變異型PEDV北京分離株ELISA檢測法的建立

夏 婷，郭嬌嬌，廖晨星，阮文科

(北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea disease，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染豬導(dǎo)致嘔吐、腹瀉，最后脫水死亡的一種傳染性極高的腸道疾病。該病對于所有豬均易感，具有嚴(yán)重的危害性，給世界生豬市場造成了不可估量的損失[1-2]。PED與豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)等在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化上都極其相似，但二者并無血清學(xué)交叉反應(yīng)，屬于新的PEDV成員。

接種疫苗是該病預(yù)防的重要手段，目前的流行毒株基因序列變異大，使疫苗臨床效果不明顯，疫情在大規(guī)模爆發(fā)時難以得到有效控制，研究發(fā)現(xiàn)，2010年以后的分離株都有核苷酸的變異，主要集中在S1的N端，經(jīng)過比對后發(fā)現(xiàn)，突變特點為T、C堿基的互換，解釋了疫苗無效的原因，給予重新建立疫苗株的提示[3]。

除接種疫苗預(yù)防PEDV外，找到一種更有效的免疫監(jiān)測豬群抗體水平和監(jiān)控PEDV疫情的方法也很重要，本研究旨在以北京地區(qū)流行毒株的S基因為基礎(chǔ)，建立一種PEDV的間接ELISA抗體檢測方法，方便PED樣本的批量檢測和快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬流行性腹瀉病的病料、表達(dá)載體PET-32a由獸藥與疫病防控分子生物學(xué)實驗室保存；BL21(DE3)菌株購自鼑國昌盛生物技術(shù)有限公司；T1噬菌體感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體T5，T4 DNA連接酶、Taq DNAPolymerase、DNA Marker、Protein Marker、Trizol LS Reagent購自全式金生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)豬陽、陰性血清購自華佰泰生物技術(shù)有限公司；豬陽性血清來自北京大興區(qū)某豬場；豬陰性血清來自SPF豬育種管理中心；豬抗CSFV，PRV，PRRSV，TGEV，PCV陽性血清購自華佰泰生物公司；96孔可拆卸酶標(biāo)板購自美國Costar公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購自康為世紀(jì)科技有限公司；HRP辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自GENVIEW公司；EcoR I、HindⅢ 限制性內(nèi)切酶購自TAKARA公司；山羊抗豬IgG HRP標(biāo)記抗體購自EARTYOX公司；BSA和Tween-20購自Biotopped公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上的中國PEDV疫苗株CV777的S1基因序列(登錄號:AF353511)，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物,預(yù)估大小為2 217 bp，由生工生物工程有限公司合成，上游引物：5’-GGAATTCATGAGGTCTTTAACCTACTTC-3’，下游引物：5’-CAAGCTTGATTAGAATGGTAGAAGAAAC-3’。用DNASTAR分析其抗原性后，選取抗原性好的19-277 aa片段(命名為S1seg)，以韓國毒株(ID:KM924427)為模板。同樣用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，預(yù)估大小為774 bp，由生工生物公司合成，上游引物：5’-GGAATTCCCACAAGATGTCACCAGGT-3’(EcoRⅠ),下游引物：5’-CAAGCTTGTTGGTTGGAAACCACCTT-3’(HindⅢ)。

1.2.2 PEDV S1基因的克隆與鑒定 處理病料，提取PEDV基因組的總RNA，在42 ℃ 30～50 min，85 ℃ 5 min的反應(yīng)條件下將總病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用1.2.1中設(shè)計的引物用PCR的方法擴(kuò)增PEDV基因組的部分核酸序列，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL,模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 36.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。電泳觀察結(jié)果,PCR產(chǎn)物回收純化，與克隆載體T5 Zero連接，命名為T5-S1。將重組質(zhì)粒T5-S1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，挑取陽性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測序鑒定，由上海生工生物工程公司測定堿基序列進(jìn)行測序。

1.2.3 表位預(yù)測和重組質(zhì)粒PET-32a-S1 seg的構(gòu)建 以T5-S1為模板，用1.2.1中設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增S1基因中抗原性較好的核酸序列，膠回收PCR產(chǎn)物，與pET-32a質(zhì)粒分別用EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，再將兩者用T4 DNA連接酶于24 ℃連接10 min。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，挑取陽性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測序鑒定。測序鑒定后獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為PET-32a-S1 seg。

