大花君子蘭大小孢子發(fā)生與雌雄配子體發(fā)育的研究

李芳弟，馬璐璐，申家恒，華 月，王文希，李 偉*

(1 哈爾濱師范大學 生命科學與技術(shù)學院，黑龍江省植物學省級重點實驗室，哈爾濱 150025；2 北京市密云水庫中學，北京 101500)

君子蘭為石蒜科(Amaryllidaceae)君子蘭屬(Clivia)多年生草本植物，原產(chǎn)南非，為著名的溫室觀賞植物[1]，亦可入藥[2-3]。關(guān)于君子蘭生理特性、栽培育種、品種選育等方面已有報道[4-6]，而君子蘭生殖生物學研究較少，僅Barbro[7]和姜闖等[8]對君子蘭花粉粒超微結(jié)構(gòu)進行了描述；Ryczkowski等[9-11]進行了君子蘭胚胎發(fā)育過程的組化研究；唐佩華[12-13]對垂笑君子蘭(Clivianobilis)雄配子體發(fā)育過程中營養(yǎng)核與生殖細胞的動態(tài)及其細胞化學特性進行了研究；申家恒等[14]報道了大花君子蘭花粉貯藏壽命及受精過程。對于君子蘭大小孢子發(fā)生與雌雄配子體發(fā)育過程方面的研究尚未見報道。本研究以大花君子蘭為試材，在顯微水平詳盡描述了大花君子蘭(CliviaminiataRegel)大、小孢子發(fā)生與雌、雄配子體發(fā)育的過程，并記錄了雌、雄配子體發(fā)育的對應關(guān)系，揭示其雜交育種中不易受精、胚珠敗育率高、結(jié)籽率低的原因，為種子發(fā)育和育種提供理論參考，完善君子蘭生殖生物學資料。

1 材料和方法

以大花君子蘭(CliviaminiataRegel)為研究對象，溫室培育，白天室溫為18～22 ℃，夜間為16～18 ℃。2015-2018年，每年12月至翌年3月，取大小不同的花蕾及開花后子房進行分組固定，每組固定10個材料。經(jīng)FAA固定液處理4 h后轉(zhuǎn)入70%酒精內(nèi)，于冰箱-4 ℃冷藏保存。經(jīng)愛氏蘇木精整體染色，常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度8 μm。Nikon Ci L光學顯微鏡下觀察并攝影。

2 結(jié)果與分析

大花君子蘭為傘形花序，頂生。每個花序具10～40朵小花，兩性花，每朵小花6枚雄蕊，1枚雌蕊?；ㄐ虻拈_花順序為頂端先開，兩側(cè)對開[15]。開花時，雌蕊伸出花瓣之外，比花藥高，防止自花授粉。開花第2天，花藥開裂，散出花粉，雌蕊柱頭出現(xiàn)分泌物，但雌蕊胚珠發(fā)育不同步。

2.1 小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

2.1.1 小孢子發(fā)生大花君子蘭每朵小花具6枚雄蕊，每枚雄蕊具4個藥室。從雄蕊原基橫切面上看，4個角隅處分化出單個孢原細胞，孢原細胞平周分裂形成初生壁細胞與初生造孢細胞。初生造孢細胞經(jīng)多次有絲分裂產(chǎn)生次生造孢細胞，次生造孢細胞進一步發(fā)育為小孢子母細胞。小孢子母細胞時期，花藥壁分化完成，自外向內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層，絨氈層為分泌型。從花藥的橫切面上顯示，每個小孢子囊內(nèi)小孢子母細胞緊密排列，呈多邊形，細胞體積較大，細胞質(zhì)濃厚，細胞核明顯，核仁與染色質(zhì)呈染色深的圓球體，易于與花藥壁細胞區(qū)分(圖版Ⅰ，1)。

