Mex-3 RNA結合蛋白在腫瘤中的研究進展*

羅 祥，黃雯琪,2 綜述，謝立蘭△ 審校

(1.武漢生物工程學院應用生物技術研究中心 430415；2.西北大學食品科學與工程學院天然多糖資源利用工程研究中心，西安 710069)

Mex-3家族蛋白是一類結構高度保守的RNA結合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)[1]。早期，在有關秀麗桿線蟲的發(fā)育研究中首次鑒定了Mex-3基因，該基因編碼的Mex-3蛋白是一種翻譯抑制因子。線蟲體內只有一種Mex-3蛋白，其功能是調節(jié)早期胚胎發(fā)育過程中的卵裂球特性和成蟲的生殖全能性[2]。在線蟲胚胎發(fā)育過程中胚胎的兩個卵裂球分離，前卵裂球(anterior blastomere,AB)不會分化產生體壁肌肉，而后卵裂球(posterior blastomere,P1)則會分化產生體壁肌肉[3]。線蟲Mex-3基因的突變會導致線蟲的胚胎錯誤地在前卵裂球中分化產生體壁肌肉，使胚胎死于囊胚期，因此得名Mex，意思是“肌肉過?！?muscle excess)，這在一定程度上是由于Mex-3蛋白對發(fā)育關鍵蛋白PAL-1和ROS-2翻譯時的調控作用所決定的[1,4]。

在隨后的研究工作中，發(fā)現了與線蟲Mex-3基因同源的人Mex-3(human MEX-3,hMex-3)家族[3]。隨著研究的不斷深入，有更多研究表明進化保守的Mex-3家族參與了不同的生理和病理過程，包括上皮內穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育、新陳代謝、免疫反應和疾病，但這些作用的具體機制還需要更進一步研究探討[5]。另外，hMex-3家族成員蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療也密切相關。本文對Mex-3家族蛋白的結構和定位進行了介紹，并詳細總結了hMex-3與腫瘤相關的進展，以期為進一步的蛋白功能研究和腫瘤治療潛在靶點篩選提供參考。

表1 hMex-3 RNA結合蛋白家族在腫瘤中的研究進展

1 Mex3家族蛋白的分子結構

2007年BUCHET-POYAU等[3]的研究工作鑒定了與線蟲Mex-3基因同源的hMex-3基因家族，它們包括4個同源基因，即hMex-3A，hMex-3B，hMex-3C和hMex-3D。這4個基因分別位于不同的染色體上(人類第1、15、18和19號染色體基因上)，4個hMex-3基因均由2個外顯子和1個內含子組成，其mRNA片段大小從hMex-3A的6 591 bp(GenBank access：NM_001093725.2)到hMex-3D的2 927 bp(GenBank access：NM_001174118)不等。hMex-3A、hMex-3B、hMex-3C、hMex-3D蛋白都包含著兩個串聯的異質核糖核蛋白K同源(KH)結構域(1個由65～70個氨基酸組成的保守區(qū)[6])和一個羧基末端的環(huán)指(RING)結構域。hMex-3是結合RNA的E3泛素連接酶，通過其KH結構域與RNA結合，并通過依賴染色體維持蛋白1(CRM1)的輸出途徑在細胞核和細胞質之間穿梭，其RING結構域則可介導E3泛素連接酶的活性[5]。此外，以線蟲Mex-3蛋白為模型，通過體外SELEX篩選和生物化學實驗確定了Mex-3蛋白識別的一致性序列(MRE)：(A/G/U)(G/U) AGN (0～8) U (U/A/C) UA，該MRE由兩個經0～8個核苷酸隔開的四核苷酸基序組成。這兩個四核苷酸基序半位點分別被Mex-3的KH1和KH2所識別，但這兩個KH結構域與兩個四核苷酸基序半位點之間的識別模式的結構還尚不清楚。hMex-3蛋白與線蟲Mex-3蛋白在RNA結合域內呈現79%～81%的序列同源性[4]，且該MRE包含hMex-3D/TINO RNA結合所需的富含AU的半位點，表明hMex-3蛋白與RNA結合的特異性類似于它們的線蟲同源物Mex-3[7]。

