神經(jīng)旁浸潤陽性胃癌患者的臨床特征與預(yù)后分析

孫明明，錢雷敏，黃建明

（東南大學(xué)附屬江陰市人民醫(yī)院胃腸外科，江蘇江陰214400）

根據(jù)2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第五、病死率排名第四的惡性腫瘤[1-2]。我國胃癌早期診斷率低，進(jìn)展期占比大，導(dǎo)致胃癌5年生存率一直偏低，總體在35% 左右[3]，這主要與進(jìn)展期胃癌易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。TNM 分期一直是胃癌預(yù)后評估的重要參考依據(jù)，但臨床實踐發(fā)現(xiàn)越來越不能滿足臨床需求，例如相同TNM 分期的患者預(yù)后有時差異很大，或者不同分期的患者預(yù)后相似，這意味著除TNM 分期外，還存在影響胃癌預(yù)后的其他因素[4-5]。近年研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)旁浸潤（perineural invasion，PNI）可能是胃癌繼淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和腹腔種植轉(zhuǎn)移之后另一種重要的轉(zhuǎn)移擴散途徑，這種嗜神經(jīng)侵襲特性與預(yù)后密切相關(guān)。雖然PNI 是癌細(xì)胞局部外侵生長的生物學(xué)特性之一，但PNI 有可能是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第一站，并與進(jìn)展期癌痛發(fā)生密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)PNI 在不同TNM 分期的發(fā)生率不同，并未在IV 期癌組織中比例最高[7]，PNI 對胃癌預(yù)后判斷是否有影響尚存爭議。已有部分研究者認(rèn)為應(yīng)該將PNI 納入TNM 分期中[6,8]，但缺乏大樣本研究進(jìn)行佐證。為此，本研究中心回顧性分析543 例胃癌根治術(shù)患者的臨床病理資料，探討PNI 對胃癌預(yù)后的影響，為提高胃癌預(yù)后綜合判斷能力提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2011年6月—2016年12月期間胃腺癌患者的臨床病理資料和手術(shù)切除石蠟標(biāo)本543 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理確診為胃腺癌的患者；⑵術(shù)前增強CT 排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑶實施標(biāo)準(zhǔn)的胃周淋巴結(jié)清掃術(shù)，且術(shù)后病理學(xué)診斷為切緣陰性。病例剔除標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前及術(shù)中發(fā)現(xiàn)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑵術(shù)后病理學(xué)診斷為切緣陽性；⑶術(shù)前接受過新輔助放化療；⑷缺乏完整的臨床資料。術(shù)后定期隨訪，隨訪截止日期為2018年12月31日。

1.2 治療方法

手術(shù)方法：采用氣管插管全身麻醉，手術(shù)方式均為開腹手術(shù)，手術(shù)者為同一人，根據(jù)腫瘤的部位實施根治性全胃切除術(shù)、根治性遠(yuǎn)端胃大部切除術(shù)或近端胃大部切除術(shù)。

術(shù)后輔助化療：根據(jù)術(shù)后病理分期及隨訪復(fù)發(fā)情況實施以氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）為基礎(chǔ)的靜脈化療或口服化療。

1.3 標(biāo)本處理、染色及PNI結(jié)果判定

胃癌組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定12～24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚4 μm。切片進(jìn)行HE 常規(guī)染色和S-100 的免疫組織化學(xué)染色（ABC 法）。

PNI 結(jié)果判斷：癌細(xì)胞沿神經(jīng)纖維生長并包繞≥33%神經(jīng)周徑，或癌細(xì)胞侵犯3 層神經(jīng)鞘的任何一層（包括神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜、神經(jīng)內(nèi)膜），即可確認(rèn)為PNI （圖1）。根據(jù)PNI 陽性或陰性進(jìn)行分組。

圖1 PNI陰性和陽性HE染色（×200）Figure 1 PNI negative and positive HE staining(×200)

1.4 評價指標(biāo)與定義

臨床指標(biāo)包括年齡、性別、血型、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤方位、細(xì)胞分化程度、TNM 分期、是否存在脈管侵犯、手術(shù)切除范圍、是否術(shù)后輔助化療和Ki-67 陽性指數(shù)。

腫瘤大小取均值5 cm 為截點。腫瘤部位包括賁門胃底部、胃體部、胃角部、胃竇部及彌散型。腫瘤方位包括胃小彎側(cè)、大彎側(cè)、前壁、后壁及彌散型（≥2 個方位）。手術(shù)切除范圍包括根治性全胃切除術(shù)、遠(yuǎn)端胃大部切除術(shù)和近端胃大部切除術(shù)。脈管侵犯指淋巴管或血管有癌細(xì)胞浸潤或癌栓。Ki-67 陽性指數(shù)取均值60%為截點。