隨著發(fā)育進行，小孢子母細胞由多邊形變成球形，并被胼胝質(zhì)壁包裹，進入減數(shù)分裂期。小孢子母細胞減數(shù)分裂過程與大多數(shù)被子植物相似，經(jīng)歷減數(shù)分裂前期Ⅰ的細線期(圖版Ⅰ，2)、偶線期(圖版Ⅰ，3)、粗線期(圖版Ⅰ，4)、雙線期(圖版Ⅰ，5)、終變期(圖版Ⅰ，6)、中期Ⅰ(圖版Ⅰ，7)、后期Ⅰ(圖版Ⅰ，8)、末期Ⅰ(圖版Ⅰ，9)，具明顯的成膜體及細胞板，形成典型二分體(圖版Ⅰ，10)。隨后，經(jīng)減數(shù)第二次分裂前期Ⅱ(圖版Ⅰ，10)、中期Ⅱ(圖版Ⅰ，11)、后期Ⅱ(圖版Ⅰ，12)、末期Ⅱ(圖版Ⅰ，13)，形成四分體(圖版Ⅰ，14)。可見，大花君子蘭小孢子母細胞的胞質(zhì)分裂為連續(xù)型，產(chǎn)生的四分體為左右對稱型(圖版Ⅰ，14)。同一藥室的小孢子母細胞減數(shù)分裂趨于同步，不同藥室之間存在2-3個時相差異。小孢子母細胞減數(shù)分裂過程始終被胼胝質(zhì)壁包圍，因而，所形成的小孢子四分體亦被胼胝質(zhì)壁包裹。待四分體胼胝質(zhì)壁被胼胝質(zhì)酶水解之后，小孢子被釋放至藥室內(nèi)，至此單核小孢子形成(圖版Ⅰ，15)。

2.1.2 雄配子體發(fā)育單核小孢子為雄配子體的第1個細胞。剛釋放的單核小孢子呈橢球狀，細胞核較大，位于細胞中央，細胞質(zhì)濃厚，液泡尚不明顯，花粉壁尚未加厚(圖版Ⅰ，15、16)。隨著液泡化進行，單核小孢子內(nèi)形成大液泡，細胞形態(tài)變得不規(guī)則，并將細胞核擠向花粉壁一側(cè)，進入單核靠邊期(圖版Ⅰ，17)。隨即，小孢子核在靠近花粉壁的位置進行不均等的有絲分裂，經(jīng)過前期(圖版Ⅰ，17)、中期(圖版Ⅰ，18)、后期(圖版Ⅰ，19)、末期(圖版Ⅰ，20)，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞，即二細胞花粉(圖版Ⅰ，21)。

二細胞花粉的營養(yǎng)細胞較大，占據(jù)花粉大部分體積，核呈球形，核仁顯著；生殖細胞較小，球形，具較為明顯的胞質(zhì)鞘，染色質(zhì)凝集(圖版Ⅰ，21)。初期，花粉形態(tài)仍不規(guī)則，但細胞質(zhì)逐漸增加，體積逐漸增大，液泡明顯減小至不可見，花粉壁逐漸加厚(圖版Ⅰ，21-23)。至花粉成熟，營養(yǎng)細胞內(nèi)充滿了貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)細胞核由球形變?yōu)椴灰?guī)則的裂瓣狀；而生殖細胞由球形縱向延長，呈長橢球形(圖版Ⅰ，24、25)。以上結(jié)果表明，大花君子蘭的成熟花粉為二細胞型，具2個萌發(fā)孔。

