黔產(chǎn)橢圓葉花錨HPLC指紋圖譜研究

何羽 熊燦瓊

【摘 要】 目的：建立橢圓葉花錨HPLC指紋圖譜，為黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：取黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材甲醇提取物，分析采用Camesil C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）;以25%甲醇溶液-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速：1.0 mL;檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，柱溫：40 ℃。結(jié)果：建立的HPLC指紋圖譜中有14個(gè)共有峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，12批樣品相似度均大于0.90。通過與對(duì)照品保留時(shí)間及UV吸收光譜比較，確定12號(hào)峰為齊墩果酸。結(jié)論：建立的方法簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性好，可系統(tǒng)、全面的評(píng)價(jià)黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】

黔產(chǎn)橢圓葉花錨;HPLC指紋圖譜;質(zhì)量評(píng)價(jià)

【中圖分類號(hào)】R282?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）19-0046-04

Establishment of HPLC Fingerprints of Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province

HE Yu XING Canqiong

Bijie inspection and testing center of administration for maeket supervision， Bijie 551700， China

Abstract：

Objective To establish chromatographic fingerprints by HPLC of Halenia elliptica D.Don，so as to provide scientific basis for the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province. Method Analysis was performed on Camesil C18 column （5 μm，250 nm×4.6 nm） with gradient mobile phase of 25% Methanol solution-acetonitrile，F(xiàn)low phase gradient change.The flow rate was 1mL/min and column temperature was 40℃.The detection wavelength was set 258 nm. Results 14 common peaks were confirmed in HPLC fingerprints from 12 batches Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.Use similarity evaluation system of traditional Chinese medicine（2012 edition）for analysis，The similarity of all 12 samples are greater than 0.90.Comparison with standard substance retention time and UV absorption spectroscopy， confirm that peak 12 is oleanolic acid.Conclusion The method established is simple and easy to repeat， can systematically and comprehensively evaluate the quality of the Halenia elliptica D.Don in Guizhou province.

Key words：

Halenia Elliptica D.Don in Guizhou Province;? HPLC Fingerprints;? Evaluate the Quality

橢圓葉花錨為龍膽科植物橢圓葉花錨Halenia elliptica D.Don的干燥全草。為我省少數(shù)民族用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003 版），貴州習(xí)稱黑耳草[1]、阿小根、龍膽、青魚膽、肝炎藥、黑節(jié)苦草、雞腳蓮、花錨、甲地然果、四棱草、小兒腫消、花臉錨等。據(jù)文獻(xiàn)記載[2-3]，我國(guó)花錨植物共2種1變種，即橢圓葉花錨Halenia elliptica D.Don（包括原變種卵萼花錨H.elliptica var.elliptica及變種大花花錨H.elliptica var.grandiflora）和花錨H.corniculata（Linn）Comaz?；ㄥ^H.corniculata（Linn）Comaz主要分布于內(nèi)蒙東北部、華北地區(qū)[8];橢圓葉花錨Halenia elliptica D. Don主產(chǎn)于西藏、青海、云南、陜西、甘肅、四川、云南、貴州省等。根文獻(xiàn)報(bào)道[4-11]：橢圓葉花錨含有多種化學(xué)成分，主要有酮類、酮苷類、黃酮苷類、裂環(huán)烯醚萜類、三萜類以及甾體類成分。較多文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其中的齊墩果酸進(jìn)行含量測(cè)定[5]，僅測(cè)定單一成分的含量，并不能有效的對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，因此，本文擬建立HPLC指紋圖譜，以便更加全面的評(píng)價(jià)黔產(chǎn)橢圓葉花錨的質(zhì)量。

2 方法與結(jié)果

2.1 材料

2.1.1 儀器與試藥 Waters e2695高效液相色譜儀;AY-120型電子分析天平（日本島津公司）;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）;乙醇、磷酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為純化水;齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院 批號(hào)：110709-201808）。

2.1.2 樣品信息 橢圓葉花錨采自貴州省各地區(qū)，經(jīng)貴州省藥品檢驗(yàn)所中藥學(xué)專家李楊老師鑒定為為龍膽科植物橢圓葉花錨Halenia elliptica D. Don，樣品除去泥沙，曬干，粉碎，過四號(hào)篩，備用。 樣品詳情見表1。

2.2 試驗(yàn)與結(jié)果

2.2.1 色譜條件 Camesil C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）;以25%甲醇為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫;流速：1.0 mL;檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，柱溫：40 ℃。（見表2）

