赤霞珠葡萄梗原花青素的表征及其抗氧化活性研究

李彩霞，焦 揚(yáng)，崔 瑋*，張 勇，高海寧

（1.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000）

原花青素廣泛存在于各種植物核、皮或種籽中，是由單體黃烷-3-醇類物質(zhì)以不同聚合度連接而成的多酚類化合物[1]。研究證明，原花青素具有抗氧化、清除自由基[1-2]、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗炎癥，抑制阿爾茲海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化，護(hù)肝解毒、抗菌、美白皮膚、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[2-6]，主要應(yīng)用于食品、化妝品和藥品等領(lǐng)域。

葡萄梗是葡萄深加工中的主要廢棄物，資源豐富，并含有大量的原花青素、單寧等多酚類物質(zhì)[7-8]。目前對(duì)葡萄梗的研究和開(kāi)發(fā)主要集中于單寧、多酚的提取和測(cè)定[9]。而葡萄梗作為葡萄加工工序中的第一道廢棄物，其研究?jī)r(jià)值尚未引起人們的重視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，生產(chǎn)100 L紅葡萄酒可產(chǎn)生25 kg的果渣，其中葡萄梗占4 kg[10]，葡萄采摘時(shí)也有大量的葡萄梗因被丟棄而造成資源的大量浪費(fèi)。葡萄梗資源豐富，若能采用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)原花青素等成分進(jìn)行提取和純化，并研發(fā)成抗氧化劑，既能充分利用該資源，又能減少環(huán)境污染。

本研究采用超聲輔助雙水相從赤霞珠葡萄梗中提取原花青素，提取液濃縮后經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化，通過(guò)紅外和紫外光譜對(duì)原花青素提取物進(jìn)行表征，并檢測(cè)葡萄梗原花青素對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基、羥基自由基（·OH）和H2O2的清除作用，以及總抗氧化力和酪氨酸酶的抑制活性，旨在為葡萄梗資源在保健品和化妝品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄梗：由甘肅省濱河食品有限公司提供（原料來(lái)源于張掖板橋莊園），將樣品去除雜質(zhì)，清洗陰干，粉碎過(guò)60目篩。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、過(guò)硫酸銨、香草醛等（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：天津市光復(fù)科技有限公司；兒茶素、原花青素（純度≥98%）：上海金穗生物科技有限公司；總抗氧化力試劑盒：南京建成生物工程研究所；AB-8大孔樹(shù)脂：南開(kāi)大學(xué)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DR6000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)哈希公司；MiLLROCK型冷凍干燥機(jī)：美國(guó)米爾洛克公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BT600F恒流泵：雷弗流體科技有限公司；Nicolet iS50型紅外光譜儀：美國(guó)Thermo Scientific公司；Φ3.5×40 cm層析柱：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄梗原花青素粗提物的制備及純化

葡萄梗原花青素粗提物的制備及純化[11]：配制乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙水相，按料液比1∶40（g∶mL）加入過(guò)60目篩的葡萄梗粉末，在35 ℃超聲條件下（40 kHz、250 W）提取50 min后分兩相，將上相減壓濃縮至漿狀物，凍干。將凍干后的固體研磨成粉末，密封保存。

葡萄梗原花青素粗提物的純化：采用濕法裝柱[12]，將處理好的AB-8樹(shù)脂裝入Φ3.5 cm×40 cm的層析柱，柱床體積為86.55cm3，按10倍的柱床體積上樣（粗提物質(zhì)量濃度6mg/mL，pH=6），以0.5 mL/min流速上樣至動(dòng)態(tài)吸附飽和后，用4倍的蒸餾水洗柱，至流出液澄清，然后用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為解吸劑，以0.5 mL/min流速解吸至解吸液為無(wú)色，將體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫液減壓濃縮至原體積的1/10，冷凍干燥，得原花青素褐色粉末，保存?zhèn)溆?。并測(cè)定純化前后樣品中原花青素的質(zhì)量，按下式計(jì)算純化倍數(shù)：

1.3.2 原花青素含量的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]并稍作修改。準(zhǔn)確稱取兒茶素20 mg，用無(wú)水甲醇溶解并定容100 mL，配制成0.2 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，無(wú)水甲醇補(bǔ)充至0.5 mL，依次加入4%香草醛溶液3.0 mL，1.50 mL濃鹽酸，各管避光反應(yīng)15 min，以試劑空白為對(duì)照，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，兒茶素含量（x）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=4.985x+0.021 5，R2=0.999 3。

