(xì)胞并加強(qiáng)APC的呈遞，動(dòng)員抗腫瘤免疫細(xì)胞前往腫瘤組織發(fā)揮腫瘤特異性免疫反應(yīng)。然而放療在激活抗腫瘤免疫的同時(shí)，也可產(chǎn)生免疫抑制作用，這種作用可能與放療引起Treg細(xì)胞增加、腫瘤細(xì)胞表面程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）上調(diào)、骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）浸潤、樹突狀細(xì)胞功能受損等有關(guān)。放療對(duì)Treg的影響是多方面的。①放療引起Treg細(xì)胞數(shù)量改變：放療可使所有T細(xì)胞增殖，其中Treg細(xì)胞最為顯著。Anderson等首先發(fā)現(xiàn)，放療可致Treg細(xì)胞增多，且這部分細(xì)胞在放療后仍具有免疫調(diào)節(jié)功能。Muroyama等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)放療后Treg細(xì)胞的Ki-67染色增加了自身增殖，明顯使腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞增多，且CTLA-4、CD137和轉(zhuǎn)錄因子Helios的表達(dá)均高于非放射腫瘤。②放療劑量對(duì)Treg細(xì)胞的影響：一項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，單劑量或分次劑量2 Gy的局部放療可導(dǎo)致脾臟內(nèi)Treg細(xì)胞增加，將劑量增加到20 Gy可使腫瘤浸潤Treg細(xì)胞的比例增加一倍。然而也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加Treg細(xì)胞呈劑量依賴性凋亡，許多因素可能導(dǎo)致這些研究的不同結(jié)果，如輻射劑量的差異、放療后的評(píng)估時(shí)間、局部照射與全身照射的差異以及腫瘤與非腫瘤模型的差異。雖然已經(jīng)有許多研究表明放療可使Treg細(xì)胞數(shù)量增多，但不同劑量對(duì)其數(shù)量變化的影響目前仍有爭議。③放療對(duì)Treg細(xì)胞表型和功能產(chǎn)生影響：Cao等發(fā)現(xiàn)γ射線輻射后Treg細(xì)胞上CD62L、FOXP3、CD45RO、TGF-β表達(dá)降低，GITR及凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2-associated X protein，BAX）表達(dá)增強(qiáng)，這些表型通過劑量依賴型減弱了Treg細(xì)胞對(duì)自身T細(xì)胞的抑制能力并誘導(dǎo)了自身凋亡。Beauford等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)放療以劑量依賴的方式下調(diào)了Treg細(xì)胞上的FOXP3、CD25和CTLA-4表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）的表達(dá)升高，使其抑制CD8T細(xì)胞增殖的能力減弱。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了放療可能通過改變Treg細(xì)胞的表型影響其抑制功能，且這種改變與照射劑量及分割模式有關(guān)。

4 Treg細(xì)胞對(duì)放療療效的影響

Treg細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與傳統(tǒng)放療的相互作用可能從根本上影響腫瘤治療的療效。淋巴細(xì)胞是放射敏感性最高的細(xì)胞，其次是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和APC。即使淋巴細(xì)胞是對(duì)電離輻射特別敏感的細(xì)胞，但單個(gè)淋巴細(xì)胞亞群的輻射敏感性存在很大的差異，Treg細(xì)胞比其他T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞亞群更具抗輻射性，其抗輻射作用部分是由促凋亡蛋白下調(diào)和抗凋亡蛋白上調(diào)介導(dǎo)的，TGF-β存在于腫瘤微環(huán)境中也可能有助于腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的放射抗性。在腫瘤環(huán)境中，Treg細(xì)胞與放療療效呈負(fù)相關(guān)，一方面放療促進(jìn)了Treg的分化與增殖，另一方面Treg通過其抗輻射及抗腫瘤免疫抑制作用，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷，影響放療的療效。

5 放療聯(lián)合Treg相關(guān)免疫治療的研究進(jìn)展

基于上文所述，單純放療所誘發(fā)的免疫增強(qiáng)作用是很弱的，并不足以抗衡放療誘導(dǎo)Treg的免疫抑制作用，總體上放療對(duì)Treg細(xì)胞的分化、增殖起到促進(jìn)作用，誘導(dǎo)了免疫抑制，影響放療的療效。隨著靶向免疫治療日益增多，放療聯(lián)合免疫治療引起越來越多的關(guān)注，Treg細(xì)胞已成為當(dāng)前聯(lián)合治療的重要靶點(diǎn)。

