芪斛楂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

安巧 馮敏 肖正會 萬科 柳小蘭 王海波 王道平

【摘 要】 目的：從不同產(chǎn)地和不同批次的原料藥材中篩選出較優(yōu)的原料藥材，并建立芪斛楂顆粒的HPLC指紋圖譜。方法：參考《中國藥典》2015版及相關(guān)文獻(xiàn)對陳皮、甘草、木瓜、等11味處方原藥材進(jìn)行成分檢測和篩選，采用HPLC特征圖譜技術(shù)，建立芪斛楂顆粒的指紋圖譜分析方法，采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）進(jìn)行相似度分析。結(jié)果：通過對芪斛楂顆粒指標(biāo)成分含量測定結(jié)果，篩選出較優(yōu)的藥材來源。芪斛楂顆粒的HPLC指紋圖譜共確定了16個共有峰，指紋圖譜相似度均在0.9以上，并指認(rèn)出2個共有成分（甘草苷，橙皮苷）。結(jié)論：所建立的方法簡便、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好，可為芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】

芪斛楂顆粒;含量測定;高效液相色譜法;指紋圖譜

【中圖分類號】R917?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）19-0040-06

Research on the Improvement of Quality Standard of Qihuzha Granules

AN Qiao1，2 FENG Min4 XIAO Zhenghui3 WAN Ke1，2 LIU Xiaolan1，2 WANG Haibo4 WANG Daoping1，2*

1. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550014，China;

2. The Key laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014，China;

3. Guizhou Medical University， Guiyang 550025，China;

4. Sunflower Pharmaceutical Group（Guizhou）Hongqi Co.，Ltd.， Liupanshui 550000，China

Abstract：

Objective This subject selects the better raw medicinal materials from different origin different batches of raw materials. To establish the HPLC fingerprint of Qihuzha Granules. Methods Reference the “Chinese Pharmacopoeia” in the 2015 edition and the literature methods， the content of active ingredients in citri reticulatae pericarpium， glycyrrhizae radix et rhizoma， chaenomelis fructus， ete， have been measured. The HPLC characteristic spectrum technology was usedto analyze the characteristic spectrum ofQihuzha Granules. The similarity ofthe species wasevaluated by using software“Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM”published by the State Pharmacopoeia Commission （2012A version）. ResultsIt has selected better medicines source through the results of measuring the content of the target composition. There were 16 common peaks in the HPLC chromatographic fingerprint of Qihuzha Granules， and 2 common components（Liquiritin， hesperidin） were identified. The similar degrees of 10 batches of samples were over 0.900. Conclusion This method is simple， repeatable， and stable. It provides basic data for improving the standand of Qihuzha Granules.

Key words：

Qihuzha Granules; Content Determination; HPLC; Fingerprint

芪斛楂顆粒是葵花藥業(yè)集團(tuán)（貴州）宏奇有限公司的獨(dú)家品種，由黃芪、炙甘草、茯苓、石斛、山楂、黨參、陳皮、白術(shù)等11味中藥組成。具有健脾和胃、益氣固表、消食導(dǎo)滯的功效，主要用于改善小兒脾胃氣虛、脾失健運(yùn)癥引起的厭食、偏食、汗多、大便不調(diào)、易感冒等癥狀。臨床研究發(fā)現(xiàn)，芪斛楂顆粒用于輔助治療小兒急性上呼吸道感染[1]、治療兒童營養(yǎng)不良合并反復(fù)呼吸道感染[2]、治療小兒脾虛型腹瀉[3]、治療小兒厭食 [4-5]、嬰兒腹瀉[6]，療效顯著。

芪斛楂顆粒各藥材來源產(chǎn)地較廣，質(zhì)量差異較大。復(fù)方中各處方原藥材需要從源頭進(jìn)行優(yōu)選和控制來保證芪斛楂顆粒優(yōu)質(zhì)有效，因此，在進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究前需對各原料藥品質(zhì)進(jìn)行檢測。目前，芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只對甘草酸銨有含量測定要求，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道其質(zhì)量控制的方法。處方中11味原料藥材所含化學(xué)成分組成復(fù)雜，個別成分的定性定量分析難以充分反映芪斛楂顆粒中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量。指紋圖譜可較充分的反映出藥物所含各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，可提高中藥復(fù)方質(zhì)量控制[7-9]，并為制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[10]。為更有效的控制制劑質(zhì)量，確保其臨床用藥的安全、有效，本實(shí)驗(yàn)首次采用高效液相色譜法（HPLC）建立芪斛楂顆粒的指紋圖譜，應(yīng)用對照品對其主要特征峰進(jìn)行指認(rèn)，對復(fù)方化學(xué)成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀; KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器;ME104E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;EYELA-N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試藥 橙皮苷（批號110721-201316）、甘草苷（批號111610-201607）、甘草酸銨（批號110731-201720）、尿囊素（批號111501-200202）、齊墩果酸（批號110709-201808）、熊果酸（批號110742-201823）、白術(shù)內(nèi)酯I（批號111975-201501）、白術(shù)內(nèi)酯II（批號111976-201501）、白術(shù)內(nèi)酯III（批號111978-201501）、黨參炔苷（批號111732-201607）、黃芪甲苷（批號110781-201717），以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購買自中國食品藥品檢定研究院。茯苓酸（批號PCS-181120）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號PCS-190417）、石斛酚（批號PCS-190616），購自成都植標(biāo)化純。兒茶素（批號161209）由Chengdu Purechem-Standard Co.，Ltd.提供。

