葉面噴施褪黑素對(duì)干旱及復(fù)水下玉米光合特性和抗氧化系統(tǒng)的影響

趙成鳳，楊 梅，李紅杰，郝淼藝，王國(guó)興,2，張仁和*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100; 2 寶雞迪興農(nóng)業(yè)科技有限公司，陜西眉縣 723000)

玉米是陜西省主要糧食作物之一，干旱嚴(yán)重限制玉米的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[1]。隨著氣候變化的加劇，高溫和降雨不均勻?qū)е掠衩咨L(zhǎng)在干旱和復(fù)水的生境中[2]。因此干旱脅迫下維持玉米生長(zhǎng)以及提高旱后復(fù)水植株的恢復(fù)潛能對(duì)于玉米適應(yīng)干旱環(huán)境十分重要[3]。干旱通常會(huì)導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，阻礙CO2通過(guò)空氣→細(xì)胞間隙→葉肉細(xì)胞的途徑擴(kuò)散，進(jìn)一步引起光合作用下降。光能吸收與利用失衡促進(jìn)活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，植株啟動(dòng)復(fù)雜的保護(hù)酶系統(tǒng)清除活性氧來(lái)保護(hù)光合機(jī)構(gòu)，但嚴(yán)重干旱仍破壞植株體內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化損傷。研究顯示干旱解除后植物可以通過(guò)自身各種生理生化反應(yīng)主動(dòng)恢復(fù)生長(zhǎng)，通過(guò)一定補(bǔ)償效應(yīng)，抵消因干旱脅迫對(duì)玉米造成的傷害[4]；但植物重度干旱脅迫后復(fù)水其農(nóng)藝性狀與生理功能恢復(fù)程度仍低于正常灌水的水平[5]?？梢?jiàn)，植物的抗旱性不僅體現(xiàn)在對(duì)干旱脅迫的耐受程度上，還應(yīng)包括脅迫狀態(tài)解除后的恢復(fù)生長(zhǎng)能力[6]，而且植株復(fù)水后的恢復(fù)能力取決于干旱程度、植株基因型和栽培管理因素(如氮素調(diào)控、噴施調(diào)控劑等)[7-8]。

褪黑素是一種重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是一種直接的自由基清除劑和間接的抗氧化劑[9]。研究表明外源噴施褪黑素能夠有效地提高植物對(duì)多種不利環(huán)境因素的抵抗力，如寒冷、干旱、鹽和紫外線輻射等[10-13]。褪黑素能通過(guò)提高干旱脅迫下番茄的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、PSⅡ量子效率和電子傳遞保護(hù)其免受干旱誘導(dǎo)的光抑制或光氧化[14]。同時(shí)，褪黑素提高干旱脅迫下核桃葉片抗氧化酶的活性，增強(qiáng)了 ROS 清除能力，減輕了氧化損傷[15]。目前，外源褪黑素在提高植物抗逆性上的研究已有不少報(bào)道，但主要集中褪黑素緩解干旱脅迫的傷害程度上[16]，而外源褪黑素對(duì)干旱復(fù)水后調(diào)控玉米葉片光合電子傳遞特性及抗氧化系統(tǒng)作用機(jī)理研究還相對(duì)較少。鑒于此，本研究采用盆栽控水試驗(yàn)，以陜北旱區(qū)主推玉米品種‘陜科9號(hào)’為材料，探究葉面噴施褪黑素對(duì)干旱及復(fù)水下玉米生長(zhǎng)、光合作用、抗氧化酶活性和相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在闡明干旱及復(fù)水條件下葉面噴施褪黑素改善玉米抗旱性的生理機(jī)制，為玉米抗旱節(jié)水栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用人工盆栽控水的方法，于2020年5-9月在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作物示范園活動(dòng)式防雨棚內(nèi)進(jìn)行。供試玉米(ZeamaysL.)品種為‘陜科9號(hào)’。挑選飽滿的玉米種子播種于規(guī)格基本相同的塑料桶(內(nèi)徑26 cm，深38 cm)內(nèi)，栽培基質(zhì)為風(fēng)干粘壤土，每桶裝土15 kg，土壤田間最大持水量為28.1%。播種前，每桶分別加入1.6 g 純N、0.6 g P2O5和0.8 g K2O。三葉期定苗至每盆3株，定苗后玉米長(zhǎng)至第9片葉完全展開(kāi)時(shí)開(kāi)始控水。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：(1)正常供水+葉面噴施蒸餾水(CK)；(2)正常供水+葉面噴施100 μmol·L-1褪黑素(MT)；(3)重度干旱+葉面噴施蒸餾水(DS)；(4)重度干旱+葉面噴施100 μmol·L-1褪黑素(DS+MT)。課題組前期的試驗(yàn)表明100 μmol·L-1褪黑素是減輕光合機(jī)構(gòu)損傷的較有效濃度，因此選擇100 μmol·L-1的褪黑素進(jìn)行試驗(yàn)[16]。控水開(kāi)始后的每天下午8:00對(duì)玉米植株噴施褪黑素或清水，噴施體積以水珠布滿葉片開(kāi)始從葉片滴下時(shí)停止。正常供水土壤含水量是土壤田間持水量的80%，重度干旱土壤含水量是土壤田間持水量的40%，采用稱重法對(duì)盆栽進(jìn)行控水處理，盆栽每天稱重后，按照土壤持水量的80%和40%計(jì)算每盆的灌水量，進(jìn)行灌水[17]。重度干旱維持6 d后進(jìn)行取樣和數(shù)據(jù)測(cè)定，然后復(fù)水(充分灌水至土壤相對(duì)含水量的80%)12 d后測(cè)定葉片各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 葉面積、葉片相對(duì)含水量和地上部干物質(zhì)的測(cè)定