5.1 抗CTLA- 4單抗聯(lián)合放療

CTLA-4是目前研究最多、臨床應(yīng)用最廣泛的一個(gè)靶點(diǎn)，是Treg細(xì)胞表面的抑制性受體。盡管Treg細(xì)胞可通過多種途徑抑制體內(nèi)免疫功能，并且每種途徑可能因環(huán)境和免疫環(huán)境的不同而不同，但是在CTLA-4介導(dǎo)的途徑存在缺陷的情況下，即使其他抑制機(jī)制更加活躍以彌補(bǔ)該缺陷，Treg也難以維持其自身耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。因此，CTLA-4是T細(xì)胞應(yīng)答的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子，并且是在生理和病理免疫反應(yīng)（包括自身免疫、過敏和腫瘤免疫）中控制Treg抑制功能的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。CTLA-4與B7分子結(jié)合可截?cái)郆7/CD28通路，此通路是T細(xì)胞活化的重要一環(huán)，該通路被阻斷可使T細(xì)胞無法被激活，處于免疫應(yīng)答失活狀態(tài)。放療可上調(diào)APC表面的B7-1，由于Treg細(xì)胞表面的CTLA-4與B7-1的親和力更高，導(dǎo)致放療后更多的表現(xiàn)為免疫抑制。因此為了更好地發(fā)揮出抗腫瘤免疫效應(yīng)，可以在放療的同時(shí)進(jìn)行抗CTLA-4治療。目前抗CTLA-4藥主要是指Ipilimumab（IPI），它是最早被批準(zhǔn)用于臨床的針對(duì)Treg的靶向藥，也是治療晚期惡性黑色素瘤的首選藥物。Rudqvist等在乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)抗CTLA-4單藥耐藥的情況下，放療和抗CTLA-4可顯著增加腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞的數(shù)量，且改善小鼠的存活率。目前越來越多的報(bào)道證實(shí)了放療聯(lián)合全身免疫治療的安全性和有效性。Bang等回顧性分析了多種腫瘤在接受放療聯(lián)合免疫治療后，證明了局灶性姑息性放療與CTLA-4和（或）程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）抑制劑聯(lián)合使用具有良好的耐受性。Formenti等報(bào)道了一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)評(píng)估了局部放療和IPI在轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者中的療效，結(jié)果顯示客觀緩解率（objective response rate，ORR）及無進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS）均優(yōu)于歷史上報(bào)道的單獨(dú)使用IPI。Ji等發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)放療相比，抗CTLA-4聯(lián)合放療使腫瘤消退明顯，且顯著改善臨床結(jié)果。

5.2 抗GITR單抗聯(lián)合放療

Treg細(xì)胞上的另一熱門靶點(diǎn)是GITR，其是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體蛋白家族的一員，在調(diào)節(jié)性細(xì)胞上結(jié)構(gòu)性表達(dá)，效應(yīng)T細(xì)胞上誘導(dǎo)表達(dá)的共刺激受體。研究表明，GITR與GITR配體相互作用可為CD4和CD8初始T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，激活效應(yīng)T細(xì)胞，同時(shí)抑制Treg細(xì)胞的抑制活性。近年來，GITR作為一個(gè)有前景的靶點(diǎn)得到了廣泛的研究，激動(dòng)劑GITR單抗通過增加效應(yīng)T細(xì)胞活性、減少Treg細(xì)胞浸潤增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。Patel等的小鼠膠質(zhì)瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗GITR單抗聯(lián)合放療提高了瘤內(nèi)CD4T細(xì)胞/Treg細(xì)胞比例，促進(jìn)了腫瘤消退，并顯著提高生存率。然而，近幾年抗GITR單抗聯(lián)合放療相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，有待進(jìn)一步觀察GITR對(duì)輻射增敏的效果。

5.3 抗CD25聯(lián)合放療

CD25抗原是分子量為55 kD的單鏈糖蛋白，又稱IL-2受體，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞，其配體IL-2是CD8CTL細(xì)胞擴(kuò)增所必需的。Treg細(xì)胞可表達(dá)更高親和力的IL-2受體，在腫瘤微環(huán)境中超過效應(yīng)T細(xì)胞以獲得有限的IL-2，并獲得比效應(yīng)T細(xì)胞更大的增殖優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步促進(jìn)免疫抑制。Oweida等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與單純放療相比，抗CD25治療聯(lián)合放療可增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性記憶反應(yīng)，使57.1%的小鼠腫瘤消失。Ji等進(jìn)一步證明放療聯(lián)合抗CD25單克隆抗體較單純放療在腫瘤中降低Treg，并逆轉(zhuǎn)了放療時(shí)腫瘤CD8T細(xì)胞和CD4T細(xì)胞上PD-1表達(dá)增加，抑制了局部放療及遠(yuǎn)處未放療腫瘤生長，提高總生存率。然而，也有一些類似研究未能獲得臨床明顯的增強(qiáng)作用，可能的原因是由于活化的效應(yīng)T細(xì)胞也表達(dá)CD25，基于CD25的細(xì)胞耗竭也可能減少活化的效應(yīng)T細(xì)胞，從而減弱Treg細(xì)胞耗竭增強(qiáng)的抗腫瘤免疫作用?？紤]到單克隆抗體的給藥時(shí)間和劑量也可能是腫瘤免疫中Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞差異控制的重要因素，因此如何更好地減少Treg細(xì)胞又不消耗特異性效應(yīng)T細(xì)胞是進(jìn)一步需要解決的問題。