1.2.4 重組質(zhì)粒PET-32a-S1 seg誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒PET-32a-S1 seg轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，當(dāng)菌液的OD600在0.6～0.8之間時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，在振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h進(jìn)行初步的誘導(dǎo)表達(dá)后，取沉淀用PBS洗滌重懸后超聲裂解，將上清和沉淀做SDS-PAGE鑒定，探究S1 seg蛋白的表達(dá)形式，按照以上步驟探究最佳誘導(dǎo)條件，并在所探尋的最佳誘導(dǎo)條件下對誘導(dǎo)表達(dá)后菌液的沉淀進(jìn)行Western-blotting分析鑒定，用His單抗作為一抗檢測S1 seg蛋白，豬流行性腹瀉陽性血清作為一抗檢測蛋白反應(yīng)原性。純化蛋白，SDS-PAGE鑒定優(yōu)化純化方式，確定最佳咪唑濃度和洗脫峰，再對純化后蛋白進(jìn)行Western-blotting分析鑒定，得到His標(biāo)簽融合表達(dá)的重組蛋白。

1.2.5 PEDV抗體檢測間接ELISA方法的建立 經(jīng)過抗原包被量、抗體稀釋度和反應(yīng)時間、封閉時間、顯色時間等反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，最終建立了檢測步驟。包被：向96孔板中每孔加入S1 seg抗原69 ng每孔和抗原包被液100 μL，37 ℃ 2 h。倒掉板內(nèi)液體，洗3次。封閉：每孔加200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h，倒板內(nèi)液體，拍干，洗滌3遍。加樣：PEDV陰、陽性血清用封閉液按40倍稀釋后分別加入陰陽對照組孔中每孔100 μL，待檢孔第1孔加待檢血清100 μL(40倍稀釋)，后孔對待檢血清做倍比稀釋，不要觸及孔底和孔壁，輕晃混勻。溫育：用封板膜封板后放于37 ℃下反應(yīng)30 min，后洗滌3遍，每次靜置3 min。加酶標(biāo)二抗：每孔加用封閉液按照25 000倍稀釋的酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃反應(yīng)30 min。顯色：顯色劑A液與顯色劑B液等量混勻，每孔100 μL，37 ℃用錫紙包嚴(yán)避光顯色20 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。測定：在15 min內(nèi)，以450 nm波長檢測每孔OD值。結(jié)果判定：陽性血清OD450≥X+3SD=0.100 75+3× 0.0257=0.178 1。陰性血清OD450≤X+2SD=0.10075+2×0.0257=0.1524，介于二者之間為可疑。

1.2.6 特異性及敏感度檢測 用已建立的間接ELISA方法，檢測豬傳染性胃腸炎病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒的陽性血清，用所測臨界值驗證該方法的特異性。檢測不同稀釋倍數(shù)的陽性血清，稀釋度從上到下依次為 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600，每個稀釋度做兩個重復(fù)并設(shè)陰陽性血清做對照。分光光度計測出OD450nm值，OD450nm值≥陽性臨界值時稀釋倍數(shù)最大的則為該方法敏感度。

1.2.7 重復(fù)性及保存期試驗 用同一批次與不同批次制備并純化的抗原包被96孔板，按照其他確定的條件，觀察其對血清OD450值的影響。使用6份陽性和2份陰性血清，并作標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性對照，做4孔重復(fù)。計算OD450平均值和變異系數(shù)，進(jìn)行批內(nèi)和批間差異試驗。用4 ℃保存30 d、60 d、90 d的制備好的ELISA板，檢測2份陽性血清和2份陰性血清，并做標(biāo)準(zhǔn)陰陽性對照，計算OD450值和變異系數(shù)。以此驗證該方法的保存期。

1.2.8 臨床樣本檢測及與試劑盒比較試驗 用所建立的ELISA方法對獸藥與疫病防控分子生物學(xué)實驗室2014年保存的來自于北京不同地區(qū)的100份豬血清進(jìn)行檢測，并和已上市PEDV試劑盒進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的初步表達(dá)后上清及沉淀的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

初步表達(dá)的S1 seg蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)(圖1)。

2.2 重組蛋白的Western-blotting鑒定結(jié)果

重組蛋白由His標(biāo)簽蛋白與S1 seg蛋白融合表達(dá)而成，Western-blotting鑒定(圖2)結(jié)果顯示不論是His抗體還是豬陽性血清均出現(xiàn)特異性條帶，而陰性血清中沒有。

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

通過SDS-PAGE檢測確定最佳咪唑濃度和洗脫峰，以最佳純化方法純化(圖3-A)，蛋白純化后再做Western-blotting鑒定其抗原性和純度，結(jié)果表明抗原性和純度都很好(圖3-B)。

2.4 特異性及敏感度檢測結(jié)果

檢測CSFV、PRV、PRRSV、PCV和TGEV的陽性血清，均為陰性，只有PEDV 陽性血清呈現(xiàn)陽性(表1)，和其他臨床癥狀相似的病毒并無交叉現(xiàn)象，說明該ELISA方法具有高度特異性。