1.2.1 葉面積每處理隨機(jī)選取6株，用直尺測(cè)量其葉長(zhǎng)、葉寬，計(jì)算單葉葉面積，單株葉面積為所有平展葉的葉面積總和。按以下公式計(jì)算單葉葉面積：

單葉面積=葉長(zhǎng)×最大葉寬×0.75

1.2.2 葉片相對(duì)含水量(RWC) 每個(gè)處理取3株玉米的穗位葉葉片，稱量葉片鮮質(zhì)量(FW)后迅速將其插入清水中浸泡8 h，再將葉片從水中取出，擦拭掉葉片表面多余水分并稱取飽和鮮質(zhì)量(TW)，最后經(jīng)105 ℃下殺青30 min，80 ℃烘至恒重，稱干質(zhì)量(DW)，按以下公式計(jì)算葉片相對(duì)含水量：

RWC = (FW-DW)/(TW-DW)×100%

1.2.3 地上部干物質(zhì)重每處理隨機(jī)取樣5株，采集所有植株的葉和莖于烘箱105 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘箱烘干至恒重后稱重。

1.3 葉片葉綠素?zé)晒饧癙700 氧化還原狀態(tài)的測(cè)定

選取頂部第三片完全展開(kāi)的葉片暗適應(yīng)30 min，然后利用Dual-PAM-100熒光儀(Walz, Germany)對(duì)活體玉米葉片的葉綠素?zé)晒夂蚉700氧化還原狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量時(shí)飽和脈沖光光強(qiáng)為10 000 μmol·m-2·s-1，光化光的光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1。暗適應(yīng)后首先打開(kāi)測(cè)量光測(cè)定最小熒光產(chǎn)量(Fo)，接著打開(kāi)一個(gè)飽和脈沖，測(cè)量暗適應(yīng)30 min后的最大熒光(Fm)和最大P700信號(hào)(Pm)，隨后打開(kāi)光化光(AL)，同時(shí)間隔一段時(shí)間打開(kāi)一個(gè)飽和脈沖測(cè)定熒光信號(hào)，得到實(shí)際熒光產(chǎn)量(Fs)、光適應(yīng)下最大熒光值(Fm′)和光下最大P700信號(hào)(Pm′)。PSⅡ 熒光參數(shù)主要包括：PSⅡ 量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)、非調(diào)節(jié)式能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NO)、調(diào)節(jié)式能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NPQ)；PSⅠ 熒光參數(shù)包括：PSⅠ 量子產(chǎn)量Y(Ⅰ)、由供體側(cè)限制引起的PSⅠ處非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量Y(ND)、由受體側(cè)限制引起的PSⅠ處非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NA)[18]。

1.4 葉片MDA含量與H2O2含量的測(cè)定

取各處理0.5 g葉片于預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7.8)，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，在4 ℃、4 000×g下離心20 min，吸取上清液保存到4 ℃冰箱，用于測(cè)定H2O2和MDA含量。