圖版Ⅰ 小孢子發(fā)生與雄配子體的發(fā)育1.小孢子母細胞；2.小孢子母細胞減數(shù)分裂前期Ⅰ細線期；3.偶線期；4.粗線期；5.雙線期；6.終變期；7.中期Ⅰ；8.后期 Ⅰ；9.末期 Ⅰ；10.二分體前期 Ⅱ；11.中期 Ⅱ；12.后期 Ⅱ；13.末期 Ⅱ；14.左右對稱型四分體；15、16.單核小孢子；17.單核靠邊期，有絲分裂前期；18.單核小孢子有絲分裂中期；19.單核小孢子有絲分裂后期；20.單核小孢子有絲分裂末期；21-23.二細胞花粉早期(箭頭示胞質(zhì)鞘)；24-25.成熟的二細胞花粉(箭頭示長橢形生殖細胞)(圖1, ×125倍；圖2-25, ×500倍)PlateⅠ Microsporogenesis and the development of male gametophytesFig.1. Microspore mother cell; Fig.2. The microspore mother cell is in leptonema of prophase Ⅰ of meiosis of the first division; Fig.3. Zygonema; Fig.4. Pachynema; Fig.5. Diplonema; Fig.6. Diakinesis; Fig.7. Metaphase Ⅰ; Fig.8. Anaphase Ⅰ; Fig.9. Telephase Ⅰ; Fig.10. Prophase Ⅱ of dyad; Fig.11. Metaphase Ⅱ; Fig.12. Anaphase Ⅱ; Fig.13. Telephase Ⅱ; Fig.14. Isobilateral tetrad; Fig.15-16. Monokarytic microspore; Fig.17. Mononuclear pollen edging phase and in prophase of mitosis; Fig.18. Mononuclear pollen in metaphase of mitosis; Fig.19.Mononuclear pollen in anaphase of mitosis; Fig.20. Mononuclear pollen in telephase of mitosis; Fig.21-23. Early two-celled gametophyte (plasmic envelope is showed by arrows); Fig.24-25. Mature gametophyte(Long ellipsoid germ cell is showed by arrows). (Fig.1, ×125; Fig.2-25, ×500)

2.2 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育

大花君子蘭為3室子房，中軸胎座，每室2列胚珠，每列3至4枚胚珠，胚珠倒生，雙珠被，厚珠心，雌配子體發(fā)育類型為蓼型。

2.2.1 大孢子發(fā)生孢原細胞位于珠心表皮下方，與周圍珠心細胞相比，其細胞體積大，細胞質(zhì)濃厚，細胞核明顯(圖版Ⅱ，1)。孢原細胞經(jīng)平周分裂產(chǎn)生周緣細胞和造孢細胞。造孢細胞進一步發(fā)育為大孢子母細胞(圖版Ⅱ，2)，大孢子母細胞與珠心表皮細胞之間有細胞間隔，故大花君子蘭為厚珠心。

大孢子母細胞縱向伸長，隨即進入減數(shù)分裂期。與小孢子母細胞的減數(shù)分裂進程相似，大孢子減數(shù)第一次分裂前期Ⅰ經(jīng)歷時間較長。細線期細胞核內(nèi)的染色質(zhì)凝聚成花束狀，圍繞核仁周圍(圖版Ⅱ，3)；經(jīng)偶線期(圖版Ⅱ，4)、粗線期(圖版Ⅱ，5)、雙線期(圖版Ⅱ，6)、終變期(圖版Ⅱ，7)，染色體縮短變粗，并逐漸沿核膜排列。經(jīng)中期Ⅰ(圖版Ⅱ，8)、后期Ⅰ形成二分體(圖版Ⅱ，9)；經(jīng)減數(shù)第二次分裂形成四分體?？拷榭锥说?個大孢子退化，合點端的大孢子發(fā)育為功能大孢子(圖版Ⅱ，10)。

2.2.2 雌配子體發(fā)育功能大孢子為雌配子體的第1個細胞，隨液泡化進行，其細胞體積不斷增大，進而發(fā)育為單核胚囊(圖版Ⅱ，11)；單核胚囊經(jīng)有絲分裂形成二核胚囊(圖版Ⅱ，12)，其兩核分別位于胚囊的珠孔端和合點端，中央為大液泡所隔；二核胚囊經(jīng)有絲分裂形成四核胚囊(圖版Ⅱ，13)，胚囊的中央被大液泡占據(jù)；四核胚囊經(jīng)有絲分裂形成八核胚囊，此時期非常短暫，很快便細胞化，發(fā)育為成熟胚囊(圖版Ⅱ，14)。