對5份陽性血清做了倍比稀釋，確定在1∶800稀釋條件下，血清都呈陽性(表2)，說明本試驗建立的ELISA方法敏感性較高。

表1 特異性檢測結(jié)果Tab.1 The result of detection for the specificity

表2 敏感度檢驗結(jié)果Tab.2 Sensitivity test results

2.5 重復(fù)性及保存期試驗結(jié)果

通過計算板內(nèi)與板間重復(fù)試驗結(jié)果顯示兩組試驗變異系數(shù)都在10%以下(表3)，說明同一批抗原和不同時間制備純化的抗原包被ELISA板檢測結(jié)果均為變異度小，重復(fù)性良好。板間重復(fù)試驗如下，使用不同時間純化的抗原包被ELISA板，10份血清做了4個重復(fù)檢測，變異系數(shù)都小于10%(表3)，檢測結(jié)果波動不大，變異系數(shù)小，重復(fù)性很好。

選取4 ℃保存期為30 d、60 d、90 d的ELISA板，觀察其OD值和變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)陽性血清、陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清在30 d、60 d、90 d所測得OD值無較明顯差異(表4)，且變異系數(shù)均較小。表明此方法具有良好的穩(wěn)定性和比較長的保存期。

2.6 臨床樣本檢測及與試劑盒比較試驗結(jié)果

檢測獸藥與疫病防控分子生物學(xué)實驗室保存的北京不同豬場的100份豬血清，如表3，本研究所建立的間接ELISA方法與已上市的PEDV抗體檢測試劑盒比較結(jié)果顯示，所建立的間接ELISA方法檢測出陽性血清87份、陰性血清3份、可疑血清10份，而已上市的PEDV抗體檢測試劑盒檢測出陽性血清64份、陰性血清36份、可疑血清0份，兩者檢出相同數(shù)量的陽性血清和陰性血清分別有64份、3份。兩者符合率=(兩種方法檢出相同數(shù)量的陽性血清+相同陰性血清數(shù)+相同可疑數(shù))/100=(64+3)/100=67%，試驗證明所建立的間接ELISA方法結(jié)果可靠。

表4 不同保存期的檢測結(jié)果Tab.4 Detection of different storage periods

3 討 論

豬流行性腹瀉病是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，嚴(yán)重地影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[4]。從2010年開始，PED迅速流行，使中國南部10多個省份急性暴發(fā)了大規(guī)模的PED，波及多個省市，至今仍無法有效控制該病的發(fā)病和死亡[3]。PEDV S蛋白位于囊膜表面，主要提供免疫保護(hù)[5-6]，有很高的免疫原性。有研究表明, 感染PEDV的豬的血清中, 抗S蛋白的抗體在動物體內(nèi)存在持久，可檢測的時間更長，遠(yuǎn)超過抗N蛋白的抗體[7-8]，可檢測出免疫耐過豬，為建立檢測以S蛋白抗體為基礎(chǔ)的PEDV抗體檢測方法和基因工程疫苗的研制提供了非常重要的依據(jù)[9]。目前在國內(nèi)外也已經(jīng)研發(fā)出很多針對該病的預(yù)防疫苗，因為S蛋白上S1區(qū)顯著突變，導(dǎo)致PEDV感染和流行的變化，疫苗未能起到有效的作用，使疫情難以控制[10-12]。

因此對豬流行性腹瀉病防控的關(guān)鍵在于檢測免疫豬群抗體水平，目前市場上銷售的ELISA抗體診斷試劑盒大多為全病毒直接包被[14]，PEDV體外分離難度較大及制備全病毒診斷法具有潛在的排散病毒的隱患，且現(xiàn)有PEDV的ELISA檢測方法多以雙抗夾心ELISA為主[11-13]，這些試劑盒僅限于應(yīng)用在實驗室研究上，不可用于大批量臨床檢測?，F(xiàn)在迫切需要一種穩(wěn)定且易于制備、安全、快速且特異性和重復(fù)均高的新型診斷試劑的研制，以便基層大量樣本的檢測，因此本研究通過構(gòu)建PEDV的S1部分基因原核表達(dá)載體PET-32a-S1 seg，通過加入1 mmol/L的IPTG，在18 ℃時，成功誘導(dǎo)表達(dá)出PEDV的S1蛋白片段，利用該蛋白作為包被蛋白，研發(fā)出檢測PEDV的間接ELISA檢測方法，最終通過試驗確定該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，較為可信，可以作為變異株P(guān)EDV臨床免疫檢測的方法，它操作更簡便、成本更低、特異性更強(qiáng)且具有更高的利用價值?？梢杂糜赑ED的流行病學(xué)調(diào)查，為PEDV抗體檢測試劑盒和基因工程疫苗的開發(fā)提供了依據(jù)[15-16]。