離心分層取材法在血性胸水富集瘤細(xì)胞中的應(yīng)用

曾賽凡， 王雪丹， 陳余朋， 張 聲， 王行富

胸膜原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤、各種炎癥性病變或肺內(nèi)病變累及到胸膜時(shí)，影響臟/壁層胸膜間皮細(xì)胞的液體和蛋白的重吸收及間皮下淋巴管內(nèi)液體循環(huán)，均會導(dǎo)致胸膜腔內(nèi)液體積聚而形成胸水[1]。惡性胸水呈肉眼血性，含有不同數(shù)量的紅細(xì)胞，掩蓋腫瘤細(xì)胞，對樣本的形態(tài)學(xué)診斷及后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色和分子檢測等輔助診斷均造成困難。本研究擬探討離心分層取材法在血性胸水富集瘤細(xì)胞中的應(yīng)用，以提高腫瘤細(xì)胞的檢出率。

1 臨床資料

1.1 材料 收集2019年10月—2020年6月筆者醫(yī)院診斷為肺腺癌的患者50例，男性33例，女性17例，年齡(45.50±6.50)歲(43～65歲)。所有患者的影像學(xué)顯示胸膜腔播散產(chǎn)生胸水，超聲定位下抽取胸水，留取未經(jīng)固定的新鮮血性胸水樣本。

1.2 方法 收到的樣本立即去除肉眼可見的蛋白、血凝塊等。分兩組進(jìn)行細(xì)胞塊制備：

1.2.1 直接離心沉淀法(A組) 搖勻樣本取兩管各50 mL，2 500 r/min離心5 min，直接取管底沉淀物。

1.2.2 離心分層取材法(B組) 搖勻樣本取兩管各50 mL，2 500 r/min離心5 min，肉眼觀察上清液與沉淀物的分層情況，有分層的再次觀察沉淀物大小及移動情況。沉淀物<2 mL，取全部管底沉淀物；沉淀物>2 mL且固定在管底不移動，取沉血表面物；會移動的可行沉淀物與破紅液(10%中性緩沖福爾馬林與50%乙醇等量混合液[2])1∶1混勻破紅處理；無法分層的取10 mL樣本與破紅液按1∶4混勻破紅，均取破紅析出物。

兩組材料獲得的管底沉淀物、沉血表面物、破紅析出物等沉淀物均加入10%中性緩沖甲醛50 mL懸浮固定5 min，1 500 r/min離心5 min后去上清液，加75%乙醇50 mL混勻立即離心，1 500 r/min離心5 min后去上清液，95%乙醇緩慢的沿試管壁加入，室溫靜置2 h，細(xì)胞凝集成塊取出，用綿紙包裹，脫水包埋制成細(xì)胞蠟塊，切片厚度4 μm，行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin stain，H-E)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemical stain，ICC)。ICC檢測指標(biāo)：甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1，1∶200，8G7G3/1，鼠單抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞核)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA，1∶200，MX015，鼠單抗，福州邁新生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞質(zhì))。采用ULtraVIEW兩步法檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，全自動免疫組織化學(xué)染色儀(Roche BenchmarkXT，瑞士羅氏公司)中完成免疫組織化學(xué)染色。

1.3 評判標(biāo)準(zhǔn) 由兩位副主任醫(yī)師閱片。兩組切片的染色結(jié)果以紅細(xì)胞背景、細(xì)胞集中、形態(tài)完整、抗原良好 4個方面給予評價(jià)，結(jié)果以χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 結(jié)果 A組管底沉淀物細(xì)胞蠟塊H-E切片染色可見大量紅細(xì)胞聚集，有核細(xì)胞分散，數(shù)量少；免疫細(xì)胞化學(xué)染色TTF-1、NapsinA中腫瘤細(xì)胞表達(dá)量極少(圖1)。B組中管底沉淀物(B1)細(xì)胞蠟塊H-E切片染色可見：少量的紅細(xì)胞散落在腫瘤細(xì)胞旁邊，腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整，核漿分明；沉血表面物(B2)可見：紅細(xì)胞量較多，但未影響腫瘤細(xì)胞的顯現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞成腺管樣排列；破紅析出物(B3)可見：紅細(xì)胞未見或極少量，腫瘤細(xì)胞集中，形態(tài)完整；B組免疫細(xì)胞化學(xué)染色TTF-1、NapsinA中表達(dá)清晰、定位準(zhǔn)確、背景干凈(圖1)。兩組的紅細(xì)胞背景、細(xì)胞集中、形態(tài)完整、抗原良好 4個方面檢出例數(shù)及所占總數(shù)的比例比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組取材法結(jié)果比較

A組管底沉淀物：Aa：H-E染色紅細(xì)胞聚集，有核細(xì)胞分散，數(shù)量少；Ab-Ac：NapsinA及TTF-1中腫瘤細(xì)胞表達(dá)量極少。B組管底沉淀物(B1)：B1a：H-E染色，紅細(xì)胞散落在腫瘤細(xì)胞旁邊，腫瘤細(xì)胞形態(tài)完整，核漿分明；B1b：NapsinA細(xì)胞質(zhì)棕黃色表達(dá)；B1c：TTF-1細(xì)胞核棕黃色表達(dá)；B組沉血表面物(B2)：B2a：H-E染色，紅細(xì)胞量較多，但未影響腫瘤細(xì)胞的顯現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞成腺管樣排列；B2b：NapsinA細(xì)胞質(zhì)棕黃色表達(dá)；B2c：TTF-1細(xì)胞核棕黃色表達(dá)；B組破紅析出物(B3)：B3a：H-E染色，紅細(xì)胞未見或極少量，腫瘤細(xì)胞集中，形態(tài)完整；B3b：NapsinA細(xì)胞質(zhì)棕褐色表達(dá)；B3c：TTF-1細(xì)胞核棕褐色表達(dá)。