胚囊珠孔端為卵器，卵細胞與兩助細胞呈“品”字形排列(圖版Ⅱ，15)。卵細胞呈洋梨形，高度液泡化，細胞核大并位于合點端，細胞極性明顯(圖版Ⅱ，16)。2個助細胞在分化早期呈楔形，胞質(zhì)濃厚，細胞內(nèi)看不到液泡，絲狀器發(fā)達，染色深(圖版Ⅱ，17)；隨后，助細胞逐漸液泡化(圖版Ⅱ，18、19)，并向胚囊內(nèi)延伸(圖版Ⅱ，20)，胞質(zhì)及絲狀器均變淺。中央細胞體積大，兩極核或次生核位于合點端，靠近反足細胞(圖版Ⅱ，21-24)。卵器與次生核之間為大液泡所隔，中央細胞的細胞質(zhì)沿胚囊壁分布，聯(lián)系卵器與次生核。3個反足細胞在成熟胚囊時期呈退化狀態(tài)(圖版Ⅱ，24)。在胚囊下方、合點端上方具承珠盤，由一群形態(tài)不規(guī)則、體積小、胞質(zhì)少且細胞壁厚的珠心細胞堆疊而成(圖版Ⅱ，25)。可見，大花君子蘭的雌配子體發(fā)育類型為單孢型中的蓼型，具承珠盤結(jié)構(gòu)。

圖版Ⅱ 大孢子發(fā)生與雌配子體的發(fā)育1.孢原細胞；2.大孢子母細胞；3.大孢子母細胞減數(shù)分裂前期Ⅰ細線期；4.偶線期；5.粗線期；6.雙線期；7.終變期；8.中期 Ⅰ；9.二分體；10.功能大孢子；11.單核胚囊；12.二核胚囊；13.四核胚囊；14.成熟胚囊；15.卵器；16.卵細胞；17.助細胞早期，箭頭示絲狀器；18.兩個助細胞，呈楔形(箭頭示絲狀器)；19-20.助細胞液泡化，絲狀器欠發(fā)達；21.中央細胞，兩個極核靠近反足細胞；22-23.兩個極核融合；24.次生核和反足細胞；25.承珠盤。(圖14, ×125倍；圖1-13、15-25, ×500倍)Plate Ⅱ Megaspore genesis and development of female gametophytesFig.1. Archesportial cell; Fig.2. Megaspore mother cell; Fig.3. Megasporocyte mother cell is in leptonema of prophase Ⅰ of meiosis; Fig.4. Zygonema; Fig.5. Pachynema; Fig.6. Diplonema; Fig.7. Diakinesis; Fig.8. Metaphase Ⅰ; Fig.9. Dyad; Fig.10. Functional megaspore; Fig.11. Mononuclear embryo sac; Fig.12. Two-nucleate embryo sac; Fig.13. Four-nucleate embryo sac; Fig.14. Mature embryo sac; Fig.15. Egg apparatus; Fig.16. Egg cell; Fig.17. The early synergid with filiform apparatus is shown by arrows; Fig.18. Two synergids are wedge (filiform apparatus is shown by arrows); Fig.19-20. Synergid vacuolization, filiform apparatus underdeveloped; Fig.21. Central cell and two polar nuclei near the antipodal cells; Fig.22-23. Two polar nucleus fuse; Fig.24. Secondary nucleus and antipodal cell; Fig.25. Hypostase.(Fig.14, ×125; Figs.1-13, Figs.15-25, ×500)

2.3 花蕾大小與雌雄配子體發(fā)育的相關(guān)性

大花君子蘭雄蕊發(fā)育趨于同步，且雄蕊發(fā)育快于雌蕊。開花散粉時，雄蕊已發(fā)育為成熟的二細胞型花粉，而雌配子體尚處于四核、八核胚囊時期，發(fā)育不同步。具體對應關(guān)系見表1。