2 組織差異表達與定位

為研究hMex-3基因的表達模式，BUCHET-POYAU等[3]利用4種hMex-3基因的特異性引物對8種不同的人源細胞系和20種組織進行RT-PCR分析，發(fā)現hMex-3D mRNA在所有受試人源細胞系和組織中均呈較高的表達水平，而其他3個hMex-3基因在不同組織中的表達水平表現出異質性[3]。其中hMex-3A、hMex-3B、hMex-3C的表達水平在胎腦和睪丸中最高，在胸腺、唾液腺和子宮中次之，腸道中則相對較弱[3]。

BUCHET-POYAU等[3]通過間接免疫熒光實驗檢測hMex-3蛋白在細胞內的定位，發(fā)現hMex-3A、hMex-3B、hMex-3C蛋白主要在細胞質聚集，其中hMex-3A、hMex-3B在細胞質中呈點狀分布，而hMex-3C則在細胞質中呈均勻分布。hMex-3蛋白的N末端存在著一個潛在的NES基序[3]，在利用LMB(CRM1介導的含NES蛋白核輸出的特異性抑制劑[8])處理細胞后發(fā)現hMex-3蛋白會在核內大量聚集，提示它們可能通過CRM1輸出途徑在細胞核和細胞質之間穿梭。為了證實這一結果，在hMex-3C的NES基序中引入了兩個保守殘基的點突變，將突變后的hMex-3C (hMex-3C/NES)瞬時轉染細胞后在細胞核中檢測到了hMex-3C/NES，表明hMex-3蛋白是依賴于hMex-3蛋白N端NES序列的核質穿梭蛋白，其主要是通過NES基序和CRM1/Exportin 1機制在細胞質和細胞核之間進行穿梭[3]。此外，該研究還發(fā)現hMex-3A和hMex-3B與DCP1脫帽因子和Ago1蛋白一起共定位于P小體(processing bodies，PBs)中，表明hMex-3A和hMex-3B可能是P小體的組成部分，參與RNA的轉運分選[3]。另外，COURCHET等[9]發(fā)現hMex-3B與14-3-3蛋白發(fā)生特異性結合，而14-3-3蛋白和hMex-3B的特異性結合則進一步控制了hMex-3B在PBs和應激顆粒(stress granules，SG)之間的分選，決定hMex-3B的細胞內定位。

3 Mex-3蛋白與腫瘤

3.1 Mex-3A蛋白與腫瘤

Mex-3A是一種促進癌細胞增殖、侵襲、遷移和存活的RNA結合蛋白，研究表明Mex-3A在上皮性卵巢癌(EOC)、胰腺導管腺癌(PDA)和肝癌組織中表達上調，且隨著組織學分級的升高而增加。Mex-3A基因在EOC細胞中的高表達與患者臨床分期和淋巴結轉移密切相關[10]。在PDA細胞中，敲低Mex-3A基因的表達可以調節(jié)凋亡相關因子從而促進細胞凋亡，并通過影響EMT抑制細胞遷移，進而抑制PDA細胞的生長[11]。在肝癌細胞中，敲低Mex-3A基因會顯著抑制肝癌細胞的增殖、克隆、遷移和侵襲等生物學功能[12-13]。房超等[14-15]、陳云云等[16]通過RNA干擾敲低了膀胱癌細胞中Mex-3A基因的表達并檢測其對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現Mex-3A基因可以促進膀胱癌細胞的增殖，并抑制其凋亡，且Mex-3A蛋白在膀胱癌組織中呈現高水平的表達[14-16]。JIANG等[17]發(fā)現胃癌組織中Mex-3A蛋白表達高于癌旁組織，并分析了敲低SNU-16、AGS和BCG-823這3種人胃癌組織細胞中Mex-3A基因的表達對腫瘤組織增殖、遷移的影響，結果顯示，敲低Mex-3A后的SNU-16和AGS細胞相較于對照組細胞增殖變緩，而BCG-823與對照組無明顯差異，推測Mex-3A對細胞增殖的影響取決于細胞類型。流式細胞術檢測結果進一步顯示敲低Mex-3A基因所引起的SNU-16細胞的細胞周期阻滯是導致細胞增殖變緩的主要原因。此外，敲低Mex-3A基因還降低了胃癌細胞SNU-16和AGS在軟瓊脂中的集落形成能力，抑制BCG-823細胞的遷移，這些結果表明Mex-3A蛋白的表達是細胞轉化和遷移所必需的[17]。