總生存時間（OS）：自手術(shù)時間至末次隨訪時間或死亡時間，或隨訪數(shù)據(jù)庫截至的時間（如失訪、死于其他疾病等）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行處理和分析。除觀察因素外，對生存分析有影響，且基本資料不平衡的可觀察因素作為協(xié)變量，納入二分類的Logistic回歸模型中，產(chǎn)生0～1 間的匹配評分，匹配精度設(shè)置為0.1，以最小毗鄰法進(jìn)行匹配后，對胃癌患者進(jìn)行亞組分析?？赡芘c預(yù)后相關(guān)的基本資料變量是年齡、性別、血型、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤方位、細(xì)胞分化程度、TNM 分期、脈管侵犯、手術(shù)切除范圍、Ki-67 陽性指數(shù)和是否術(shù)后輔助化療。采用χ2檢驗比較計數(shù)資料；采用Kaplan-Meier 法對匹配后胃癌患者生存時間進(jìn)行分析，生存曲線差異使用Log-rank 檢驗，預(yù)后相關(guān)因素分析采用Cox 風(fēng)險回歸模型。采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床基本資料

全組543例胃癌患者中，PNI陽性者115例（21.18%）。與PNI 陰性組相比，PNI 陽性組的腫瘤直徑大于5 cm的比例高，腫瘤主要位于賁門、胃底部，細(xì)胞分化程度集中在低分化、未分化或印戒細(xì)胞，大部分病例的TNM 分期處于III 期，合并脈管侵犯病例較多，全胃切除比例偏多，術(shù)后輔助化療的病例較多，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；但兩組患者在年齡、性別、血型、腫瘤方位和Ki-67陽性指數(shù)等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。以上13 個因素經(jīng)傾向評分匹配后，PNI 陽性組胃癌患者65 例、PNI 陰性組98 例；兩組間臨床基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），兩組基本資料均衡，具有可比性（表1）。

表1 傾向評分匹配前后兩組臨床基本資料的比較[n（%）]（續(xù)）Table 1 Comparison of basic clinical data between the two groups before and after propensity score matching[n(%)](continued)

表1 傾向評分匹配前后兩組臨床基本資料的比較[n（%）]Table 1 Comparison of basic clinical data between the two groups before and after propensity score matching[n(%)]

2.2 生存時間比較

傾向評分匹配后163 例胃癌患者中位OS 為34 個月，PNI 陽性組胃癌患者的OS 明顯低于PNI陰性組（中位OS：19 個月vs.49 個月，P=0.002）（圖2A）。不同TNM 分期亞組分析提示：I、II 期PNI 陽性組胃癌患者的OS 與陰性組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（中位OS：40 個月vs.48 個月，P=0.432），III 期PNI 陽性組低于陰性組（中位OS：16 個月vs.37 個月，P=0.009）（圖2B-C）。在PNI 陽性胃癌患者中，I、II 期接受術(shù)后輔助化療者的OS 與未化療者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（中位OS：30 個月vs.40 個月，P=0.975），III 期接受術(shù)后輔助化療者的OS 明顯高于未化療者（中位OS：18 個月vs.2 個月，P<0.001）（圖3A-B）。

圖2 傾向評分匹配后PNI陽性組與陰性組胃癌患者的OS曲線比較Figure 2 Comparison of OS curves of gastric cancer patients between PNI-positive group and negative group after propensity score matching

圖3 傾向評分匹配后化療與未化療PNI陽性胃癌患者OS曲線的比較Figure 3 Comparison of OS curves of PNI-positive gastric cancer patients with and without chemotherapy after propensity score matching

2.3 PNI陽性胃癌術(shù)后預(yù)后分析

Cox 單因素分析提示年齡、TNM 分期和術(shù)后輔助化療與PNI 陽性胃癌患者術(shù)后預(yù)后緊密相關(guān)（均P<0.05）。多因素分析發(fā)現(xiàn)TNM 分期處于III 期（HR=2.591，95%CI=1.291～5.198，P=0.007）、未進(jìn)行術(shù)后輔助化療（HR=0.345，95%CI=0.184～0.649，P=0.001）是影響PNI 陽性胃癌預(yù)后的獨立危險因素（表2）。

表2 匹配后影響65例PNI陽性胃癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of the prognosis of 65 patients with PNI-positive gastric cancer after matching