5.4 IDO抑制劑聯(lián)合放療

IDO-1是機(jī)體內(nèi)天然存在的免疫調(diào)節(jié)酶，大量的研究發(fā)現(xiàn)許多潛在的免疫抑制機(jī)制，其中主要機(jī)制為微環(huán)境中的色氨酸消耗。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤與色氨酸分解代謝升高之間的關(guān)系，色氨酸通過IDO限制酶代謝為犬尿氨酸，使效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和（或）失能，同時(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞的成熟和激活，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮直接作用。針對(duì)該通路的IDO抑制劑近年來進(jìn)行了火熱的研究，Zhu等發(fā)現(xiàn)放療對(duì)IDO免疫活性的影響具有劑量依賴性，因此在放療時(shí)使用IDO抑制劑可以通過逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞衰竭延緩腫瘤生長。Liu等發(fā)現(xiàn)IDO抑制劑與放療協(xié)同可以下調(diào)Treg細(xì)胞，激活樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞，這種聯(lián)合治療可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫并抑制腫瘤進(jìn)展。

5.5 雙重免疫聯(lián)合放療

雙重免疫和放療的聯(lián)合應(yīng)用通過針對(duì)免疫逃逸的多種機(jī)制增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，比任何單雙療法更能提高生存率。PD-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，1992年首次被發(fā)現(xiàn)，主要在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)，其配體PD-L1表達(dá)于多種類型細(xì)胞如APC、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，正常情況下兩者結(jié)合可使T細(xì)胞持續(xù)活化狀態(tài)中止，防止機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病，病理情況下PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于其他正常細(xì)胞，兩者結(jié)合抑制了抗腫瘤T細(xì)胞活化，促進(jìn)腫瘤生長。已有多項(xiàng)研究表明，放療聯(lián)合抗PD-1/PD-L1治療可以顯著延緩腫瘤生長。Twyman-Saint等通過一項(xiàng)針對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床試驗(yàn)及小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IPI聯(lián)合放療可使腫瘤消退明顯，但耐藥性很常見?？笴TLA-4主要是通過抑制Treg細(xì)胞從而增加Teff/Treg比例，而放療可使腫瘤細(xì)胞表面受體上調(diào)，因此其耐藥性可能是由于PD-L1在黑色素瘤細(xì)胞中上調(diào)，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。該臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了高PD-L1對(duì)放療聯(lián)合抗CTLA-4無反應(yīng)，黑色素瘤細(xì)胞上的PD-L1可以使腫瘤逃避基于抗CTLA-4的治療。這些數(shù)據(jù)顯示了抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1、放療三者聯(lián)合應(yīng)用的必要性，主要是通過激活不同途徑增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)并實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤應(yīng)答。還有更多的三聯(lián)組合正在被研究，Schoenhals等發(fā)現(xiàn)抗GITR、抗PD-1和放療顯著改善小鼠存活率和局部反應(yīng)，其中半數(shù)小鼠無腫瘤，且這些小鼠的CD4和CD8效應(yīng)記憶細(xì)胞增多。另外在一些臨床前實(shí)驗(yàn)中，抗TGF-β、抗PD-1聯(lián)合放療也顯示出良好的抗腫瘤效果。這些數(shù)據(jù)揭示了雙重免疫治療聯(lián)合放療克服腫瘤耐藥的潛力。

6 小結(jié)與展望

本綜述回顧了Treg的起源、作用以及運(yùn)用于臨床治療中的研究進(jìn)展。放療是目前治療腫瘤的重要方法，射線在照射病灶的過程中使機(jī)體的免疫功能受到破壞并影響療效，Treg細(xì)胞參與了其免疫失能過程。目前已有越來越多的證據(jù)表明放療聯(lián)合抗Treg治療可逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的免疫抑制，增強(qiáng)放療療效，因此針對(duì)Treg細(xì)胞的研究已成為當(dāng)前放療聯(lián)合免疫治療的突破點(diǎn)和熱點(diǎn)，尋找更多的Treg抑制劑及如何有效將清除/逆轉(zhuǎn)Treg與放療最優(yōu)化聯(lián)合，是今后關(guān)注的重點(diǎn)。