沙鞭不同居群染色體數(shù)目及核型分析

王亞男，劉玉萍，劉雪利，蘇 旭,3*，劉瑞娟

(1 青海師范大學 生命科學學院，西寧 810008；2 青海師范大學 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧 810008；3 高原科學與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016；4 中國科學院西北高原生物研究所，青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810008)

染色體作為細胞遺傳信息的載體，其數(shù)目、結構和形態(tài)受外界環(huán)境影響較小[1]，在植物生長發(fā)育和繁殖過程中具有較高的穩(wěn)定性。染色體核型分析主要是對分裂中期染色體的數(shù)目、形態(tài)和結構等重要性狀進行觀察，計算和判別染色體的長度、著絲點位置、長短臂比例及隨體有無等特征[2]，進而推斷不同物種或同一物種不同居群間的親緣關系[3]?，F(xiàn)今，染色體核型分析已成為物種分類修訂、系統(tǒng)進化關系研究的重要手段[3]。先前諸多學者[4-7]對大量禾本科植物的染色體核型進行了報道。閻貴興等[4]通過對33種禾本科飼用植物染色體核型的研究，發(fā)現(xiàn)染色體基數(shù)均為7，染色體類型有中部著絲粒和近中部著絲粒染色體，多數(shù)禾本科植物的核型對稱性較高；張同林等[5]基于小麥族5個近緣屬植物染色體核型的分析，推斷了它們的系統(tǒng)發(fā)育關系，認為賴草屬植物的進化程度最低，鵝觀草屬植物的進化程度最高，披堿草屬植物的演化水平居于兩者之間；郭玉堂等[6]通過對芨芨草(Achnatherumsplendens)染色體核型的探討，結果發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目為2n = 48，核型類別為2B；李偉偉等[7]利用染色體壓片技術對沙鞭(Psammochloavillosa)的染色體數(shù)目進行了觀察，表明該物種的染色體數(shù)目為2n = 40。

沙鞭是禾本科(Poaceae)沙鞭屬(Psammochloa)一種多年生根莖類草本植物，主要分布于中國內蒙古、陜西、寧夏、甘肅及青海等沙地和荒漠化生境中[8]。沙鞭生長于海拔900 ～ 2 900 m的流動沙丘和固定沙丘上[8]，根狀莖發(fā)達，具有較強的耐旱、耐寒、耐堿及抗風沙功能[9]，是內蒙古及其毗鄰沙化地區(qū)的重要優(yōu)勢植物；同時，該物種營養(yǎng)價值較高，是畜牧業(yè)的重要牧草，具有重要的經濟價值和生態(tài)價值。迄今，已有學者對沙鞭的外部形態(tài)特征[10]、葉表皮微形態(tài)特征[11]、種子生物學特性[12]、等位酶變異和克隆多樣性[13]、地理分布和種質資源[14]、群體遺傳多樣性[15]等方面進行了研究。然而，從居群水平上對沙鞭染色體數(shù)目、核型及親緣關系的研究目前尚未見報道。因此，本研究采用常規(guī)染色體制片技術，通過對沙鞭不同居群染色體數(shù)目和核型的綜合分析，系統(tǒng)探討它們的核型差異及系統(tǒng)親緣關系，旨在為今后沙鞭群體遺傳學、基因組學和進化生物學研究提供細胞學方面的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為沙鞭不同居群的成熟種子，采自于內蒙古阿拉善盟、鄂爾多斯和錫林郭勒盟，憑證標本保存于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)，詳細采樣信息見表1。

表1 實驗材料及來源

1.2 方 法

1.2.1 種子萌發(fā)沙鞭每個參試居群挑選10個個體的成熟飽滿種子，-20 ℃冰箱內處理24 h；然后將種子均勻放置于鋪有蒸餾水潤濕的雙層濾紙培養(yǎng)皿中[16]，22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待根長出0.5～1 cm時取樣進行預處理。