提取物中原花青素的測(cè)定：稱取葡萄梗粗提物和純化品各50 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并定容至50 mL。吸取0.5 mL（純化樣品吸取0.1 mL），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測(cè)定的吸光度值，按以下公式計(jì)算原花青素的含量：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的原花青素含量，mg；Vt為原花青素提取液總體積，mL；N為樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g；Vs為測(cè)定時(shí)所取溶液的體積，mL。

1.3.3 樣品純化前后原花青素紫外光譜和紅外光譜表征

將1.3.1節(jié)制備的樣液分別稀釋15倍，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)峰型的高低進(jìn)一步確定純化的效果。

紅外光譜表征：傅立葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）用于確定生物表面活性劑提取物中存在的官能團(tuán)和化學(xué)鍵，然后確定其化學(xué)性質(zhì)。將1.3.1制備的樣品使用Nicolet iS50型FT-IR光譜儀ATR附件實(shí)現(xiàn)FT-IR分析，在波數(shù)4 000～650 cm-1范圍內(nèi)掃描純化前后葡萄梗原花青素的紅外光譜圖。

1.3.4 原花青素提取物的抗氧化活性檢測(cè)

原花青素提取物對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除活性：根據(jù)文獻(xiàn)[15]稍有改動(dòng)。分別吸取1 mL不同質(zhì)量濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）的樣品和陽(yáng)性對(duì)照（20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的原花青素溶液），加入1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇和2 mL的DPPH溶液（0.15 mmol/L）為測(cè)定組，2 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇和2 mL的DPPH溶液為對(duì)照組，混合均勻，避光30 min后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，按下式計(jì)算DPPH·的清除率：

式中：A0為未加原花青素溶液對(duì)照組吸光度值；Ai為加原花青素溶液吸光度值。

葡萄梗原花青素對(duì)ABTS自由基（ABTS+·）的清除活性：ABTS自由基的清除作用根據(jù)文獻(xiàn)[16]稍有改動(dòng)。分別吸取測(cè)定DPPH自由基的清除活性時(shí)配制的溶液各0.1 mL，加入2.3 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和0.6 mL ABTS溶液為測(cè)定組，2.4 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和0.6 mL ABTS溶液為對(duì)照組，搖勻，避光反應(yīng)6 min后，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度值，按下式計(jì)算ABTS+·的清除率：

式中：A0為未加原花青素溶液對(duì)照組吸光度值；Ai為加原花青素溶液吸光度值。

原花青素提取物對(duì)H2O2的清除活性：原花青素溶液對(duì)H2O2清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]稍作修改。配制40 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，吸取600 μL過(guò)氧化氫溶液和100 μL不同質(zhì)量濃度的試樣（20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL），然后用蒸餾水補(bǔ)至3 mL并搖勻，在室溫條件下反應(yīng)30 min為樣品管，以等體積的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇代替樣品為對(duì)照管，空白調(diào)零管為2.9 mL蒸餾水和100 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液。以相應(yīng)濃度的原花青素為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后以空白管調(diào)零分別在波長(zhǎng)230 nm處測(cè)定各反應(yīng)管溶液的吸光度值，吸光度值越低，樣品對(duì)H2O2的清除活性就越高。按以下公式計(jì)算H2O2的清除率：

式中：A0為空白組吸光度值，A1為含樣品溶液吸光度值。

葡萄梗原花青素對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]，F(xiàn)eSO4與H2O2反應(yīng)生成·OH。水楊酸可以捕獲自由基，510 nm處的吸光度值的降低可用于評(píng)從原花青素清除·OH能力。精確取1 mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的樣品溶液，加入1 mL 10mmol/L的FeSO4、1mL10mmol/L的H2O2，混勻，靜置10 min 再加入1 mL 10 mmol/L水楊酸混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)量反應(yīng)溶液的吸光度值A(chǔ)1，以1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇代替樣品溶液對(duì)照管測(cè)量吸光度值A(chǔ)0。按下式計(jì)算·OH的清除率：

