黃芪甲苷對(duì)東莨菪堿致小鼠記憶障礙的保護(hù)作用及機(jī)制

吳月鵬 邱 爽 康 妍 高 敏 陳美華 張顏波

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東泰安 271000；

2.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東泰安 271016

阿爾茨海默?。ˋD）是一種發(fā)生于老年患者的慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球阿爾茨海默病患者己超過2 600萬(wàn)，我國(guó)已有超過500萬(wàn)阿爾茨海默病患者［2］。阿爾茨海默病患者早期出現(xiàn)空間定向障礙和記憶障礙，后出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙，造成極大的家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。雖然研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病有多種發(fā)病機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)部分藥物可以適當(dāng)緩解阿爾茨海默病患者的癥狀，但尚未發(fā)現(xiàn)能夠逆轉(zhuǎn)或阻斷阿爾茨海默病的特效藥物［3］。

氧化應(yīng)激損傷是阿爾茨海默病的重要發(fā)病機(jī)制，在阿爾茨海默病腦標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，說明阿爾茨海默病患者神經(jīng)細(xì)胞抗氧化能力減弱，導(dǎo)致自由基增加，促使神經(jīng)元凋亡［4］。黃芪甲苷作為補(bǔ)氣中藥黃芪的主要成分，可以提高神經(jīng)細(xì)胞SOD活性，減輕氧化應(yīng)激損傷［5］，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。我們擬通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芪甲苷可以通過減輕阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，達(dá)到改善阿爾茨海默病模型小鼠記憶障礙的效果，并研究其抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康昆明種小鼠60只，平均體重（20±5）g，由山東第一醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適宜的溫度和濕度條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，體重至30～35 g后分組。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 黃芪甲苷（成都曼思特生物科技公司），多奈哌齊（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司），氫溴酸東莨菪堿（上海士峰生物科技有限公司），MDA試劑盒、T-SOD試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所），無(wú)水乙醇和冰乙酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），生理鹽水（山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全套手術(shù)器械（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），明暗箱測(cè)試系統(tǒng)（北京吉安德爾科技有限公司），Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），酶標(biāo)儀［帝肯（上海）貿(mào)易有限公司］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪甲苷溶液配制 高濃度黃芪甲苷溶液（200 mg/kg）由20 mg黃芪甲苷加純水配制而成。配制200 mL高濃度黃芪甲苷溶液于棕色瓶中，儲(chǔ)存在4℃冰箱內(nèi)。將100 mL高濃度黃芪甲苷溶液（200 mg/kg）等體積稀釋得到200 mL中濃度黃芪甲苷（100 mg/kg）溶液，儲(chǔ)存于棕色瓶中，放置在4℃冰箱內(nèi)。低濃度黃芪甲苷溶液（50 mg/kg）稀釋儲(chǔ)存方法同上。

1.2.2 分組與給藥 將60只健康昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、黃芪甲苷高濃度組、黃芪甲苷中濃度組、黃芪甲苷低濃度組6組，每組10只。黃芪甲苷高、中、低濃度組分別灌胃200、100、50 mg/kg黃芪甲苷溶液，0.1 mL/（10g·d），1天1次，每天同一時(shí)間灌胃，連續(xù)灌胃14天。陽(yáng)性對(duì)照組每天灌胃30 mg/kg多奈哌齊?？瞻讓?duì)照組、模型組每天灌胃同等劑量純水。第15天開始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，至各組小鼠處死前，每天按照上述劑量灌胃。

1.2.3 東莨菪堿致記憶障礙動(dòng)物模型的構(gòu)建 灌胃給藥30 min后，給予模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、黃芪甲苷高、中、低濃度組小鼠腹腔注射東莨菪堿注射液1 mg/kg，空白對(duì)照組小鼠腹腔注射同等劑量的0.9%生理鹽水［7］。動(dòng)物模型構(gòu)建完成30 min后開始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試使用避暗實(shí)驗(yàn)［8］。本次避暗實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3天。第1天，將小鼠放入避暗測(cè)試箱明室中，在明、暗兩室間自由適應(yīng)2 min后取出；第2天，將小鼠放入明室，待其進(jìn)入暗箱后，關(guān)閉兩室間洞門，并向暗室底部柵欄通電2 s，間隔10 s后再通電2 s，10 s后取出；第3天，再將小鼠放入明室，監(jiān)測(cè)小鼠第1次從明室進(jìn)入暗室的時(shí)間，記錄為步入潛伏期，同時(shí)監(jiān)測(cè)2 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗箱的次數(shù)。

1.2.5 空間位置實(shí)驗(yàn) 空間位置實(shí)驗(yàn)使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［9］。本次實(shí)驗(yàn)在第3象限中央安裝平臺(tái)，低于水平面1 cm，共進(jìn)行6天。第1至5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日將小鼠依次從4個(gè)入水點(diǎn)放入水池中，監(jiān)測(cè)小鼠入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間，記錄為逃避潛伏期。取4個(gè)入水點(diǎn)所得的逃避潛伏期的平均值為本日逃避潛伏期結(jié)果。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，移去水下平臺(tái)，在原平臺(tái)的對(duì)側(cè)放入小鼠，使用頂部攝像機(jī)拍攝小鼠60 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，使用分析軟件獲取小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)、在目標(biāo)象限滯留的時(shí)間和游泳路程。每只小鼠測(cè)試1次。