MDA含量采用TCA-TBA比色法測(cè)定[19]。取離心的上清液1 mL(對(duì)照加1 mL蒸餾水)和2 mL硫代巴比妥酸(0.6%，W/V)的混合物煮沸15 min，冷卻后在4 000 ×g離心15 min，然后分別在532 nm、600 nm和450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。各處理重復(fù)3次。

H2O2的含量參考Chen等的方法測(cè)定[20]。取離心的上清液2 mL (對(duì)照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻吸取離心的上清液2 mL (對(duì)照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。各處理重復(fù)3次。

1.5 葉片抗氧化酶活性測(cè)定

稱取各處理0.5 g葉片于預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH7.8)在冰浴上研磨成漿，在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，吸取上清液保存到4 ℃冰箱，用于測(cè)定葉片SOD、CAT、APX和GR活性。

SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[21]。通過(guò)監(jiān)測(cè)NBT的光化學(xué)還原的抑制來(lái)測(cè)定SOD活性，酶反應(yīng)體系為磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH7.8)、甲硫氨酸(130 mmol·L-1)、核黃素液(20 μmol·L-1)、NBT(750 mmol·L-1)、乙二胺四乙酸二鈉(100 μmol·L-1)、0.5 mL蒸餾水和0.1 mL粗酶液(對(duì)照加0.1 mL蒸餾水)，其中一管對(duì)照放置黑暗中作空白管，將其余各管在 4 000 Lux下光照30 min，以空白調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)液在560 nm下的吸光度。各處理重復(fù)3次。

CAT活性的測(cè)定采用紫外吸收法[21]。通過(guò)檢測(cè)H2O2在240 nm處的吸光度降低來(lái)測(cè)定CAT活性，酶反應(yīng)體系為磷酸鹽緩沖液(100 mmol·L-1，pH7.0)，H2O2(20 mmol·L-1)和0.1 mL粗酶液，在25 ℃下通過(guò)H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，立即在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定240 nm處的吸光度A240(蒸餾水調(diào)零)，每隔30 s讀數(shù)一次，共測(cè)3 min。各處理重復(fù)3次。

APX活性的測(cè)定采用過(guò)氧化氫法[22]。酶反應(yīng)體系包括磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH 7.0，內(nèi)含0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉)， 5 mmol·L-1AsA，20 mmol·L-1H2O2和粗酶液。加入H2O2以啟動(dòng)反應(yīng)，立即在290 nm下測(cè)定吸光值，每隔30 s讀數(shù)一次，共測(cè)3 min。各處理重復(fù)3次。

GR活性的測(cè)定采用比色法[23]。酶反應(yīng)體系包括Tris-HCl(100 mmol·L-1，pH 8.0)，GSSG(1 mmol·L-1)，NADPH(0.2 mmol·L-1)和粗酶液，由NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，在340 nm下測(cè)定吸光值。各處理重復(fù)3次。

1.6 抗氧化酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

基因的相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定。取冷凍葉樣品300 mg在液氮下研磨成粉末，并使用RNA提取試劑盒(TIANGEN，China)提取總RNA。然后，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(FastQuant RT Kit，TIANGEN，China)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成 cDNA為模板,對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-PCR按照制造商的說(shuō)明書(SuperReal PreMix Plus (SYBR Green，Tiangen，China)進(jìn)行?；蛱禺愋砸镌O(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0，以GADPH為內(nèi)參基因。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物列表

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，用Duncan的多重比較方法，顯著水平為0.05；采用Excel 2010進(jìn)行繪圖。本研究給出的所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響

圖1顯示，與CK相比，玉米葉片相對(duì)含水量(RWC)、地上部干物質(zhì)量以及葉面積在CK和MT處理下均沒(méi)有受到顯著影響，在單獨(dú)干旱脅迫處理(DS)下分別顯著下降了24.6%、37.2%和29.7%，在DS+MT處理下雖分別顯著下降了13.6%、15.7%和12.0%，但均顯著高于相應(yīng)的單獨(dú)干旱脅迫處理。在復(fù)水后，干旱脅迫下葉面噴施褪黑素的玉米各指標(biāo)都恢復(fù)到對(duì)照水平，而未噴施褪黑素的干旱脅迫植株則未能完全恢復(fù)，仍顯著低于同期CK。以上結(jié)果表明葉面噴施褪黑素有利于提高玉米抗旱性及復(fù)水后的生長(zhǎng)恢復(fù)。