式中：A0、A1分別為空白溶液和樣品溶液的吸光度值。

總抗氧化能力的測(cè)定：嚴(yán)格按照總抗氧化能力試劑盒操作，總抗氧化能力的定義：在37 ℃時(shí)，每分鐘每毫升不同質(zhì)量濃度的提取液和陽(yáng)性對(duì)照溶液，使反應(yīng)體系的吸光度（OD）值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位（U）?？偪寡趸σ韵率接?jì)算：

葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶抑制活性的測(cè)定：蘑菇酪氨酸粗酶提取液的制備參照文獻(xiàn)[19]，稱取新鮮的雙孢蘑菇50 g切成小塊置于研缽中加入0.2 moL/L內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=6.8）50mL，迅速置于冰浴中進(jìn)行研磨，研磨成漿后再加入PBS溶液100mL，在冰浴中提取1h，在4℃、10000r/min離心20 min，取其上清液即為得到蘑菇酪氨酸粗酶提取液。

酪氨酸酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]。在試管中依次加入2.9 mL PBS溶液，2 mmol/L的L-左旋多巴（L-levodopa，L-DOPA）（pH=6.8的PBS配制）0.8 mL，再加入0.3 mL酪氨酸酶溶液為實(shí)驗(yàn)組，用0.3 mL緩沖液代替酶液為空白對(duì)照調(diào)零，在475 nm處，并每隔30 s測(cè)定1次吸光度值，測(cè)定6 min，并制作酶活性隨時(shí)間的動(dòng)力學(xué)曲線。酪氨酸酶活性的定義：在測(cè)定條件下以每分鐘多巴醌在波長(zhǎng)475 nm的吸光度值增加0.001為一個(gè)酶活單位（U）。

葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用：在0.2 mol/L的PBS（pH=6.8）中，按表1順序加入緩沖液、提取液、酪氨酸酶液，最后各管加入質(zhì)量濃度為2 mmol/L的L-多巴溶液，在波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定4 min內(nèi)的吸光度變化值，按下式計(jì)算酪氨酸酶的抑制率：

表1 反應(yīng)液組成與體積Table 1 Composition and volume of reaction solution

式中：A1為不加提取液空白管的吸光度值；A2為不加提取液和酶液的空白對(duì)照管的吸光度值；A3為加提取液和酶液的吸光度值；A4為不加酶液對(duì)照管的吸光度值。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)，用Origin 8.5軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠果梗原花青素純化前后比較

2.1.1 赤霞珠果梗純化樣品中原花青素的純度

經(jīng)計(jì)算純化后樣品中原花青素的含量為487.80 mg/g，與純化前原花青素的含量（81.11mg/g）比較增加了406.69mg/g，其純化倍數(shù)為6.01，由此說(shuō)明AB-8樹(shù)脂對(duì)赤霞珠果梗原花青素的純化是非常有效的。

2.1.2 原花青素的紫外光譜

由圖1可以看出，純化前后葡萄梗原花青素的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液在波長(zhǎng)279 nm處均具有特征峰，在300～325 nm內(nèi)無(wú)吸收，250～260 nm具波谷（257 nm）。這可能是原花青素結(jié)構(gòu)單元含A和B兩個(gè)共軛苯環(huán)，其上有多個(gè)羥基取代，使苯環(huán)的B帶（波長(zhǎng)255 nm處）顯著紅移，光譜圖與微波法提取的葡萄籽原花青素的全波長(zhǎng)掃描光譜一致[21]，在280 nm處出現(xiàn)的兒茶素的特征吸收峰，說(shuō)明葡萄梗原花青素主要是由兒茶素和表兒茶素組成的原花青素類[22-23]，且純化物特征峰明顯高于未純化的提取物，由此說(shuō)明，AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)葡萄梗中原花青素的純化效果非常顯著。

圖1 純化前后樣品的紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectra of samples before and after purification