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取齊墩果酸對(duì)照品對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取橢圓葉花錨細(xì)粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，水浴加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，用0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.4 精密度考察 取同一藥材粉末（S1）約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD（%）分別為1.05%與1.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取同一藥材粉末（S1）6份，每份約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD（%）分別為1.59%與1.38%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一藥材粉末（S1）約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，于0、2、4、8、12、24、48 h分別依次進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD（%）分別為1.42%與1.61%，均小于2.0%，達(dá)到規(guī)定要求，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 特征峰的確定 根據(jù)12批黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材的HPLC圖譜的測(cè)定結(jié)果，共分離出23個(gè)色譜峰，將樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，多點(diǎn)校正，時(shí)間窗寬度為0.1，對(duì)照?qǐng)D譜生成為中位數(shù)，生成黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜，共指認(rèn)了14個(gè)共有色譜峰。根據(jù)齊墩果酸對(duì)照品與樣品的HPLC色譜圖及對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間及UV光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，確認(rèn)12號(hào)峰為齊墩果酸峰，且均達(dá)到了基線分離，峰信號(hào)較強(qiáng)。如圖1所示。

2.2.8 相似度計(jì)算及結(jié)果分析 將生成的對(duì)照?qǐng)D譜與12批樣品的HPLC色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)樣分析，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。

12批黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材的相似度均在0.90以上，說明各品種之間相似度較高，樣品質(zhì)量比較穩(wěn)定，所建立的HPLC指紋圖譜具有一定的代表性與實(shí)用性。

2.3 討論與小結(jié)

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用Waters PDA檢測(cè)器在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果在258 nm的波長(zhǎng)處時(shí)，HPLC色譜圖信息量較大，峰形較好，對(duì)照品與相鄰雜質(zhì)峰之間均達(dá)到基線分離，空白溶液無(wú)干擾。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流動(dòng)相體系，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化調(diào)整后梯度洗脫比例，結(jié)果25%甲醇-乙腈做流動(dòng)時(shí)相色譜圖分離效果最佳。

2.3.3 樣品溶液提取方法選擇 樣品分別采用不同濃度的甲醇和乙醇作溶劑水浴回流1～3 h不等，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作溶劑時(shí)，雜質(zhì)峰干擾較小，水浴回流2h，供試品成分提取較完全，色譜峰信息量較大，故選擇用甲醇作溶劑，水浴回流2h進(jìn)行供試品溶液的制備。

2.3.4 相似度評(píng)價(jià) 建立HPLC指紋圖譜，并對(duì)12批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果12批樣品的相似度均在0.90以上，采用龍膽科植物其他屬種的藥材進(jìn)行相互驗(yàn)證，結(jié)果相似度較低，表明該指紋圖譜能系統(tǒng)地闡明黔產(chǎn)橢圓葉花黔錨藥材內(nèi)在的品質(zhì)特征，以期能為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：280.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊(cè)）[M].1995：45.

[3]王國(guó)強(qiáng).全國(guó)中草藥匯編（卷二）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：1031-1032.

[4]楊紅澎，薛會(huì)清.橢圓葉花錨中揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，15（3）：11-14.

[5]楊慧玲，劉建全.不同地區(qū)和生長(zhǎng)物候期藏藥花錨有效成分齊墩果酸的含量變化研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜質(zhì)，2004，39（9）：659.

[6]紀(jì)蘭菊，吉文鶴，陳桂琛，等.藏藥橢圓葉花錨中抗肝炎有效成分的含量測(cè)定[J].武漢植物學(xué)研究，2004，22（5）：473-476.

[7]高光躍，李鳴，馮毓秀，等.11種獐牙菜及近緣植物中有效成分的高效液相色譜法測(cè)定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29（12）：910-914.

[8]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)植物志，六十二卷[M].北京：科學(xué)出版社，1988：291.

[9]紀(jì)蘭菊，丁晨旭，陳桂琛.反高效液相色譜法測(cè)定野生與栽培花錨藥材及其制劑中的花錨苷和去甲氧基花錨苷[J].色譜，2004，22（1）：38-40.

[10]張經(jīng)明，鮑文蓮，高海平，等.花錨治療肝炎的有效成分探討[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，1（12）：11-14.

[11]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)植物志，六十二卷[M].北京：科學(xué)出版社，1988：291.

[12]王振旺，鄔國(guó)棟.龍膽科三種地格達(dá)類蒙藥材的顯微鑒別研究[J].北方藥學(xué)，2013，10（3）：6-7.

[13]道日娜.蒙藥材花錨的生藥鑒定[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2014，8（8）：16.

[14]陽(yáng)勇，鐘國(guó)躍，武小斌，等.常用藏藥“蒂達(dá)（藏茵陳）”各品種的薄層色譜鑒別研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（5）：757-760.

（收稿日期：2021-03-02 編輯：劉斌）