米槁組織培養(yǎng)不定芽發(fā)生與繼代增殖

梁格林，劉濟明，2*，武夢瑤，劉 歡，唐子燕

(1 貴州大學(xué) 林學(xué)院， 貴陽 550025；2 貴州大學(xué) 森林生態(tài)研究中心, 貴陽 550025)

米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)系樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木，主要分布于中國貴州、廣西、云南等省份[1]，其干燥成熟的果實為貴州省十大苗藥之一的大果木姜子，具有散寒怯濕、行氣止痛等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明米槁果實精油中主要的化學(xué)成分為1，8-桉葉素(23.75%)、香檜烯(10.63%)、檸檬烯(8.77%) 和a-松油醇(6.36%)等，具有減少心肌耗氧量，增加心肌供氧，促進冠脈流量，對急性心肌缺血和梗死具有良好的保護等藥理作用[3-5]。常見的以米槁果實為原料研發(fā)的制劑有“理氣活血滴丸、心胃止痛膠囊、金喉健噴霧劑”等民族中成藥[2]。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)米槁藥材主要來源于野生資源，由于人為擾動過大，生態(tài)環(huán)境破壞，現(xiàn)存的有效野生資源多為成年古樹，幼樹罕見，種子發(fā)芽率低，造成米槁種群呈衰退趨勢，無法滿足藥用需求[6]。為了滿足市場需求，實現(xiàn)藥材資源的可持續(xù)健康發(fā)展，米槁人工培育勢在必行。目前米槁主要通過播種育苗繁殖，但種子生物學(xué)研究表明，米槁種皮堅硬且厚，種子透水性差，種子活力會隨時間的增加而下降，正常播種發(fā)芽率低[7]。這些問題嚴(yán)重制約了米槁的實際生產(chǎn)及大規(guī)模規(guī)范化種植的開展。同時，前期米槁扦插研究發(fā)現(xiàn)[8]，米槁插穗中存在對生根起抑制作用的物質(zhì)，影響其成活率。本實驗對米槁離體培養(yǎng)進行研究，通過不定芽的誘導(dǎo)及增殖，旨在建立米槁繁殖體系，滿足種苗需求，為米槁產(chǎn)業(yè)化和規(guī)范化種植奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

于2018年11月采集貴州大學(xué)林學(xué)院(106°39′26.50″E，26°27′14.58″N)播種栽培的2年生優(yōu)質(zhì)米槁植株為供試材料。選取當(dāng)年生生長健壯、未木質(zhì)化或半木質(zhì)化的帶芽莖段為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體消毒處理選取當(dāng)年生生長健壯、無病蟲害枝條，摘除葉片，用牙刷蘸取洗潔精水，輕輕刷去外植體表面灰塵，并把刷洗好的外植體放置在流水下沖洗2 h左右，將外植體表面灰塵與洗潔精水沖洗干凈，然后轉(zhuǎn)移到組培超凈工作臺上操作。用75%酒精浸泡30 s，再分別用0.1% HgCl2和2%次氯酸鈉溶液處理6.5、7.0、9.0 min后，用無菌水沖洗3～5次(3個處理)，無菌濾紙吸干外植體表面水分，用無菌刀片切除莖段上下兩端，保留1.5～2 cm長的帶腋芽莖段，接種于配制好的培養(yǎng)基中，每個處理20瓶，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次。接種20 d后，記錄存活、感染及褐化情況。

1.2.2 外植體最佳取材時間分別于1月、4月、6月、7月、9月、10月、11月選取外植體，采用相同消毒方式對其進行消毒處理。將消毒后的莖段切去與藥液接觸的傷口后，接種于均添加蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L的MS基本培養(yǎng)基中。每處理30個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后，觀察并統(tǒng)計帶芽莖段染菌率、褐化率及發(fā)芽率。

1.2.3 不定芽初代誘導(dǎo)培養(yǎng)選用最佳消毒時間和取材時間處理外植體，將帶芽莖段接種到均添加蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L的MS培養(yǎng)基中，再分別添加不同濃度(1.0、2.0 和3.0 mg/L)6-BA與IBA(0.1、0.2 和0.3 mg/L)，共9個不同濃度組合的處理。每個處理接種20瓶，每瓶1～2個帶芽莖段，重復(fù)3次。接種25 d后觀察帶芽莖段的變化，統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率。