CK.正常供水+葉面噴施蒸餾水；MT.正常供水+葉面噴施100 μmol·L-1褪黑素； DS.重度干旱+葉面噴施蒸餾水；DS+MT.重度干旱+葉面噴施100 μmol·L-1褪黑素。不同字母表示0.05水平差異顯著。下同圖1 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片含水量、葉面積及地上部生物量的影響CK. Distilled water pretreatment plus well watered; MT.100 μmol·L-1 melatonin plus well watered; DS. Distilled water pretreatment plus drought; DS+MT.100 μmol·L-1 melatonin plus drought. Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same as belowFig.1 Effect of exogenous MT on leaf water content, leaf area and aboveground biomass of maize under drought and rewatering

2.2 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片PSⅡ和PSⅠ光能分配的影響

干旱脅迫使得玉米葉片PSⅠ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅰ)比CK顯著降低42.16%(圖2，A)，卻使其葉片Y(NA)和Y(ND)比CK顯著升高(圖2，C、E)；外源噴施褪黑素處理對(duì)正常灌水條件下的玉米葉片Y(Ⅰ)、Y(NA)和Y(ND)均無(wú)顯著影響，卻使干旱脅迫下的玉米葉片Y(Ⅰ)顯著升高，Y(NA)和Y(ND)顯著降低，但Y(Ⅰ)仍顯著低于CK，Y(NA)仍顯著高于CK，而Y(ND)則恢復(fù)至CK水平。在復(fù)水之后，葉面噴施外源褪黑素的玉米葉片Y(Ⅰ)、Y(NA)和Y(ND)均恢復(fù)到對(duì)照水平，而單獨(dú)干旱脅迫處理的玉米僅Y(ND)恢復(fù)至CK水平，但Y(Ⅰ)和Y(NA)仍與對(duì)照存在顯著差異(圖2，A、C和E)。

同時(shí)，圖2，B、D、F顯示，玉米葉片PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y(NPQ)和非調(diào)節(jié)式能量耗散Y(NO)在CK和MT處理下均沒(méi)有受到顯著影響。在干旱脅迫下(DS)，其Y(Ⅱ)和Y(NPQ)分別比CK顯著降低26.6%和17.9%，Y(NO) 則比CK顯著增加58.7%。在干旱脅迫后噴施褪黑素使玉米葉片Y(NPQ)恢復(fù)至CK水平，Y(Ⅱ)雖顯著提高但仍顯著低于CK，Y(NO) 雖顯著比DS處理降低但仍顯著高于CK；與干旱處理相比，外源褪黑素處理葉片Y(Ⅱ)和Y(NPQ)分別顯著增加18.1%和23.6%，而Y(NO)顯著下降22.9%。在復(fù)水以后，葉面噴施外源褪黑素使Y(Ⅱ)和Y(NO)恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果說(shuō)明干旱脅迫使玉米葉片的光合機(jī)構(gòu)受到破壞，抑制其光能利用效率，但相比單獨(dú)干旱外源噴施褪黑素處理玉米受到的影響更小，且復(fù)水后外源褪黑素處理幼苗能及時(shí)調(diào)節(jié)自身的生理機(jī)制來(lái)消除干旱脅迫造成的影響。

Y(Ⅰ).PSⅠ 量子產(chǎn)量；Y(ND).由于供體側(cè)限制引起的 PSⅠ 處非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量； Y(NA).由于受體側(cè)限制引起的 PSⅠ 處非光化學(xué)能量耗散的量子產(chǎn)量；Y(Ⅱ).PSⅡ 量子產(chǎn)量；Y(NPQ).調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量；Y(NO).非調(diào)節(jié)性能耗散的量子產(chǎn)量圖2 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片PSⅡ和PSⅠ光能分配的影響Y(Ⅰ). Effective quantum yield of PSⅠ; Y(ND). The quantum yield of non-photochemical energy dissipation due to the donor side limitation; Y(NA). The quantum yield of non-photochemical energy dissipation due to the acceptor side limitation; Y(Ⅱ). Effective quantum yield of PSⅡ; Y(NPQ). Quantum yield of regulatory energy dissipation; Y(NO). Quantum yield of non-regulatory energy dissipationFig.2 Effect of exogenous MT on light energy distribution in PSⅡ and PSⅠ of maize leaves under drought and rewatering