2 討 論

肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸膜所產(chǎn)生的血性胸水肉眼可呈現(xiàn)深淺不一的紅色，其中的紅細(xì)胞常和有核細(xì)胞及蛋白黏液等成分混合，干擾了有核細(xì)胞的分離。解建軍等[3]用3%乙酸乙醇處理血性積液，乙酸對有核細(xì)胞的膨脹和乙醇對有核細(xì)胞的收縮可以相互抵消，對于離心分層后沉淀物會移動的血性胸水中呈現(xiàn)紅細(xì)胞溶解，背景干凈，但在無法分層的血性胸水中乙酸溶解紅細(xì)胞的碎片會加深染色的背景。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙酸單獨(dú)或混合液作為破紅處理劑的病例，TTF-1抗體細(xì)胞核標(biāo)記無或極少表達(dá)，可能是乙酸快速的沉淀核蛋白導(dǎo)致TTF-1蛋白丟失。朱啟淦等[4]用新柏氏細(xì)胞清洗液溶解紅細(xì)胞，此類清洗液主要是含醇類的成分，對于離心分層后沉淀物會移動的血性胸水去除紅細(xì)胞，富集有核細(xì)胞的效果良好；但醇類會沉淀無法分層的血性胸水中肉眼看不見的蛋白等，使得腫瘤細(xì)胞分散，細(xì)胞輕度收縮。筆者采用50%乙醇液+10%中性緩沖甲醛混合液處理[2]，主要是應(yīng)用50%乙醇裂解紅細(xì)胞和10%中性緩沖甲醛固定有核細(xì)胞同步作用于無法分層的樣本，呈現(xiàn)紅色的上清液和灰白色的沉淀物分離?；野咨某恋砦镏袣埩羯倭康募t細(xì)胞，通過10%中性緩沖甲醛再次固定有核細(xì)胞和梯度乙醇凝集的重復(fù)清洗，獲得破紅析出物。B組較A組細(xì)化了血性胸水樣本離心后，針對沉淀物的分層、大小、狀態(tài)等差異情況采用相對應(yīng)的取材方式，鏡下觀察該組的細(xì)胞塊切片，H-E染色有核細(xì)胞形態(tài)完整，尤其是腫瘤細(xì)胞集中，抗原表達(dá)良好。

任何體液樣本富集細(xì)胞都需要離心這一步驟。離心技術(shù)原理是紅細(xì)胞比重較有核細(xì)胞大，所以紅細(xì)胞沉積于最底層，有核細(xì)胞分布于紅細(xì)胞層和上清液之間。離心的目的是為了體液樣本中的液體和細(xì)胞脫落物等成分形成沉淀和上清液，又不破壞細(xì)胞的形態(tài)。所以，合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間非常重要，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索。對于血性樣本，本研究首次離心采用 2 500 r/min離心 5 min；取材后制作細(xì)胞蠟塊前離心采用1 500 r/min離心5 min，較高轉(zhuǎn)速時(shí)紅細(xì)胞分層，較低轉(zhuǎn)速時(shí)有核細(xì)胞聚集。紅細(xì)胞量較少的樣本離心后有核細(xì)胞和紅細(xì)胞均沉積于管底形成淡紅色的管底沉淀物，此類樣本中少量的紅細(xì)胞不影響有核細(xì)胞的呈現(xiàn)；離心后沉淀物>2 mL且為深紅色的沉血時(shí)取沉血表面物，吸取時(shí)應(yīng)動作緩慢，避免多量的紅細(xì)胞與有核細(xì)胞同時(shí)被收集；多量的紅細(xì)胞游離于內(nèi)容物比較少的體液中，使得離心后沉淀物移動；大量的紅細(xì)胞和體液中的內(nèi)容物混合，使得樣本離心后無法分層，這兩種均需破紅處理方可出現(xiàn)分層，獲得有效細(xì)胞。

細(xì)胞蠟塊富集瘤細(xì)胞，可以提供優(yōu)良的細(xì)胞保存和免疫細(xì)胞化學(xué)染色及分子檢測的細(xì)胞學(xué)材料[5]，所以，目前細(xì)胞蠟塊在細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域廣泛使用。TTF-1和NapsinA對于肺腺癌的診斷具有較好的特異性和敏感性[6]。本研究使用這兩個指標(biāo)進(jìn)行抗原驗(yàn)證，在細(xì)胞蠟塊腫瘤細(xì)胞檢出的基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示抗原表達(dá)均良好。但樣本送檢時(shí)應(yīng)新鮮，未經(jīng)固定且去除肉眼可見的蛋白、血凝塊等，因?yàn)楣潭ê笥泻思?xì)胞與肉眼可見物包裹，離心時(shí)沉積于管底最底層，影響離心分層取材位置的判斷。樣本處理的及時(shí)性可減少細(xì)胞在體外的退變，多次的送檢可增加細(xì)胞收集量且宜于進(jìn)行形態(tài)學(xué)比對。血性胸水的離心分層取材法最大限度地富集有核細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的富集量明顯增多，值得臨床推廣應(yīng)用。