1.2.2 預處理將根尖放于預先用蒸餾水噴濕的2.0 mL離心管中，并使離心管內外保持濕潤，然后置于密封罐中N2O處理130 min，壓強設置為0.75 MPa。

1.2.3 固定與解離從密封罐中取出離心管，迅速加入卡諾氏固定液(冰乙酸∶無水乙醇=1∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用)，隨后輕輕翻滾離心管，使固定液充分覆蓋于根尖表面，4 ℃冰箱中固定10 min以上，45%乙酸解離5 min。

1.2.4 染色、壓片與觀察將適當長度的根尖分生組織置于載玻片中央，滴2滴45%乙酸，蓋上蓋玻片用鑷子鈍端敲擊，并在酒精燈上微烤，大拇指輕按蓋玻片后置于相差顯微鏡(Olympus BX43)下觀察；挑選分散良好的制片標記，然后放入-80 ℃冰箱中處理2 h以上，取出后熒光染液染色，用熒光顯微鏡(Olympus BX53)對染色體形態(tài)和數(shù)目進行觀察，并挑選分散良好、形態(tài)清晰的視野拍照[17]。

1.2.5 核型數(shù)據(jù)分析每個沙鞭參試居群統(tǒng)計30個完整的染色體中期分裂圖像，參照鄧愛輝等[18]方法確定染色體數(shù)目；利用Adobe Photoshop 2021軟件測量染色體長臂和短臂的長度[19]；常規(guī)方法統(tǒng)計染色體相對長度(RL)、長度比(CLR)、臂比(AR)等參數(shù)；核型分析依據(jù)李懋學[20]方法；相對長度系數(shù)(I.R.L)依據(jù)Kuo等[21]方法；核型不對稱系數(shù)(As.K%)依據(jù)Arano[22]方法；核型分類依據(jù)Stebbins[23]方法。

1.2.6 核型進化趨勢和聚類分析核型進化趨勢分析參照邢世巖等[24]方法，利用Microsoft Excel 2010軟件繪制沙鞭核型不對稱性程度散點圖，即核型二維進化圖；聚類分析依據(jù)李曉莉等[25]方法，利用SPSS 26軟件統(tǒng)計沙鞭染色體臂比平均值(MAR)和方差、相對長度方差、染色體長度比(CLR)和正中部著絲粒(M)、中部著絲粒(m)、近中部著絲粒(sm)或近端部著絲粒(st)染色體比例等參數(shù)，并對其進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 沙鞭不同居群染色體數(shù)目和倍性

通過對沙鞭不同居群細胞中期分裂相的觀察和計數(shù)，發(fā)現(xiàn)沙鞭居群的染色體均為二倍體，數(shù)目為2n = 2x = 46，同時未見異常的染色體數(shù)目和形態(tài)(圖1)，表明沙鞭染色體的數(shù)目較為穩(wěn)定。

2.2 沙鞭不同居群染色體形態(tài)特征和類型

選取沙鞭分散良好的染色體有絲分裂中期圖，結合表2中染色體參數(shù)和位置，將46條染色體進行同源染色體配對，共23對染色體。臂比統(tǒng)計結果顯示，沙鞭染色體有M、m、sm和st 4種類型，其中34居群有M、m和sm 3種類型， 37居群有m、sm和st 3種類型，其余居群只有m和sm 2種類型(表2)；并且，本研究還發(fā)現(xiàn)沙鞭不同居群中各類型染色體所占比例相差較大(表2)。基于沙鞭染色體相對長度系數(shù)及Kuo[21]分類標準，本研究中沙鞭不同居群染色體可劃分為長染色體L型(≥1.26)、中長染色體M2型(1.01 ～ 1.25)、中短染色體M1型(0.76 ～ 1.00)和短染色體S型(< 0.76)4種類型；除沙鞭34居群無S型染色體外，其他所有居群均具以上4種類型染色體(表2)。

表2 沙鞭不同居群染色體參數(shù)