2.3 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片抗氧化酶活性及膜透性的影響

如圖3所示，在正常供水條件下，葉面噴施褪黑素對(duì)玉米葉片4種抗氧化酶活性沒(méi)有顯著影響；玉米葉片SOD、CAT、APX和GR的活性在單獨(dú)干旱脅迫下分別比相應(yīng)對(duì)照顯著提高35.2%、35.5%、118.9%和106.6%，而在葉面噴施褪黑素后進(jìn)一步顯著增加，相比單純干旱脅迫處理分別顯著增加了24.2%、48.7%、34.7%和26.8%。在復(fù)水以后，外源褪黑素處理玉米葉片SOD、CAT、APX和GR活性均恢復(fù)至對(duì)照水平，而未噴施褪黑素的玉米植株葉片各抗氧化酶活性仍顯著于相應(yīng)對(duì)照。這表明葉面噴施褪黑素可能使干旱脅迫條件下玉米通過(guò)顯著增強(qiáng)抗氧化酶活性來(lái)清除更多活性氧，從而減輕干旱脅迫導(dǎo)致的過(guò)氧化損傷，且復(fù)水后褪黑素處理的玉米恢復(fù)速度比干旱脅迫的玉米快。

圖3 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous MT on antioxidant enzyme activities of maize leaves under drought and rewatering

同時(shí)，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致玉米葉片膜脂過(guò)氧化和氧化損傷。與CK相比，干旱脅迫使玉米葉片MDA和H2O2含量大幅度增加，增加幅度分別達(dá)132.6%和140.4%；干旱脅迫條件下噴施褪黑素可以顯著減少玉米葉片MDA和H2O2的積累，但仍未恢復(fù)至對(duì)照水平，分別比對(duì)照顯著增加69.5%和82.0%(圖4，A、B)。在復(fù)水以后，褪黑素處理的玉米葉片MDA和H2O2含量恢復(fù)至對(duì)照水平，而單純干旱處理的玉米葉片MDA和H2O2含量仍顯著高于對(duì)照。此外，正常供水條件下噴施褪黑素對(duì)玉米葉片MDA和H2O2含量影響較小(圖4，A、B)。這表明一定濃度的外源褪黑素可有效地緩解干旱脅迫下玉米葉片受到的膜脂過(guò)氧化損傷。

圖4 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片MDA和H2O2含量的影響Fig.4 Effects of exogenous MT on MDA and H2O2 contents of maize leaves under drought and rewatering

2.4 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片抗氧化酶活性相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步明確外源褪黑素對(duì)干旱及復(fù)水下玉米葉片抗氧化酶的影響，通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定了4個(gè)抗氧化酶基因的表達(dá)變化(圖5)。在正常灌水條件下，噴施褪黑素對(duì)玉米葉片中各抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)均沒(méi)有顯著影響；干旱脅迫導(dǎo)致玉米葉片中SOD4、CAT1、APX2和GR1基因的相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)為CK的2.5、1.7、1.7和2.0倍；葉面噴施褪黑素能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)受旱玉米葉片中SOD4、CAT1、APX2和GR1的表達(dá)量分別為CK的3.1、2.3、1.9和3.1倍。在復(fù)水后，玉米葉片4個(gè)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量在褪黑素處理下均恢復(fù)至對(duì)照水平，而單純干旱脅迫處理仍顯著高于CK。表明褪黑激素不僅在抗氧化酶活性水平上起作用，且在基因水平上也有明顯促進(jìn)作用。

圖5 干旱及復(fù)水下外源褪黑素對(duì)玉米葉片抗氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of exogenous MT on the antioxidant enzyme genes relative expression level of maize leaves under drought and rewatering