1.2.4 不定芽繼代增殖培養(yǎng)通過莖段培養(yǎng)獲得的不定芽為培養(yǎng)材料，將不定芽分割成2 cm長的芽，接種到含有不同濃度6-BA(0.1、0.3和0.5 mg/L)與NAA(0.2、0.5和1.0 mg/L)以及AC(0.3 g/L)的MS培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。正交試驗，共9個處理，每個處理接種20瓶，每瓶1～2個不定芽，重復(fù)3次，接種30 d后開始觀察和記錄不定芽增殖情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件以上試驗培養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃，光照時間12～14 h/d，培養(yǎng)基pH5.8。對米槁帶芽莖段進行不定芽誘導(dǎo)和增殖時光照強度1 500～2 000 Lx。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)于Excel 2016中進行，使用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，Origin2018軟件繪圖。結(jié)果統(tǒng)計中涉及的測定指標(biāo)計算公式如下：

污染率(%)=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

成活率(%)=成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

褐化率(%)=褐變外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

發(fā)芽率(%)=腋芽萌發(fā)外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)×100%

不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出不定芽的帶芽莖段數(shù)/接種的帶芽莖段數(shù)×100%

增殖系數(shù)=增殖后長出的不定芽總數(shù)/接種的不定芽個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理組合對米槁不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

采用0.1% HgCl2進行不同消毒時間的滅菌，接種到MS培養(yǎng)基上，結(jié)果(表1)顯示，外植體污染率、褐化率及存活率在各處理組間的差異達到顯著水平，其中，A1處理組的污染率最低(1.06%)，外植體褐化率最低(3.26%)，存活率最高(95.74%)。A2處理組的外植體污染率與A3處理組的外植體褐化率極顯著高于其他兩組處理，達到13.31%和20.00%。因此，綜合考慮適用于米槁外植體的消毒方式為75%酒精 30 s+0.1% HgCl26.5 min。

表1 不同消毒組合處理對外植體污染率的影響

依照上述最佳消毒時間，取不同時期的米槁帶芽莖段作為外植體，在MS培養(yǎng)基中進行接種，其外植體的染菌率、褐化率及發(fā)芽率會因取材時期的不同而不同(圖1)。方差分析表明，不同取材時期對污染率、褐化率和發(fā)芽率有顯著性影響。1月、7月和10月外植體染菌率最高，達到16.00%、9.59%和17.77%。6月和7月米槁外植體的褐化率相比其他月份較高，且發(fā)芽率最低。9月、10月和11月米槁外植體的發(fā)芽率較高，褐化率也較低，其中，11月污染率也低(4.04%)。因此，整體情況綜合分析， 11月份是外植體取材進行消毒的最佳時期。

2.2 激素配比對米槁不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

不定芽誘導(dǎo)過程中，帶芽莖段接種7 d左右，腋芽出現(xiàn)萌動；10 d后，腋芽開始長出，葉片嫩綠細長；15 d后，所處理的腋芽都開始萌發(fā)，莖段長出新的側(cè)枝，葉片伸展，莖變粗壯，由于帶腋芽莖段的腋芽處于萌動時期，所以分化時間快(圖2，A-C)；培養(yǎng)30 d后可繼代培養(yǎng)，芽生長情況好，顏色深綠，莖段粗壯。對9種培養(yǎng)基上的不定芽誘導(dǎo)率進行方差分析(表2)，結(jié)果表明，不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響差異極顯著(P<0.01)，說明6-BA與IBA均是影響米槁帶芽莖段誘導(dǎo)率的重要因素。由表2可見，在MS培養(yǎng)基上，隨著6-BA濃度的增加，不定芽誘導(dǎo)率先升高后下降，說明6-BA濃度過高會抑制不定芽的產(chǎn)生； IBA濃度過高也會抑制腋芽的誘導(dǎo)，使誘導(dǎo)率有所下降。3.0 mg/L 6-BA 與0.3 mg/L IBA處理組C8與C4處理無顯著差異，但處理組C8的誘導(dǎo)率達最大值(84.02%)。因此，最適合米槁帶芽莖段誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L IBA。