1.2.6 丙二醛（MDA）和總超氧化物歧化酶（TSOD）活力測(cè)定 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉，斷頭后，在冰盤上迅速取腦，分離海馬和皮層，按組織重量加9倍生理鹽水制備腦組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清后保存于-20℃冰箱。

根據(jù)MDA和T-SOD試劑盒說明書，測(cè)定丙二醛含量和T-SOD的活力，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以（）表示，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠步入潛伏期顯著縮短（P＜0.05），錯(cuò)誤頻次顯著增加（P＜0.05），提示模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損。與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高、中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組小鼠步入潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），黃芪甲苷高、中、低濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠錯(cuò)誤頻次顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

表1 各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

2.2 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠各天逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，黃芪甲苷中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠各天逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10，s）

表2 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10，s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別劑量（mg/kg）逃避潛伏期第3天42.65±4.55 38.81±8.33*41.73±3.57 47.63±6.69#36.48±1.37*32.02±1.90*第5天38.00±3.54 31.68±6.27*36.06±4.92 43.89±4.83#29.93±8.77*28.08±4.18*第4天41.50±9.85 35.46±2.47*39.18±7.07 46.36±9.67#33.62±5.28*30.75±5.95*200 100 50 30第2天44.49±9.69 40.01±2.49*44.26±2.86 49.81±4.31#37.18±4.82*36.43±9.16*第1天47.65±6.99 41.09±7.68*46.13±4.52 53.81±7.18#42.33±5.29*39.71±3.93*高濃度中濃度低濃度模型組陽(yáng)性對(duì)照組空白對(duì)照組

2.3 空間探索實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程3個(gè)指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，黃芪甲苷中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)、在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程顯著增加（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高濃度組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程顯著增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（xˉ±s，n=10）

2.4 生化指標(biāo)結(jié)果

與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠腦組織MDA含量顯著升高（P＜0.05）、T-SOD活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高、中、低濃度組，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腦組織MDA含量顯著降低（P＜0.05），T-SOD活力顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠生化指標(biāo)結(jié)果（±s，n=10）

表4 各組小鼠生化指標(biāo)結(jié)果（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3 討論

阿爾茨海默病是一種以認(rèn)知功能損傷和行為障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。作為癡呆癥的主要原因，阿爾茨海默病約占癡呆病例的60%～80%，是癡呆的主要病因［10］，而且至今未找到理想的藥物逆轉(zhuǎn)和治愈阿爾茨海默病所導(dǎo)致的癡呆癥。為減輕阿爾茨海默病對(duì)社會(huì)和家庭帶來的沉重負(fù)擔(dān)，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和治療方案成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型是阿爾茨海默病經(jīng)典藥物篩選模型［7］。東莨菪堿是乙酰膽堿拮抗劑，可模擬乙酰膽堿不足造成的學(xué)習(xí)記憶障礙。本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在避暗實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠步入潛伏期顯著縮短、錯(cuò)誤頻次顯著增加，提示模型組小鼠被動(dòng)回避記憶能力受損。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠各天逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程3個(gè)指標(biāo)均顯著降低，提示模型組小鼠空間記憶能力受損。以上結(jié)果表明本次東莨菪堿致小鼠記憶障礙模型構(gòu)建成功。

氧化應(yīng)激是阿爾茨海默病的重要發(fā)病機(jī)制［11］。由于腦組織的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，腦內(nèi)氧含量較高，抗氧化物較少，所以腦組織易于受到氧化應(yīng)激損傷。阿爾茨海默病的病理特征表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內(nèi)異常沉積，沉積達(dá)到一定程度時(shí)可導(dǎo)致SOD等抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激因子MDA等增加，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。通過本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與空白對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠腦組織MDA含量升高，T-SOD活力降低，說明氧化應(yīng)激是阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制之一，表現(xiàn)為MDA含量升高，T-SOD活力降低。

中藥具有多靶點(diǎn)作用，在眾多不可治愈的疾病中顯示出不同程度的療效。有研究表明中藥可被推薦用于阿爾茨海默病患者的常規(guī)治療，其機(jī)制可能與激活多種信號(hào)通路有關(guān)［12］。黃芪作為最古老的傳統(tǒng)中藥之一，具有補(bǔ)中益氣、扶正固本的功效。黃芪甲苷是黃芪的有效活性成分，研究表明黃芪甲苷能夠有效改善Aβ1-42所致大鼠海馬組織SOD活性下降［13］。

我們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在避暗實(shí)驗(yàn)中，與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高、中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組小鼠步入潛伏期顯著延長(zhǎng)，黃芪甲苷高、中、低濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠錯(cuò)誤頻次顯著減少，提示黃芪甲苷對(duì)東莨菪堿致小鼠被動(dòng)回避記憶能力損傷具有改善作用。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，與模型組小鼠相比，黃芪甲苷中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠各天逃避潛伏期顯著縮短；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與模型組小鼠相比，黃芪甲苷中濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)、在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程顯著增加；與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高濃度組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間、在目標(biāo)象限內(nèi)游泳路程顯著增加；提示黃芪甲苷對(duì)小鼠空間記憶能力損傷有改善作用。

本研究生化指標(biāo)結(jié)果顯示，與模型組小鼠相比，黃芪甲苷高、中、低濃度組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腦組織MDA含量顯著降低，T-SOD活力顯著升高，提示黃芪甲苷對(duì)東莨菪堿致小鼠記憶障礙模型的氧化應(yīng)激損傷具有改善作用。

綜上所述，黃芪甲苷可以改善東莨菪堿致小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其作用機(jī)制可能與增加SOD水平和降低MDA水平有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突