瑤醫(yī)九龍十八癥湯對(duì)胃潰瘍熱證大鼠胃黏膜損傷及相關(guān)因子的影響*

包富龍 鄧晶晶 閆國(guó)躍，2 王文博 曾詩(shī)睿 李 梅 李 彤，2△

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西壯瑤醫(yī)藥與醫(yī)養(yǎng)結(jié)合人才小高地，廣西 南寧 530001）

九龍十八癥湯是廣西民間治療胃潰瘍、急慢性胃炎、胃痛的經(jīng)驗(yàn)方，由九龍盤(pán)、十八癥、田皂角、山菠蘿、白狗腸、一點(diǎn)紅、香附、陳皮、厚樸、野蕎麥、佛手組成。本方臨床運(yùn)用效果較為理想，收錄于《瑤醫(yī)臨床驗(yàn)方集》［1］。本課題組通過(guò)構(gòu)建大鼠胃潰瘍熱證模型，探討九龍十八癥湯治療胃潰瘍熱證的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014］。飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，保持室內(nèi)光照明暗各12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑 九龍十八癥湯組方藥物購(gòu)買(mǎi)于南寧市水街藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥資源所黃云峰副研究員鑒定。水提取物稠膏的制備：取組方10劑藥量按1∶10的比例加蒸餾水，浸泡30 min后，武火加熱煮沸后文火微沸1 h，倒出所得湯劑，藥渣同法煎煮2次，合并濾液，水浴濃縮成稠膏狀提取物，生藥質(zhì)量濃度為3.2 g/g，放于4℃冰箱保存，使用時(shí)用蒸餾水配制到相應(yīng)濃度。干姜水煎劑的制備：干姜500 g加蒸餾水2 000 mL，武火加熱煮沸后微沸煎煮，濃縮至500 mL，即生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20170812）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)：141115）；左金丸（湖北香連藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z42020884）。6-keto-PGF1α、血栓素 B2（TXB2）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 1510酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific Oy美國(guó)賽默飛；TDL-5-A低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DM18光學(xué)顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；游標(biāo)卡尺，中國(guó)上海三圈牌。

1.4 分組與造模 參考文獻(xiàn)［2-4］，將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、左金丸組（陽(yáng)性藥組）、九龍十八癥湯高劑量組（高劑量組）、九龍十八癥湯中劑量組（中劑量組）、九龍十八癥湯低劑量組（低劑量組），每組10只，雌雄各半。除空白組外，各組大鼠每日用干姜水煎液灌胃2次，每次5 mL/kg體質(zhì)量，連續(xù)14 d，兩次間隔時(shí)間4 h。于造模第11天起，每日第1次干姜水灌胃后禁食不禁水，第2次干姜水灌胃后4 h給予15%醋酸1 mL灌胃1次，恢復(fù)進(jìn)食。連續(xù)4 d?？瞻捉M予等量的蒸餾水灌胃。模型組死亡1只，其余組大鼠全部存活。模型的驗(yàn)證：造模結(jié)束后從各組大鼠中隨機(jī)抽1只，禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉后處死摘取整個(gè)胃組織，肉眼觀察胃黏膜潰瘍情況，剪胃潰瘍部位制作HE染色切片后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下檢查。大鼠胃潰瘍熱證模型的評(píng)定指標(biāo)如下。1）體征指標(biāo)［5］：主癥為口渴多飲、舌紅，次癥為消谷善饑、牙齦紅腫、糞便干結(jié)、小便量少色黃、亢奮、鼻唇爪趾耳郭發(fā)紅。2）胃部解剖學(xué)和組織學(xué)檢查［6-7］：胃黏膜可見(jiàn)明顯火山口樣潰瘍，胃黏膜彌漫性充血，黏膜表面黏液細(xì)胞分泌減少，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，胃主細(xì)胞減少。滿足以上的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，即可認(rèn)為大鼠胃潰瘍熱證模型復(fù)制成功。