黃芪、山藥、炙甘草、茯苓、石斛、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮、白術(shù)，均由葵花藥業(yè)集團(tuán)（貴州）宏奇有限公司提供;芪斛楂顆粒（樣品批號：20190101、20190102、20190311、20190905、20190906、20190907、20190908、20190909、20190910、20190911），均由葵花藥業(yè)集團(tuán)（貴州）宏奇有限公司生產(chǎn);甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），超純水（由純水/超純水-一體機(jī)制備），乙腈（色譜純，默克股份兩合公司），其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 11味處方原藥材有效含量參照文獻(xiàn)[11-17]進(jìn)行

1.2.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18 4.6mm×250 mm，5μm）;乙腈-水（A∶B）梯度洗脫：0～30 min，10%～40% A，30～50 min，40%～90%;50～60 min，90% A;流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 制備對照品 取甘草苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，以色譜甲醇為溶劑，分別制成含甘草苷、橙皮苷約0.1 mg·mL-1溶液。

1.2.4 制備供試品 取芪斛楂顆粒約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，過濾，取續(xù)濾液25 mL，濃縮至干，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻后用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得。

1.2.5 單味藥及陰性供試品溶液的制備 稱取黃芪、葛根、陳皮及缺各單味藥材復(fù)方陰性藥材，按照各味藥的處方配比與處方工藝提取制備，并按照1.2.3項(xiàng)下方法制備。

2 結(jié)果

2.1 11味中藥材有效含量測定及品質(zhì)評價 11味處方原料藥材不同批次經(jīng)過檢測，結(jié)果如下：“陳皮20190603，陳皮20190601”中橙皮苷含量較高;“甘草JP-20180709，炙甘草20190101”中甘草苷、甘草酸含量較高;“茯苓JP-20180705，茯苓JP-20180706”中茯苓酸含量較高;“山藥JP-20190501，山藥JP-20190503”中尿囊素含量較高;“木瓜JP-20180803，木瓜飲片20190101”中齊墩果酸和熊果酸含量較高;“白術(shù)JP-20180801，白術(shù)（偏?。敝邪仔g(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的總量較高;“黨參20190601，黨參飲片20190101”中黨參炔苷的含量較高;“黃芪JP-20180704，黃芪JP-20180707”中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷含量較高;“山楂JP-20180701，山楂JP-20180803”中枸櫞酸含量較高;“麥芽20190502，麥芽20190503”中兒茶素含量較高;“流蘇石斛JP-20180701，流蘇石斛JP-20180702”中石斛酚含量較高。如圖1所示。

由此可見，每味藥材不同批次樣品中有效成分的含量存在顯著差異。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒（批號：20190311），按1.2.4項(xiàng)下方法，平行制備供試品溶液5份，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均低于0.4 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒（批號：20190311），按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、2.5 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、48 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰的相對保留時間RSD均小于0.5 %，相對峰面積RSD均低于5.0 %，供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒（批號：20190311），按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰（S），計(jì)算16個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果表明，16個共有峰，相對保留時間RSD均小于0.6 %，相對峰面積RSD均低于3.0 %。

2.3 芪斛楂顆粒液相指紋圖譜建立及特征峰標(biāo)定

2.3.1 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的建立及評價 取10批芪斛楂顆粒樣品，按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣測定，記錄樣品色譜圖。

將10批芪斛楂顆粒的HPLC圖譜以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）軟件，采用S1號樣品（批號20190311）的指紋圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度為0.50，中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正自動匹配后生成芪斛楂顆粒共有模式對照指紋圖譜;確認(rèn)了16個共有峰。10批芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜如圖2所示。