2.1.3 純化前后樣品的紅外光譜

由圖2可知，純化前后樣品的紅外光譜差異明顯，純化后樣品在3 208 cm-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動(dòng)帶，波長(zhǎng)1 600 cm-1，1 523 cm-1，1 432 cm-1是苯環(huán)骨架的特征吸收峰，波長(zhǎng)1 279 cm-1，1 120 cm-1，1 036 cm-1是C-O-C的伸縮振動(dòng)帶，在1 520～1 540 cm-1處有一個(gè)單峰（1 523 cm-1），在低頻指紋區(qū)780 cm-1～730 cm-1范圍內(nèi)只有一個(gè)峰（764 cm-1），根據(jù)B環(huán)上羥基的數(shù)量的不同，將多聚原花青素分為以原翠雀定（B環(huán)含3個(gè)羥基）為主的結(jié)構(gòu)單元，或者B環(huán)含有2個(gè)羥基的原花青定為主的結(jié)構(gòu)單元，原翠雀定的紅外特征吸收峰在振動(dòng)頻率區(qū)（1 540～1 520 cm-1）處有2個(gè)吸收峰，且在730 cm-1左右有強(qiáng)吸收峰[23-24]。該圖譜顯示，在振動(dòng)頻率區(qū)（1 540～1 520 cm-1）處只有1 523 cm-1一個(gè)吸收峰，在低頻指紋區(qū)（780～730 cm-1）范圍內(nèi)只有764 cm-1一個(gè)峰，在730 cm-1附近無(wú)吸收譜帶，由此推測(cè)，赤霞珠葡萄梗純化物是以原花青定為主要結(jié)構(gòu)單元的原花青素。

圖2 純化前（a）后（b）樣品的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of samples before (a) and after (b) purification

2.2 抗氧化活性的檢測(cè)

2.2.1 葡萄梗原花青素對(duì)DPPH·的清除活性

自由基與機(jī)體的衰老有密切關(guān)系，DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，自由基清除劑可與DPPH反應(yīng)，使其醇溶液紫色減弱，在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值降低，該方法可用于檢測(cè)待測(cè)物的抗氧化性[25]。由圖3可知，葡萄梗原花青素與對(duì)照原花青素對(duì)DPPH·均有一定的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH·的清除率也隨著增大，在葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度40 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為77.02%，而對(duì)照質(zhì)量濃度為40 μg/mL，其清除率為62.05%，說(shuō)明葡萄梗原花青素對(duì)DPPH·的清除活性高于對(duì)照。

圖3 葡萄梗原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on DPPH free radical

2.2.2 葡萄梗原花青素對(duì)ABTS+·的清除活性

ABTS+·清除法是通過(guò)比色法來(lái)測(cè)定樣品的抗氧化活性，ABTS 試劑在氧化劑作用下會(huì)形成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+·的產(chǎn)生會(huì)被抑制，在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度降低。此法具有操作快速、簡(jiǎn)單、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是目前評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性常用的方法[26]。由圖4可知，隨著葡萄梗原花青素與對(duì)照原花青素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS+·的清除作用均在增大，在葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS+·的清除率為98.15%，而對(duì)照濃度為40 μg/mL，其清除率為97.82%，該數(shù)據(jù)表明葡萄梗原花青素對(duì)ABTS+·的清除作用高于對(duì)照。

圖4 葡萄梗原花青素對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on ABTS free radical

2.2.3 葡萄梗原花青素對(duì)H2O2的清除活性

H2O2可導(dǎo)致人機(jī)體遺傳物質(zhì)的損傷，基因突變，加速人體的衰老進(jìn)程。由圖5可以看出，葡萄梗原花青素與原花青素對(duì)照對(duì)H2O2的抑制率隨著濃度的增加而逐漸增大，在質(zhì)量濃度達(dá)40 μg/mL時(shí)，抑制效果分別達(dá)到10.78%和8.89%。由此數(shù)據(jù)可知，在低濃度時(shí)葡萄梗提取物原花青素對(duì)H2O2自由基的清除作用稍高于對(duì)照，而在高濃度時(shí)，低于對(duì)照。

圖5 葡萄梗原花青素對(duì)H2O2的清除作用Fig.5 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on H2O2

2.2.4 葡萄梗原花青素對(duì)·OH的清除能力

·OH對(duì)人體的攻擊首先是從細(xì)胞膜開(kāi)始的，一旦細(xì)胞膜破壞就會(huì)導(dǎo)致心血系統(tǒng)疾病，更嚴(yán)重的話會(huì)導(dǎo)致基因突變，從而引起發(fā)生系統(tǒng)性的混亂。由圖6可以看出，葡萄梗原花青素和對(duì)照品對(duì)·OH的抑制率隨著原花青素的濃度的增加而逐漸增大，在質(zhì)量濃度達(dá)40 μg/mL時(shí)，其抑制分別為57.63%和50.8%。說(shuō)明，葡萄梗原花青素對(duì)·OH有抑制作用，其抑制作用高于對(duì)照。