3 討 論

1985年前神經(jīng)旁浸潤（PNI）尚沒有明確、統(tǒng)一的定義，Batsakis 等[9]在1985年提出PNI 的廣義，即腫瘤細(xì)胞侵入、包繞或穿透神經(jīng)纖維，具備這些特征就可稱為PNI。直到2009年，Liebig 等[10]提出了較為準(zhǔn)確的定義，認(rèn)為PNI 是指腫瘤至少累及1/3 的神經(jīng)周徑，或者腫瘤細(xì)胞侵及神經(jīng)鞘3 層（神經(jīng)外膜、神經(jīng)鞘膜和神經(jīng)內(nèi)膜）的任何一層，此標(biāo)準(zhǔn)沿用至今。以往關(guān)于PNI 的研究主要集中在頭頸部鱗癌[11]、胰腺癌[12]、膽管癌[13]、宮頸癌[14]、前列腺癌[15]以及結(jié)直腸癌[16]，大多是臨床病例的回顧性研究，少部分是前瞻性研究或者體外細(xì)胞的基礎(chǔ)研究。PNI 目前被認(rèn)為是胃癌局部外侵轉(zhuǎn)移方式之一，不僅僅發(fā)生在胃周神經(jīng)叢，正如本研究圖1B 所示還涉及胃壁內(nèi)的神經(jīng)纖維。PNI 和淋巴脈管浸潤作為腫瘤局部侵襲性能力的代表，它們一起改變著腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，可見PNI 的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[17-19]。腫瘤微環(huán)境有腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)纖維參與，目前尚無明確機制闡明。PNI 可能是一個動態(tài)互動過程，一方面神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞分泌生長因子、細(xì)胞因子、黏附因子或基質(zhì)金屬酶2/9 等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附和遷移[20]，另一方面腫瘤細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)軸突延長，腫瘤細(xì)胞不斷沿神經(jīng)纖維向遠(yuǎn)處遷移[21]，這可能是胃癌細(xì)胞在胃壁中由內(nèi)向外浸潤（對應(yīng)于TNM 分期中的T）的途徑之一，或者向胃周腹腔神經(jīng)叢播散（對應(yīng)于TNM 分期中的M）的方式之一，似乎可與淋巴網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)受侵無關(guān)。這種遷移模式已經(jīng)在體內(nèi)外實驗得到部分證實。胃癌組織中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）的數(shù)量與胃癌TNM 分期、PNI 的發(fā)生率呈正相關(guān)[22]。在體外實驗中，CAFs 與胃癌細(xì)胞共育，癌細(xì)胞的遷移性、侵襲性增加，研究者認(rèn)為CAFs 是通過分泌IL-17a，激活了胃癌細(xì)胞中的JAK2/STAT3 信號通道，反之，利用IL-17a 抗體或JAK2 抑制劑可降低胃癌細(xì)胞的遷移性、侵襲性。