1.5 給藥方法［8］造模成功后次日，各組給予相應(yīng)藥物灌胃，九龍十八癥湯按體表面積法換算成大鼠的等效劑量，10.75 g/kg作為中劑量組，高劑量為21.50 g/kg，低劑量為5.37 g/kg，左金丸組為1 g/kg?？瞻捉M、模型組予等量蒸餾水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2檢測(cè)。末次給藥后，把各組大鼠轉(zhuǎn)移至代謝籠，搜集糞便和尿液（24 h代謝量）。水合氯醛麻醉后開(kāi)腹，主動(dòng)脈采血約4～5 mL置于不加抗凝劑的試管內(nèi)，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液分裝入1.5 mL EP管中，放置到-20℃冰箱中保存，用ELISA法檢測(cè)免疫指標(biāo)。2）黏膜病變和潰瘍指標(biāo)測(cè)定。采血后立即解剖大鼠，充分暴露胃體，肉眼觀察腹腔及胃體病變情況，與周?chē)M織或臟器粘連及粘連的程度，記錄并拍照。觀察各組大鼠胃壁損傷、胃黏膜充血情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)定潰瘍中心，量取最大橫徑（d2）和縱徑（d1），潰瘍指數(shù)（S）［9］按以下公式計(jì)算：S=π·d1/2·d2/2（注：π取3.14）。潰瘍抑制率=（模型組平均潰瘍指數(shù)-給藥組平均潰瘍指數(shù)）/模型組平均潰瘍指數(shù)×100%。3）胃黏膜病理組織HE染色。切取胃部置于預(yù)冷的PBS中漂洗干凈表面血漬，吸干水分后剪取部分胃組織用10%多聚甲醛溶液固定24 h，行石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間兩兩比較用單因素方差分析，方差齊用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhane′s T2法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃組織肉眼觀察情況 空白組：胃組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜呈淡紅色，表面光滑，并覆蓋有較多黏液，皺襞表面光滑，走向有規(guī)則，黏膜表面完整，無(wú)潰瘍、水腫及充血等病理變化。模型組：胃竇、胃大彎黏膜糜爛可見(jiàn)多處出血灶，可見(jiàn)數(shù)量不等的圓形或橢圓形火山口樣潰瘍，呈中間凹陷，周?chē)∑馉?，且潰瘍底部平坦覆蓋有淺白色苔膜，邊界清晰，周?chē)つに[充血，無(wú)穿孔。陽(yáng)性藥物組潰瘍?cè)钜追直妫梢?jiàn)少量炎性滲出物，顏色較周?chē)＝M織白，個(gè)別黏膜有輕微糜爛，出血灶肉眼觀察明顯比模型組小、少。九龍十八癥湯高劑量組：胃黏膜可見(jiàn)輕微的糜爛，潰瘍較平坦，局部黏膜缺損范圍小于模型組，有個(gè)別愈合較好。九龍十八癥湯中劑量組：潰瘍愈合較好，大部分可以找到潰瘍?cè)?，面積較小，部分可見(jiàn)少量充血點(diǎn)及炎性滲出物，浸潤(rùn)深度最小，個(gè)別已愈合。九龍十八癥湯低劑量組：胃黏膜有不同程度糜爛，潰瘍?cè)蠲黠@，多數(shù)胃體仍可見(jiàn)出血灶，恢復(fù)情況是給藥組中最差的。

2.2 各組大鼠胃組織HE染色觀察 見(jiàn)圖1，圖2?？瞻捉M：黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則。上皮細(xì)胞呈單層柱狀細(xì)胞核小、圓形，未見(jiàn)核分裂。肌層細(xì)胞致密完好，漿膜層完整，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和出血。模型組：可見(jiàn)潰瘍處黏膜缺損，腺體消失，黏膜面表層見(jiàn)炎性滲出，其下可見(jiàn)壞死組織血管增生擴(kuò)張充血形成肉芽組織，期間大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，漿膜層較多炎性細(xì)胞滲出。陽(yáng)性藥組：胃黏膜恢復(fù)較完整，黏膜腺體重現(xiàn)，壞死組織已基本消失，間質(zhì)充血、水腫基本消失，炎性細(xì)胞及滲岀物比模型組明顯減少。九龍十八癥湯高劑量組：多數(shù)胃黏膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，壞死組織較少，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜面較多炎性及纖維素滲出。中劑量組：胃黏膜恢復(fù)好，壞死組織消失，個(gè)別已基本恢復(fù)，間質(zhì)僅可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，血管輕度充血。低劑量組：胃黏膜有一定程度的修復(fù)，但在給藥組中恢復(fù)程度最差，仍可見(jiàn)不少壞死組織和滲出物，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠胃病理組織（HE染色，50倍）

圖2 各組大鼠胃病理組織（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較 見(jiàn)表1。模型組與空白組比較潰瘍指數(shù)有顯著差異（P＜0.05）。各給藥組潰瘍指數(shù)與模型組比均有顯著差異（P＜0.05）。中劑量組抑制率最高，且和陽(yáng)性藥組比有顯著差異（P＜0.05）。高劑量組抑制率高于陽(yáng)性藥組但沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較（±s）