以共有模式對照指紋圖譜作為參照圖進(jìn)行了相似度計(jì)算，10批芪斛楂顆粒樣品與共有模式對照指紋圖譜的相似度在0.985 ～ 0.999，各批樣品的相似度較好。結(jié)果見表1。

2.3.2 芪斛楂顆粒復(fù)方與藥材指紋圖譜色譜峰相關(guān)性分析 按1.2.4項(xiàng)下方法制備芪斛楂供試品溶液、藥材對照溶液、芪斛楂顆粒陰性對照溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。利用色譜峰保留時間考察相關(guān)性，對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的16個峰歸屬進(jìn)行分析。

16個共有峰歸屬到各藥材，其中14號峰來源于白術(shù);2號、6號、14號峰來源于陳皮;4號、5號、7號、15號、16號峰來源于甘草;11號峰來源于黃芪;12號、13號峰來源于流蘇石斛。

2.3.3 采用對照品法對芪斛楂顆粒指紋圖譜各個色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜共有峰和各味藥材色譜峰的歸屬分析，有針對性的配制了甘草苷、橙皮苷對照品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。通過與對照品對比共指認(rèn)了2個色譜峰，確認(rèn)5號峰為甘草苷（如圖3所示），6號峰為橙皮苷（如圖4所示）。

在共有峰中，6號峰是芪斛楂顆粒中的主要活性成分之一，理化性質(zhì)穩(wěn)定，基線分離度好，故選為參照峰。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 本實(shí)驗(yàn)對提取溶劑進(jìn)行篩選，分別用70 %乙醇、95 %乙醇、70 %甲醇、甲醇提取樣品，結(jié)果采用70 %甲醇、甲醇提取所得的色譜峰均較好，為簡便實(shí)驗(yàn)操作及方便溶劑回收利用，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)對提取方法進(jìn)行考察，分別采用超聲提取和回流提取樣品，結(jié)果表明，超聲提取和回流提取的結(jié)果無顯著差異，為實(shí)驗(yàn)操作簡便，選擇超聲提取;本實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行超聲30 min、超聲60 min提取，結(jié)果表明，使用甲醇超聲30 min和甲醇超聲60 min所得色譜峰一致，為了節(jié)約時間，選擇甲醇超聲30 min作為提取條件。

3.3 流動相的選擇 由于本樣品中成分復(fù)雜，故采用梯度洗脫的方式，先后嘗試甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)，并且嘗試了多種不確定的梯度條件，經(jīng)過對各種色譜圖的比較，最后確定乙腈-水為流動相，采用梯度洗脫，分離度理想，特征峰明顯。

3.4 檢測波長的選擇 取供試品溶液進(jìn)樣，采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較，芪斛楂顆粒大部分成分在230 nm有較大吸收，因此選擇230 nm作為指紋圖譜檢測波長。

3.5 共有峰的歸屬 比較復(fù)方與處方原料藥材的色譜圖發(fā)現(xiàn)，處方藥材對共有峰的貢獻(xiàn)為白術(shù)（14號峰）、陳皮（2號、6號、14號峰）、甘草（4號、5號、7號、15號、16號峰）、黃芪（11號峰）、流蘇石斛（12號、13號峰）。所歸屬的色譜峰都能與藥材和復(fù)方對應(yīng)，有良好的相關(guān)性。14號峰的貢獻(xiàn)來源于白術(shù)和陳皮。雖然有與茯苓對照藥材相對應(yīng)的色譜峰（16號峰），但在茯苓陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明16號峰不是茯苓專屬，僅與茯苓有關(guān);雖然有與山楂對照藥材相對應(yīng)的色譜峰（1號、2號峰），但在山楂陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說明這兩個色譜峰不是山楂專屬，僅與山楂有關(guān);未見與黨參、麥芽、木瓜、山藥有關(guān)的色譜峰，可能由于復(fù)方在煎煮過程中，成分之間相互發(fā)生作用導(dǎo)致成分轉(zhuǎn)化或損失;其中3號、8號、9號、10號峰不能得到歸屬，可能是在制劑制備過程中11味藥材共煎而產(chǎn)生的。綜上所述，復(fù)方與處方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡單的加和關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)對復(fù)方成分的來源歸屬作了初步研究，為闡明芪斛楂顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

本研究通過精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)對芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，建立了芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定16個共有峰，指認(rèn)了其中2個色譜峰。采用所建立的方法對10批芪斛楂顆粒樣品進(jìn)行了指紋圖譜測定，采用相似度分析方法對樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，本研究建立的芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為葵花藥業(yè)芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

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（收稿日期：2021-02-23 編輯：劉斌）