圖6 葡萄梗原花青素對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of proanthocyanidins from grape stalks on hydroxyl radical

2.2.5 葡萄梗原花青素的總抗氧化能力

由圖7可知，葡萄梗原花青素和對(duì)照原花青素的總抗氧化力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，并呈正相關(guān)，相關(guān)性分別為y梗=0.690 7x+19.471，R2=0.964 6；y對(duì)=0.405 6x+0.045 7，R2=0.986 7。在葡萄梗原花青素和對(duì)照的質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)，總抗氧化力分別為49.31 U/mL、15.98 U/mL。總體而言，對(duì)照原花青素的總抗氧化力不及葡萄梗原花青素。

圖7 葡萄梗原花青素的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of proanthocyanidins from grape stalks

2.2.6 葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

由圖8可知，在4～5 min時(shí)，其酶活力最高，在0～4 min范圍內(nèi)，酪氨酸酶活性與時(shí)間呈相關(guān)性，y=1.489 9x+197.94，相關(guān)系數(shù)R2=0.980 6，因此，在研究提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用時(shí)測(cè)定4 min內(nèi)的吸光度變化值。

圖8 酪氨酸酶促動(dòng)力曲線Fig.8 Kinetic curve of tyrosinase activity

酪氨酸酶是人體中黑色素生成代謝與兒茶酚胺密切相關(guān)的關(guān)鍵限速酶，酪氨酸酶活性物質(zhì)已在治療色素障礙類疾病、防腐保鮮、美白和烏發(fā)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[27]。由圖9可知，隨著葡萄梗原花青素和對(duì)照原花青素質(zhì)量濃度的增加對(duì)酪氨酸酶抑制活性也在增加，且呈正相關(guān)，y梗=1.2145x-4.7965，R2=0.9801；y對(duì)照=0.743 2x-8.076 6，R2=0.981 3。在葡萄梗原花青素40 μg/mL時(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制率為43.78%，而對(duì)照質(zhì)量濃度為40μg/mL時(shí)，其抑制率為24.37%。以上結(jié)果表明，葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)于對(duì)照，因此，具有良好的美白活性。

圖9 葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of proanthocyanidins from grape stalks on tyrosinase

2.3 酪氨酸酶抑制率與抗氧化之間的相關(guān)性分析

原花青素對(duì)酪氨酸酶的抑制率與DPPH·、ABTS+·、·OH清除率、H2O2還原力及總抗氧化力之間的相關(guān)性見(jiàn)圖10。由圖10可知，隨著酪氨酸酶抑制活性的增加，·OH、DPPH·、ABTS+·、H2O2清除率及總抗氧化力也隨著增加，且呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R2分別為0.860 4、0.870、0.951 2、0.951 9（P＜0.05）和0.986 2，因此推斷葡萄梗原花青素對(duì)酪氨酸酶抑制能力與其抗氧化有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性?？赡苁峭ㄟ^(guò)清除自由基，終止自由基鏈的引發(fā)，削弱酪氨酸酶反應(yīng)過(guò)程中的供氧而抑制酪氨酸酶催化活性[25]，也可能是原花青素與L-多巴競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合部位，或者原花青素能與酪氨酸酶中的金屬離子鰲合，從而抑制酶的活性[26]，其機(jī)理需尚待進(jìn)一步研究。

圖10 酪氨酸酶抑制率與抗氧化活性的相關(guān)性Fig.10 Correlation between tyrosinase inhibition rate and antioxidant activity

3 結(jié)論

通過(guò)超聲輔助雙水相提取赤霞珠葡萄梗中原花青素、并采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物中原花青素含量為487.80 mg/g，是純化前（81.11 mg/g）的6.01倍。對(duì)純化物進(jìn)行紫外和紅外掃描，均具有原花青素的特征峰，表明AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化葡萄梗原花青素是有效的。

抗氧化表明，葡萄梗原花青素質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH和H2O2的清除率分別為77.02%、98.15%、57.63%和10.78，對(duì)酪氨酸酶抑制率和總抗氧化力分別為43.78%和49.31 U/mL，均高于對(duì)照。說(shuō)明葡萄梗原花青素具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。