Mex-3A蛋白還可以通過影響其他細胞因子，促進腫瘤細胞生長。同源域轉錄因子(CDX2)在腸道細胞的正常發(fā)育和腫瘤發(fā)生中扮演著重要作用[18]，研究發(fā)現在人胃癌細胞中Mex-3A基因的過表達可使CDX2表達下調。進一步研究顯示Mex-3A蛋白主要是通過與CDX2 mRNA 3′非編碼區(qū)的一個典型MRE結合，進而損害腸道分化和細胞極化，影響細胞周期進程，并促進腸道干細胞標記物富含亮氨酸重復單位的G蛋白偶聯受體5(LGR5)、B細胞特色性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點-1(MMI1)和Musashi RNA結合蛋白1(MSI1)的表達[19]。RIG-I作為細胞內重要的PRR(模式識別受體)，參與了抗病毒免疫應答和干擾素的產生[20]，在包括多形膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GB，中樞神經系統最常見的惡性原發(fā)腫瘤[21])等多種類型腫瘤中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[22]。在GB中Mex-3A蛋白的表達水平顯著高于正常腦組織，Mex-3A蛋白可以與模式識別受體RIG-I相互識別并結合，破壞其蛋白質的穩(wěn)定性，誘導RIG-1泛素化。Mex-3A蛋白基因缺失使RIG-I蛋白水平上調而使GB細胞增殖受損，從而抑制GB細胞的生長。此外，該研究還顯示，Mex-3C蛋白在GB細胞中表達水平上調，Mex-3A、Mex-3C蛋白共表達抵消了Mex-3C蛋白對于RIG-I泛素化的激活作用。Mex-3C與RIG-I共定位于病毒感染細胞的應激顆粒中，過表達Mex-3C蛋白介導RIG-I賴氨酸-63連接的泛素化激活β干擾素啟動子，在誘導抗病毒免疫反應中起關鍵作用[21]。

3.2 Mex-3B蛋白與腫瘤

目前關于RNA結合蛋白Mex-3B的研究主要集中在免疫應答和腫瘤中的作用。研究顯示Mex-3B蛋白作為TLR3的輔助受體參與抗病毒天然免疫應答，誘導Ⅰ型干擾素的產生，下調Mex-3B基因的表達水平則可以抑制TLR3的活性[23-24]。在癌癥研究中，Mex-3B蛋白通過對其他因子的作用參與細胞免疫，進而對腫瘤產生影響[25-28]。

HUANG等[25]研究發(fā)現RNA結合蛋白Mex-3B下調人類白細胞抗原(HLA-A)的表達是腫瘤細胞逃避免疫系統攻擊的一種新機制。過表達Mex-3B基因會降低黑素瘤細胞對自體腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)殺傷的敏感性。對抗PD-1治療的黑色素瘤患者腫瘤樣本的進一步分析表明，Mex-3B蛋白的過表達與對PD-1阻斷的耐藥性有關。Mex-3B蛋白通過與HLA-A的3′-UTR結合，破壞HLA-A mRNA的穩(wěn)定性，從而下調腫瘤細胞表面HLA-A的表達，使腫瘤細胞無法被T細胞識別和殺死，表明Mex-3B蛋白介導了對腫瘤免疫治療的抵抗[25-26]。Runx3是胃癌中起抑癌作用的重要轉錄因子，而Mex-3B蛋白是一種參與HOX轉錄反義RNA(HOTAIR)誘導的Runx3降解的E3連接酶，Mex-3B蛋白的表達使得Runx3表達下降，從而使得胃癌發(fā)生概率上升，通過沉默Mex-3B蛋白的表達可減輕Runx3的降解，顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[27]。有關RNA解旋酶DEAD-BOXRNA解旋酶(DDX5)與Zeste基因抑制子12(SUZ12)在多種腫瘤中高表達并對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用)的研究發(fā)現，Mex-3B基因過表達降低了SUZ12的蛋白水平，而DDX5可以拮抗Mex-3B基因對SUZ12蛋白水平的影響[28]。