表2 激素配比對米槁不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 激素配比對米槁不定芽繼代增殖培養(yǎng)的影響

由正交試驗結(jié)果(表3)可知，不定芽誘導(dǎo)極差顯示為RB>RA，兩種激素的影響效應(yīng)表現(xiàn)為NAA>6-BA，NAA濃度一定時，不同濃度6-BA處理下的增殖系數(shù)無顯著差異，證明不定芽誘導(dǎo)增殖主要與NAA濃度有關(guān)。根據(jù)各因素水平增殖系數(shù)平均值(Ki)的大小，可得到最優(yōu)水平組合為A1、B3；同時，方差數(shù)據(jù)分析表明(表4)，激素NAA對增殖系數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，而6-BA以及6-BA與NAA的交互作用均無極顯著影響(P>0.01)。綜上所述，最適宜米槁增殖的培養(yǎng)基為： MS+ 0.1 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA。

表3 米槁不定芽繼代增殖培養(yǎng)的正交試驗

表4 增殖系數(shù)方差分析結(jié)果

不同小寫字母表示同一處理在不同月份之間差異顯著(P <0.05)圖1 不同取材時期對外植體的影響Different normal letters indicate that the same treatment has significant differences in different months (P<0.05)Fig.1 The effect of different sampling time points on explants

A. 培養(yǎng)7 d后腋芽萌動；B. 培養(yǎng)10 d后葉片伸長，葉片嫩綠細長；C. 培養(yǎng)15 d后莖段長出新側(cè)枝，葉片舒展，莖漸粗壯圖2 莖段培養(yǎng)不定芽的發(fā)生和生長情況A. The axillary buds germinate after 7 days of culture; B. After 10 days of culture, the leaves are elongated, green and slender; C. After 15 days of culture, the new side branches grow from stems, the leaves stretch, and the stems become thickerFig.2 Adventitious buds induced by stem segments

將生長健壯的芽進行切割，接種于增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周左右莖段腋部及其他部位開始萌發(fā)出腋芽；培養(yǎng)15 d后，腋芽明顯伸長，基部不定芽叢明顯增多，并開始伸長，整體呈翠綠色；30 d后基部不定芽叢生長快速，側(cè)芽分化出芽，葉片伸展，顏色轉(zhuǎn)為深綠色(圖3，A-B)。

A. 培養(yǎng)10 d的小苗；B. 培養(yǎng)30 d后的叢生芽及小苗圖3 莖段的繼代增殖與培養(yǎng)A. The seedlings cultivated for 10 days; B. The cluster buds and seedlings cultivated for 30 daysFig.3 Subsequent proliferation and cultivation of stem segments

3 討 論

本研究采用米槁帶芽莖段為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，進而進行不定芽增殖。省去了外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織分化出不定芽的階段，縮短了從外植體到組培苗的整個誘導(dǎo)周期，同時也提高了增殖系數(shù)，是一種更加快速高效的再生體系[9]。

組培工作的兩大重點和難點包括外植體的消毒和培養(yǎng)基的組配，其中獲得有活性的無菌材料是植物離體快繁體系的首要條件[10]。本研究表明米槁外植體的最適消毒方式為75%酒精30 s + 0.1% HgCl26.5 min，污染率和褐化率分別低至1.06%和3.26%。與腦樟(Cinnamomumcamphora)[11]、大葉芳樟(Cinnamomumporrectum)[12]、牛樟(CinnamomumkanehiraeHay)[13]在組織培養(yǎng)過程中選用的消毒方式相同，但采用HgCl2進行消毒的時間受外植體的大小和幼嫩程度影響。在本研究中，11月為外植體取材的最佳時期，而彭東輝等[11]采集腦樟帶芽莖段進行研究后發(fā)現(xiàn)，3-4月及9-10月兩個時間段腋芽萌發(fā)率最高，分別為68.5%和64.6%；官錦燕等[14]，辛亞龍等[13]以牛樟帶芽莖段為外植體進行誘導(dǎo)試驗，發(fā)現(xiàn)3-4月、6月出芽率高于9-10月和12月。這可能由于外界環(huán)境和季節(jié)的變化引起了植物體內(nèi)內(nèi)源激素含量的變化[15-16]；秋季植物體莖段二次抽梢，由于氣溫低，外植體生理代謝的活動減弱，細胞內(nèi)參與氧化反應(yīng)的多酚活性減低[17]。依據(jù)上述研究，以莖段作為外植體，在采集時間上既要考慮外植體的生理狀態(tài)、芽體實際情況及內(nèi)源激素含量存在的差異，也要考慮當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件。