近幾年P(guān)NI 在胃癌中的臨床研究逐漸受到重視，但缺乏大樣本研究，觀察因素也參差不齊，使得PNI 在胃癌中的預(yù)后價值一直存在爭議。一項最新Meta 分析研究報道胃癌的PNI 的發(fā)生率在6.9%～75.6%，總體胃癌PNI 發(fā)生率約為35%[23]。本研究胃癌PNI 發(fā)生率約為21%，低于目前研究的總體水平，這可能與研究樣本數(shù)量、病理檢測手段及診斷標(biāo)準(zhǔn)差異相關(guān)[6,23-24]。本研究結(jié)果顯示隨著腫瘤體積增大、位于近端胃、分化程度降低、TNM 分期增加、合并脈管侵犯，胃癌PNI 的發(fā)生率增高，這與大多數(shù)研究結(jié)果相似[6,25]。其他研究報道胃癌PNI 與性別、年齡、Lauren 分型彌散型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目增多相關(guān)[24,26]。本研究還發(fā)現(xiàn)PNI 在全胃標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)率高，可能與該組病例腫瘤主要位于胃上部有關(guān)。接受術(shù)后輔助化療的PNI 陽性患者比例也較高，本研究認(rèn)為該組病例的病期普遍較晚、癌細(xì)胞惡性高，根據(jù)胃癌NCCN 指南，患者接受化療的依從性較高。目前預(yù)后相關(guān)研究觀點認(rèn)為，PNI 的發(fā)生與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，但能否作為影響腫瘤預(yù)后的獨立指標(biāo)報道不一。早在1994年日本學(xué)者Tanaka 等[27]在著名雜志Cancer 上詳細(xì)報道了PNI 與胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，該研究共調(diào)查了283 例胃癌患者，PNI 陽性率達(dá)49.1%，在216 例根治手術(shù)患者中術(shù)后復(fù)發(fā)者103 例，其中65 例為PNI 陽性，占63.1%，而且PNI 陽性的胃癌患者的5年生存率明顯低于PNI 陰性患者，多因素分析顯示，PNI 顯著影響胃癌預(yù)后。Bilici 等[28]對238 例行胃癌手術(shù)患者進(jìn)行臨床病理分析，PNI 陽性患者有180 例，高達(dá)75.6%。他們的研究還顯示PNI 陽性組的中位生存期明顯短于陰性組，同時認(rèn)為PNI可以獨立作為一個評估胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)。國內(nèi)多個回顧性研究也得出類似的結(jié)論[29-30]。Deng等[31]的單中心研究雖然認(rèn)為PNI 與腫塊大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管浸潤等均有關(guān)，但Cox 多元回歸分析卻顯示PNI 不能作為評估胃癌術(shù)后生存期的獨立因素，然而通過Meta 分析綜合了24 篇研究結(jié)果（共30 590 例胃癌患者），結(jié)果提示PNI 是影響根治性切除術(shù)后胃癌患者總生存的獨立的預(yù)后因素。本研究多因素分析結(jié)果顯示TNM 分期和術(shù)后輔助化療是影響PNI 陽性胃癌預(yù)后的獨立危險因素。PNI 陽性胃癌患者的生存期較短，尤其是III 期患者，而術(shù)后輔助化療可以顯著提高III 期患者的生存時間，但對I、II 期患者影響不大，這與國外部分研究結(jié)果一致。最近的一項中韓多中心研究項目結(jié)果提示，PNI 在預(yù)測III 期胃癌患者生存率時提供更多信息，被證明是III 期患者的獨立預(yù)后因素[26]，國內(nèi)也有類似研究報道[7]。不過，既往研究表明術(shù)后TNM 分期處于II 期的胃癌患者進(jìn)行輔助化療可提高患者生存期，本研究未獲得此結(jié)果，可能與本研究方案中納入II 期的病例數(shù)量少有關(guān)。我們推測隨著TNM 分期的增加，PNI 陽性胃癌患者易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存期自然縮短，而術(shù)后輔以5-FU 為基礎(chǔ)的化療可以使胃癌患者獲益[19,32]。眾所周知，低氧狀態(tài)影響化療反應(yīng)中重要的信號，使腫瘤對化療產(chǎn)生耐藥性。ERO1A 是一種新的腫瘤缺氧相關(guān)的內(nèi)源性標(biāo)記物，Tao 等[19]研究發(fā)現(xiàn)PNI 陰性組腫瘤微環(huán)境ERO1A 的表達(dá)高于PNI 陽性組，PNI 陰性組同樣發(fā)現(xiàn)Fu 耐藥相關(guān)指標(biāo)（TYMS mRNA 及其編碼的蛋白胸苷酸合成酶）的上調(diào)。雖然PNI 是胃癌預(yù)后不良的指標(biāo)，但可被輔助化療所逆轉(zhuǎn)，因此PNI 可用來預(yù)測輔助化療的療效，這類似于微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）的作用[33]。Woodham 等[34]研究發(fā)現(xiàn)PNI 在胃癌中的預(yù)后價值可與淋巴結(jié)受侵狀態(tài)無關(guān)，它的臨床價值可能高于淋巴脈管浸潤。已有研究者提議應(yīng)該將PNI 因素重點納入TNM 分期中[6,8]，尤其在沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況[34]。

綜上所述，PNI 是胃癌預(yù)后不良的重要因素，在TNM 分期為III 期中價值尤為重要，PNI 聯(lián)合TNM 分期可提高胃癌預(yù)后評估的準(zhǔn)確性，而PNI 可作為術(shù)后輔助化療指征及療效評價的參考指標(biāo)。本研究屬于回顧性分析，存在一定的局限性。雖然原始病例數(shù)較大，同時采用傾向評分匹配法克服選擇偏倚，但匹配后的PNI 陽性病例數(shù)明顯減少，說明原始基本資料存在較大的不均衡性。為了深入研究PNI 的臨床價值，已有研究者運用基于CT 的紋理分析和列線圖等方法在術(shù)前預(yù)測PNI 狀態(tài)，達(dá)到優(yōu)化胃癌患者的術(shù)前決策[35-36]。如何準(zhǔn)確地評價PNI 在胃癌術(shù)后的預(yù)后價值和在以化療為主的術(shù)后綜合治療中的療效判斷，尚需更大樣本及前瞻性循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。