3.3 Mex-3C蛋白與腫瘤

Mex-3C蛋白又稱RKHD2蛋白，在免疫應答、RNA分子轉移、翻譯抑制和能量平衡等生物學活動中發(fā)揮著不同作用[29-30]并被鑒定為癌癥中染色體不穩(wěn)定的抑制因子[6]。Mex-3C已被鑒定為癌癥中染色體不穩(wěn)定的抑制因子[6]。CHAO等[31]發(fā)現Mex-3C蛋白在膀胱癌組織和細胞中高表達，其表達與臨床病理特征，尤其是侵襲性表型呈正相關。膀胱癌細胞中過表達Mex-3C蛋白可以促進脂滴積累、腫瘤細胞黏附、侵襲和遷移。進一步的機制研究表明，Mex-3C蛋白可通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路和上調JNK下游甾醇調節(jié)元件結合蛋白-1(SREBP1)、脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰輔酶A羧化酶-1(ACC1)的水平來調節(jié)脂質代謝并促進腫瘤發(fā)展。Mex-3C的表達與SERBP1、ACC1、FASN蛋白呈正相關，3種蛋白在Mex-3C蛋白高表達的浸潤性BC組織中表達上調。此外，有研究證實在篩選和結腸癌相關的miR-451a靶點時，通過miR-Trap實驗發(fā)現4個靶mRNA在RNA誘導沉默復合體(RISC)處富集，鑒定出包括Mex-3C在內的4個基因的mRNA上的miR-451a結合位點。但由于Mex-3C蛋白在患者樣本中的表達水平較低，以及其miR-Trap試驗和后面qRT-PCR之間的不一致性而未選擇Mex-3C蛋白進行后續(xù)研究[32]。

3.4 Mex-3D蛋白與腫瘤

目前有關Mex-3D的研究相對較少。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，Bcl-2 mRNA的非翻譯區(qū)包含一個ARE，能與其他基因的mRNA元件相互作用。GESUALDO等[33]的研究表明Mex-3D蛋白能與Bcl-2結合，破壞含有Bcl-2 ARE序列的嵌合結構的穩(wěn)定性，在轉錄后水平上對Bcl-2基因表達呈現負調控。此外，Mex-3D基因與Fos/Jun之間存在明顯的相互作用，敲低Mex-3D基因會顯著增加Fos和Jun mRNA的表達水平[34]。

4 展 望

近年來，RNA在生命系統中的重要性備受關注。作為RNA結合蛋白中的一員，Mex-3家族蛋白的作用和生物學功能的研究逐漸深入。總的來講，Mex-3家族蛋白是機體維持正常生長發(fā)育所需的重要蛋白質，參與RNA代謝、胚胎發(fā)育和能量代謝等多種生物學過程[5]。同時，Mex-3家族蛋白的表達與臨床上很多腫瘤的發(fā)生和預后密切相關。例如：hMex-3A家族在許多腫瘤組織細胞表達顯著高于癌旁正常組織，且與腫瘤組織學分級相關[10-11]；干擾hMex-3A家族的表達則顯著抑制了多種腫瘤細胞的增殖和遷移能力，并調節(jié)凋亡相關因子促進細胞凋亡[12-16]；Mex-3B家族的表達能影響其他抑癌分子的穩(wěn)定性，敲低Mex-3B家族的表達水平亦能顯著抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[25-28]；Mex-3C通過MAPK/JNK端激酶信號通路調節(jié)脂質代謝，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展等[6,31-32]。因此，Mex-3家族蛋白有望成為腫瘤診治新的生物學標志物和潛在的新靶點。當然，Mex-3家族蛋白的研究仍有很多問題需要進一步研究。首先，目前關于Mex-3D蛋白在腫瘤等相關生物學過程中的作用研究較少，該蛋白是否也能影響RIG-I的穩(wěn)定性，并介導腫瘤的遷移增殖等需要進一步探究[33-34]。其次，因腫瘤的發(fā)生和發(fā)展由極其復雜的調控網絡介導，Mex-3家族成員在腫瘤中的詳細作用機制仍需要大量的研究加以證明。另外，最新研究表明Mex-3B蛋白在炎性反應中也發(fā)揮重要作用[35]，Mex-3家族蛋白在其他生物學過程中的作用及其機制值得進一步探索。