A.P10； B. P32； C. P33； D. P34； E. P37； F. P55圖1 沙鞭有絲分裂中期染色體圖Fig.1 Mitotic chromosomes in metaphase of P. villosa

A. P10； B. P32； C. P33； D. P34； E. P37； F. P55圖2 沙鞭不同居群的染色體核型模式圖Fig.2 Chromosome idiograms in different populations of P. villosa

2.3 沙鞭不同居群染色體核型分析

沙鞭不同居群染色體核型模式圖和主要核型參數(shù)見圖2和表3。本研究結果表明，沙鞭不同居群在染色體核型公式、核型類型、染色體長度比、平均臂比及核型不對稱系數(shù)等指標均存在明顯差異。就核型類型來看，沙鞭居群染色體核型類型有1A、2A、1B和2B型，其中37和55居群的染色體核型類型為2A型， 32和33居群的染色體核型類型屬于2B型，而34和10居群的染色體核型類型分別隸屬于1A型和1B型(表3)；就沙鞭染色體長度比而言， 10居群的長度比最大(2.68)，而34和55居群的長度比最小(1.73)(表3)；同樣，在染色體平均臂比上， 37居群的平均臂比最大(1.62)，10和34居群的平均臂比最小(1.29)(表3)；就核型不對稱系數(shù)來說，沙鞭34居群的核型不對稱系數(shù)最小(55.96%)，表明核型對稱性最佳，而37居群的核型不對稱系數(shù)最大(59.95%),說明核型對稱性最差(表3)。

2.4 沙鞭不同居群染色體核型進化趨勢分析

通過對沙鞭居群染色體長度比和平均臂比統(tǒng)計分析，本研究發(fā)現(xiàn)沙鞭染色體核型呈現(xiàn)“雙向進化趨勢”，即有些居群沿染色體平均臂比方向進化較快，如37居群；而另一些居群則沿染色體長度比方向進化較快，如10居群(圖3，A)。就沙鞭居群總體進化趨勢而言，二維圖右上方的居群通常具有較高的進化程度，相反左下方的居群往往進化程度較低，因而我們認為34居群進化程度較低，37居群進化程度相對較高(圖3，A)。同樣，基于沙鞭居群染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)的研究，我們發(fā)現(xiàn)沙鞭居群總體沿著二維圖右上角方向進化，其中37居群的染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)最大，表明進化程度較高；然而34居群的染色體平均臂比和核型不對稱系數(shù)最小，說明進化程度較低(圖3，B)，這與上述研究結果一致。因此，本研究認為沙鞭34居群起源較早，進化程度較低，而37居群起源較晚，進化程度較高(圖3)。

圖3 沙鞭不同居群染色體核型進化趨勢Fig.3 Evolution trend of chromosome karyotypes in different populations of P. villosa

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

2.5 沙鞭不同居群的染色體核型聚類分析

對沙鞭不同居群進行聚類分析，結果(圖4)表明當遺傳距離為1.0時，沙鞭6個居群聚為3類，其中32和33居群聚為一類， 10、34和55居群聚為一類，而37居群單獨聚為一類；當遺傳距離為9.0時，沙鞭6個居群聚為2類， 37居群仍單獨聚為一類，而剩余所有居群聚為一類。研究表明在親緣關系上，37居群與其他居群的相似度較小。

圖4 沙鞭不同居群染色體核型系統(tǒng)聚類圖Fig.4 The clustering analysis of chromosome karyotypes in different populations of P. villosa