植物激素作為調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)，在植物再生缺失的組織和器官的進程中，能夠誘導(dǎo)縮短再生進程，既能起到誘導(dǎo)的作用，也能抑制植物的生長[18]。試驗研究發(fā)現(xiàn)6-BA和IBA均對米槁不定芽的誘導(dǎo)影響顯著。6-BA作為一種常用的植物細胞分裂素，在使用過程中需要控制好濃度，過高濃度會抑制不定芽的誘導(dǎo)(IBA濃度為0.3 ml/L除外)；同時過高濃度的IBA會降低誘導(dǎo)率，這與官錦燕等[14]、辛亞龍等[13]對牛樟的研究結(jié)果相似，高濃度的IBA會更容易誘導(dǎo)出愈傷組織，從而降低不定芽誘導(dǎo)率。與申展[19]、林萍等[20]研究結(jié)果不同：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加6-BA及NAA，對香樟(Cinnamomumcamphora)、閩楠[Phoebebournei(Hemsl.)Yang]及滇潤楠(Machilusyunnanensisvar.duclouxii)的誘導(dǎo)效果更佳。這可能是由于基因型不同，對不同激素誘導(dǎo)的響應(yīng)不同。

在樟科的組織培育中，MS基本培養(yǎng)基附加1.5～2.0 mg/L的6-BA增殖效果更好[13, 21]，甚至在腦樟[11]和香樟[22]的研究中，使用3.0～4.0 mg/L的6-BA腋芽均能正常生長并增殖；并表明6-BA對不定芽增殖影響差異顯著，NAA差異不顯著，高濃度的NAA易誘導(dǎo)愈傷組織，不利于細胞分化形成芽苗。而本研究發(fā)現(xiàn)不定芽的增殖主要與NAA的濃度有關(guān)，添加1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最高?？赡苁且驗樵鲋尺^程中內(nèi)源激素與外源激素需要達到一種動態(tài)平衡，不同基因型的外植體內(nèi)源激素含量不一樣，導(dǎo)致在增殖分化時需要添加的外源激素的種類及濃度也有所差異。Skoog[23]“激素平衡”假說也提到：生長素生物學(xué)效應(yīng)大于細胞分裂素時，誘導(dǎo)植物組織脫分化；細胞分裂素的效應(yīng)大于生長素時，誘導(dǎo)愈傷組織再分化；值得注意的是，激素的生物學(xué)效應(yīng)是內(nèi)源激素與外源激素效應(yīng)的總和。也有研究認(rèn)為NAA與6-BA具有一定的互作效應(yīng)[24]，導(dǎo)致這一差異的原因也可能是培養(yǎng)基內(nèi)激素濃度配比不同所致。Amirchakhmaghi等[25]提出使用1/2MS培養(yǎng)基可獲得更好的增殖系數(shù)，而MS培養(yǎng)基更有利于芽的伸長，因此，利用1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基或者選用更高濃度的6-BA進行米槁增殖培養(yǎng)是否會達到更好的增殖效果還有待進一步研究。

辛全偉[26]、馮瑜[27]對香樟的研究均表明AC對抑制褐化作用最明顯，且有利于增殖系數(shù)的增加，本試驗中添加了0.3 g/L AC，有效減少了增殖過程中的褐化現(xiàn)象。在組織培養(yǎng)階段，需要持續(xù)觀察增殖苗的生長狀況，以便使用適量的外源植物生長調(diào)節(jié)劑；同時，為了達到快速繁殖的目的，既要維持一定的誘導(dǎo)率與增殖系數(shù)，也需提升有效苗的數(shù)量。該研究通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行了米槁種苗的快速繁殖，為其規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化人工種苗生產(chǎn)及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。