3 討 論

植株葉片含水量和干物質(zhì)積累量是玉米忍耐干旱能力的主要指標(biāo)[24]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫嚴(yán)重抑制玉米的生長(zhǎng)，干旱脅迫下玉米干物質(zhì)積累量、株高以及葉面積均顯著下降，而葉面噴施褪黑素減輕了干旱誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的嚴(yán)重程度，增加了玉米地上部干物質(zhì)量；同時(shí)，外源褪黑素處理可以改善植物體內(nèi)水分含量，顯著緩解葉片相對(duì)含水量(RWC)的下降。這可能是因?yàn)楦珊得{迫下葉面噴施褪黑素的玉米可以維持較低的滲透勢(shì)以及保持了較高的膨壓，從而有助于干旱脅迫下玉米葉片水分含量保持穩(wěn)定[5]。復(fù)水后褪黑素處理的玉米干物質(zhì)量、葉面積和RWC均恢復(fù)到對(duì)照水平，表明施褪黑素促進(jìn)了復(fù)水后玉米葉片的生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累[25]。干旱脅迫下較高的玉米R(shí)WC及葉面積可能有助于保持氣孔開(kāi)放和相對(duì)較高的光合面積[25]，而這可能使玉米維持良好的光合作用。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)能揭示逆境脅迫下植物光合作用系統(tǒng)電子傳遞過(guò)程的變化，其中光系統(tǒng)能量轉(zhuǎn)換效率能反映逆境下PSⅡ和PSⅠ活性綜合信息[26]。研究表明，嚴(yán)重干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉面積嚴(yán)重減少，光合色素降解，破壞PSⅡ和PSⅠ反應(yīng)中心，阻礙兩個(gè)光系統(tǒng)間的電子傳遞，從而影響植物生長(zhǎng)[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明干旱脅迫對(duì)玉米葉片的光合機(jī)構(gòu)造成了嚴(yán)重的傷害，PSⅡ受到嚴(yán)重的光抑制，而PSⅠ的供受體側(cè)也受到干旱的傷害；而葉面噴施褪黑素增加了干旱脅迫下玉米葉片的Y(Ⅱ)和Y(Ⅰ)，提高了兩個(gè)光系統(tǒng)的量子利用效率，增強(qiáng)了對(duì)光系統(tǒng)的保護(hù)和修復(fù)。類似的現(xiàn)象在蘋果和獼猴桃中也有報(bào)道[27-28]。本研究還發(fā)現(xiàn)干旱后復(fù)水施用褪黑素的玉米葉片光合速率完全恢復(fù)，表明施用外源褪黑素可以加速葉片光合活性的恢復(fù)。可見(jiàn)，葉面噴施外源褪黑素通過(guò)維持相對(duì)較高的2個(gè)光合光系統(tǒng)活性及其能量分配，從而提高玉米對(duì)干旱脅迫的耐受性。

干旱導(dǎo)致光合作用電子傳遞受阻，引起ROS的過(guò)度積累，造成植物體內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)失衡[29-30]。這種氧化還原失衡反過(guò)來(lái)擾亂植物光系統(tǒng)的功能來(lái)阻礙植物的正常光合作用[31]。在本研究中，玉米葉片MDA和H2O2含量在干旱脅迫下均顯著提高，即使復(fù)水解除了干旱脅迫，它們的含量仍顯著高于對(duì)照，表明干旱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS使膜嚴(yán)重受損。為了減輕這些ROS的危害，植物已經(jīng)進(jìn)化出一個(gè)復(fù)雜的抗氧化酶和非抗氧化酶防御系統(tǒng)[31]。本研究結(jié)果表明，玉米植株能通過(guò)增強(qiáng)自身抗氧化酶活性(SOD、CAT、APX和GR)來(lái)減輕干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫傷害，外源褪黑素處理使受旱玉米葉片抗氧化酶活性得到顯著增強(qiáng)，而葉片中MDA和H2O2含量顯著下降；復(fù)水后外源褪黑素處理玉米葉片的抗氧化酶系統(tǒng)活性以及ROS水平都恢復(fù)到正常范圍，這表明噴施外源褪黑素可以加速提高玉米抗氧化系統(tǒng)的性能，從而維持活性氧的產(chǎn)生和積累之間的平衡，消除干旱誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。此外，不同處理下玉米葉片抗氧化酶相關(guān)基因(SOD4、CAT1、APX2、GR1)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)的抗氧化酶活性(SOD、CAT、APX、GR)的變化相一致，表明外源褪黑素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)編碼這些酶的關(guān)鍵基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)玉米植株葉片抗氧化酶活性，但其分子調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步的系統(tǒng)深入研究。

綜上所述，葉面噴施褪黑素能顯著提高玉米葉片PSⅡ和PSⅠ的光合活性，從而有效緩解干旱脅迫造成的光損傷，同時(shí)也增加了葉片內(nèi)抗氧化酶活性及其相關(guān)基因的表達(dá)，減少ROS的產(chǎn)生，最終緩解氧化脅迫的傷害；而復(fù)水后葉面噴施外源褪黑素改善玉米葉片光合作用效率和抗氧化系統(tǒng)的恢復(fù)能力，促進(jìn)玉米植株生長(zhǎng)，有效適應(yīng)干旱多變環(huán)境。