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽(yáng)性藥組比較，▲P＜0.05。下同。

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組高劑量組中劑量組低劑量組n 9 8 9 9 9 9潰瘍指數(shù)（mm2）0 8.84±0.78*5.06±0.79*#4.67±0.94*#3.21±0.69*#▲5.83±0.71*#潰瘍抑制率（%）--42.79 47.19 63.66 33.99

2.4 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α和TXB2水平比較 見(jiàn)表2。各組大鼠血清IL-8水平從高到低為模型組、低劑量組、陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、空白組，與空白組比較，中劑量組IL-8沒(méi)有顯著差異，其余組均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，用藥組均顯著降低（P＜0.01）；與陽(yáng)性藥組比較，高、低劑量組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），中劑量組有顯著差異（P＜0.05）。各組大鼠血清6-keto-PGF1α水平從高到低為空白組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性藥組、低劑量組、模型組；與空白組比較，其余組含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，除了低劑量組，其余組均顯著高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；與陽(yáng)性藥組比較，高劑量組、低劑量組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），中劑量組有顯著差異（P＜0.01）。各組大鼠血清TXB2水平從高到低為模型組、低劑量組、陽(yáng)性藥組、高劑量組、中劑量組、空白組；與空白組比較，其余組TXB2含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組降低程度沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），其余組均有顯著性差異（P＜0.01）；與陽(yáng)性藥組比較，高劑量組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），中、低劑量組有顯著差異（P＜0.01）。6-keto-PGF1α/TXB2的比值由高到低為空白組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性藥組、低劑量組、模型組。

表2 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組高劑量組中劑量組低劑量組n 9 8 9 9 9 9 IL-8（pg/mL）289.79±17.42 387.24±24.48**333.65±18.00**##326.49±24.46**##304.94±35.79##▲347.18±17.36**##6-keto-PGF1α（pg/mL）360.62±13.64 245.31±9.97**267.58±20.17**#277.37±12.91**##295.94±25.65**##▲▲256.71±10.93**TXB2（pg/mL）208.40±12.66 344.94±21.76**269.54±11.28**##265.20±12.89**##233.73±17.12**##▲▲330.86±26.45**▲▲6-keto-PGF1α/TXB2 1.73 0.71 0.99 1.05 1.27 0.78

3 討論

胃潰瘍臨床主要表現(xiàn)為中上腹周期性、節(jié)律性鈍痛、腹脹、反酸、燒灼感［10］。胃潰瘍病因有環(huán)境、飲食、免疫、感染和遺傳等，通常是多種因素聯(lián)合作用的結(jié)果［11］。胃潰瘍的瑤醫(yī)病名稱(chēng)作革施捫，屬于瑤醫(yī)的扭類(lèi)病（即胃病癥），捫證（即痛證）。瑤醫(yī)認(rèn)為本病是因?yàn)闅夂蚴С?，人體感受寒邪、疫瘴邪氣、痧氣，外邪侵入人體經(jīng)脈，壅阻于胃部，日久邪氣盈盛，阻滯經(jīng)脈，人體盈虧失衡，三元失諧，形成邪盈過(guò)盛的病理狀態(tài)，經(jīng)脈不通則痛；或饑飽失常、飲酒過(guò)量，導(dǎo)致胃脾功能受損，形成脾胃正虧過(guò)衰、邪盈過(guò)盛，人體盈虧失衡，三元失諧，日久成癆，不榮則痛［12］。治療以祛邪為急，針對(duì)氣滯、寒凝、濕熱、血瘀等致病因素，祛除其主要“病邪”，以打藥?kù)钚?；正虧過(guò)衰以扶正為先，以風(fēng)藥扶正。胃潰瘍熱證屬于瑤醫(yī)里的邪盈過(guò)盛而正虧不衰癥。九龍十八癥湯在組方中以九龍盤(pán)、十八癥、白狗腸、野蕎麥為主藥，都屬于瑤藥中的風(fēng)打相兼藥。九龍盤(pán)祛風(fēng)除濕，理氣止痛，止血散瘀；十八癥祛風(fēng)、散瘀止痛；白狗腸涼血、行瘀；野蕎麥清熱解毒、活血散瘀、消腫止痛。方中主藥功效以清熱解毒、活血散瘀為主，能清泄胃熱，化胃絡(luò)熱久所生瘀血。以田皂角、厚樸、山菠蘿、一點(diǎn)紅、香附、佛手、陳皮為配藥。田皂角清熱解毒、止血、拔毒生?。缓駱憷須庑袦?、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛；山菠蘿清熱解毒、行氣止痛、止血生肌。此3味藥屬于瑤藥中的風(fēng)打相兼藥。一點(diǎn)紅清熱解毒、止痛、活血散瘀；香附理氣止痛、止血；陳皮理氣化積；佛手理氣，和胃止痛。此4味藥屬于瑤藥中的風(fēng)藥。方中配藥功效以理氣止痛、止血生肌為主，還能輔助主藥加強(qiáng)清熱解毒、活血散瘀的功效。全方共奏清熱解毒，理氣止痛之功效，祛除中焦胃之熱毒，使機(jī)體恢復(fù)三元和諧，盈虧平衡的狀態(tài)。

胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)前列腺素能影響胃黏膜血流量且對(duì)胃腸黏膜的細(xì)胞起保護(hù)作用［13］。其中PGI2既可使胃黏液分泌增加，防止H+回滲，又能增加胃黏膜血流量，改善胃黏膜微循環(huán)灌注，起到保護(hù)胃黏膜的作用；而TXA2能使胃黏膜動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮、血小板聚集形成血栓，同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞及溶酶體膜的破壞，引發(fā)急性炎癥應(yīng)答，使中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，從而使胃黏膜缺血缺氧，細(xì)胞變性壞死，使H+外溢，造成出血和潰瘍。健康人PGI2/TXA2保持一定的比例［14-15］。在胃潰瘍炎癥反應(yīng)的傳遞過(guò)程中IL-8等促炎細(xì)胞因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［16-17］。PGI2、TXA2生物半衰期極短，離體后很快轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的代謝物6-keto-PGF1α和TXB2，因此一般通過(guò)檢測(cè)6-keto-PGF1α和TXB2來(lái)反映血清PGI2和TXA2的含量。

本研究發(fā)現(xiàn)九龍十八癥湯能改善大鼠胃組織潰瘍的情況，減輕胃竇、胃大彎黏膜糜爛的程度，修復(fù)出血灶，顯著改善胃黏膜水腫充血的情況。各給藥組潰瘍面積和深度比模型組顯著減小，潰瘍指數(shù)與模型組比均有顯著差異。光鏡下觀察各組胃組織的病理切片，九龍十八癥湯各劑量組大鼠胃黏膜有不同程度的修復(fù)，黏膜腺體重現(xiàn)。黏膜面表層壞死組織減少，改善間質(zhì)充血、水腫的情況，炎癥細(xì)胞減少，浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕。

各造模組大鼠血清IL-8水平均有所上升，除了中劑量組均顯著高于空白組，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)胃潰瘍模型的形成和IL-8含量升高有關(guān)。在給藥干預(yù)后，各給藥組血清中IL-8含量均有所下降，九龍十八癥湯各劑量組和模型組比均有顯著差異，中、高劑量組均優(yōu)于陽(yáng)性藥組，且中劑量組和陽(yáng)性藥組比有顯著差異。各造模組大鼠血清6-keto-PGF1α水平均顯著低于空白組，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)胃潰瘍模型的形成和PGI2含量降低有關(guān)。在給藥干預(yù)后，各給藥組血清6-keto-PGF1α含量均有所升高。九龍十八癥湯高、中劑量組和模型組比有顯著差異，中、高劑量組均優(yōu)于陽(yáng)性藥組，且中劑量組和陽(yáng)性藥組比有顯著差異。各造模組大鼠血清TXB2水平均顯著高于空白組，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)胃潰瘍模型的形成和TXB2含量升高有關(guān)。在給藥干預(yù)后，各給藥組血清中TXB2含量均有所降低，九龍十八癥湯高、中劑量組和模型組比有顯著差異，中、高劑量組均低于陽(yáng)性藥組，且中劑量組和陽(yáng)性藥組比有顯著差異。由各組大鼠血清6-keto-PGF1α/TXB2比值可知，各給藥組的比值均有上升，中劑量組上升最快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，九龍十八癥湯能降低大鼠血清中IL-8、TXB2的水平，升高6-keto-PGF1α水平，使6-keto-PGF1α/TXB2的比值水平趨于平衡，從而起到促進(jìn)潰瘍愈合，減少潰瘍形成的作用。以上情況綜合說(shuō)明九龍十八癥湯對(duì)大鼠胃潰瘍（熱證）模型具有較好的治療效果，初步確定九龍十八癥湯治療胃潰瘍熱證的有效性。