3 討 論

染色體作為生物細胞核中的重要組成成分，其數(shù)目、形態(tài)、結構和核型通常較為穩(wěn)定，可作為物種分類和系統(tǒng)進化關系研究的重要細胞學依據(jù)[26-27]。本研究表明，沙鞭不同居群的染色體均為二倍體，染色體長度介于1 ～ 4.21 μm，隸屬于小型染色體，這與李偉偉等[7]的研究結果一致；沙鞭所有參試居群的染色體數(shù)目均為46條，這與李偉偉等[7]先前報道的沙鞭染色體數(shù)目為40條顯然不同，我們認為這可能是由于壓片過程中染色體重疊所導致。同時，通過對沙鞭不同居群染色體參數(shù)的統(tǒng)計分析，我們還發(fā)現(xiàn)沙鞭不同居群之間的染色體形態(tài)存在差異，染色體長度比和平均臂比等不同。張建波等[28]對川西北高原12個垂穗披堿草(Elymusnutans)居群的染色體核型研究，認為同種植物染色體形態(tài)隨著生境不同而發(fā)生變化，即存在染色體形態(tài)多樣性。染色體形態(tài)是研究屬下或種下物種或居群親緣關系和演化趨勢的主要核型特征[29]，本研究參試沙鞭居群具有相同的染色體數(shù)目，但形態(tài)不同，可以推測它們屬于同一物種的不同生態(tài)居群。同種植物在長期的自然選擇和人工選擇的作用下，為適應當?shù)氐淖匀簧鷳B(tài)環(huán)境有可能逐步演化成不同的生態(tài)居群[30]。因此，我們認為沙鞭不同居群染色體形態(tài)的差異也是由生長環(huán)境不同導致的，這進一步驗證了先前諸多研究的合理性[18,28]。

研究表明，植物染色體核型的進化趨勢由對稱向不對稱方向進化，因此系統(tǒng)進化上比較古老或原始的植物往往具有較對稱的染色體核型，而不對稱的染色體核型通常存在于較進化的植物類群中，即核型的對稱性越高，其進化程度越原始[29,31]。通過對沙鞭6個居群染色體核型不對稱系數(shù)和核型類型的研究，我們發(fā)現(xiàn)沙鞭居群核型不對稱系數(shù)介于50% ～ 60%，核型類型為1A、2A、1B或2B型，屬于對稱性較好和較原始的核型類型，大小依次為37 > 32 > 55 > 33 > 10 > 34居群，表明它們在系統(tǒng)進化中的地位不同，同時這與先前報道的許多沙鞭近緣種如芨芨草、大針茅(Stipagrandis)等[32]的核型類型較為一致。此外，基于沙鞭居群核型進化趨勢研究結果，我們同樣發(fā)現(xiàn)沙鞭居群37的進化程度相對較高， 34居群的進化程度相對較低，表明37居群在沙鞭所有參試居群中具有最強的抗旱性[32]，因此沙鞭37居群在今后沙鞭遺傳育種、優(yōu)良種質資源篩選以及品種推廣應用等方面具有重要利用價值。

遺傳物質的相似性不僅可以決定物種間的親緣關系，而且可以推測物種在進化過程中彼此分化的歷程。遺傳物質在細胞水平上的表征就是核型。將核型數(shù)據(jù)進行數(shù)理統(tǒng)計并聚類分析，以此估算遺傳距離，能夠多向的、立體的、多維的考察物種間的相似性，從而判斷物種間的親緣關系[30]。此外，植物染色體核型聚類分析還能夠直觀反映不同居群間的遺傳分化和親緣關系[33]。本研究結果顯示，當遺傳距離為9時，沙鞭不同產地的6個居群聚為兩大類, 其中一大類有10、32、33、34和37居群構成，表明這5個居群間具有相對較近的親緣關系，彼此間相似度和進化程度較為類似；另一大類僅有 37居群組成，其與其他供試居群間親緣關系較遠?？傊狙芯繌木尤核缴鲜状螌ι潮奕旧w核型進行了較為系統(tǒng)的報道，旨在為今后沙鞭的系統(tǒng)進化、優(yōu)良種質資源篩選和新品種選育等研究提供細胞學依據(jù)。

致謝：感謝中國科學院西北高原生物研究所劉博師兄、青海師范大學梁瑞芳和呂婷師姐在沙鞭染色體壓片，以及青海師范大學劉峰師兄在染色體核型模式圖制作上給予的指導和幫助。