表1 花蕾長度與雌雄配子體發(fā)育的關(guān)系

3 討 論

大花君子蘭的胚胎學特征基本符合石蒜科胚胎學特征[16]。值得注意的是，大花君子蘭成熟胚囊的合點端具承珠盤結(jié)構(gòu)，這在石蒜科其他植物中未見報道[17-19]。

3.1 承珠盤的結(jié)構(gòu)與功能

目前，已在多種被子植物中發(fā)現(xiàn)了承珠盤結(jié)構(gòu)[20-21]。本研究中，大花君子蘭成熟胚囊下方與合點維管束之間多層厚壁細胞突向胚囊，形成明顯的承珠盤結(jié)構(gòu)，與胡適宜[22]報道的承珠盤典型特征一致，卻與綠豆中[23]描述的由薄壁細胞組成承珠盤結(jié)構(gòu)不同。

大花君子蘭成熟胚囊時期，胚囊較大，近球形，而承珠盤在胚囊的基部形成了一個堅實的屏障，可以防止胚囊過度擴大，這與寧夏枸杞[24]等植物中承珠盤的功能一致。另外，大花君子蘭承珠盤位于合點端維管束的上方，其基部1～3層珠心細胞呈退化狀態(tài)，明顯區(qū)別于其他珠心細胞，推測承珠盤具向胚囊轉(zhuǎn)輸水分及營養(yǎng)物質(zhì)的功能，而這與綠豆[23]中描述的承珠盤功能相似。

3.2 絲狀器的結(jié)構(gòu)與功能

其他石蒜科植物(水仙、蔥蘭等)的胚胎學研究中，均未報道絲狀器結(jié)構(gòu)[17-19]。而本研究發(fā)現(xiàn)大花君子蘭胚囊成熟時期，助細胞珠孔端存在明顯的絲狀器，其形態(tài)與棉屬植物[22]類似。大花君子蘭中剛分化的助細胞絲狀器發(fā)達，成熟胚囊時期，絲狀器逐漸欠發(fā)達，這與申家恒等[14]的描述一致。推測其原因在于大花君子蘭成熟胚囊時期已形成承珠盤，司營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)輸功能，進而分擔了助細胞絲狀器營養(yǎng)轉(zhuǎn)輸壓力。這與寧夏枸杞[24]中助細胞分化初期沒有絲狀器，在液泡化后才形成絲狀器不同。

大花君子蘭的花柱長50 mm，花粉管在花柱中行走大約26 h才到達子房腔，花粉管在子房內(nèi)大約經(jīng)歷12 h后才進入助細胞[14]?；ǚ酃苤阅軠蚀_到達助細胞，推測與助細胞通過絲狀器分泌向化性物質(zhì)有關(guān)。

3.3 君子蘭的敗育

君子蘭雜交育種過程中發(fā)現(xiàn)其存在不易受精、胚珠敗育率高、結(jié)籽率低的現(xiàn)象[14]。本研究從雌雄配子體發(fā)育角度揭示其原因如下：其一，大花君子蘭雄蕊發(fā)育快于雌蕊，這與二倍體芒(DiploidMiscanthussinensis)[25]相似。且大花君子蘭雌配子體發(fā)育不同步，開花散粉時，雌配子體的發(fā)育尚停留在四核以及八核胚囊時期，直至開花第2天，才發(fā)育至成熟胚囊階段，具可授性；其二，大花君子蘭成熟胚囊呈近球形，囊腔極大，且中央細胞極核、次生核始終位于合點端反足細胞附近，導致受精困難；其三，大花君子蘭存在花粉空癟、內(nèi)容物缺失，即花粉敗育的現(xiàn)象，這與姜闖等[8]的研究相同，與新小竹(Neomicrocalamusprainii)[26]藥室中無花粉、藥室收縮變形的敗育現(xiàn)象不同。鑒于此，為提高其繁育率，提出以下建議：1) 在開花第二天即成熟胚囊階段進行授粉；2) 增大授粉量或授粉頻次；3) 選擇可育花粉進行授粉。