中藥復(fù)方對大鼠后肢關(guān)節(jié)炎模型的療效及相關(guān)機理研究

高嬌陽，姜 聰，劉 宏，張宏偉，李 佳

(北京農(nóng)學(xué)院 動物科技學(xué)院；獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

關(guān)節(jié)炎與自身免疫反應(yīng)、感染、代謝紊亂、創(chuàng)傷、退行性病變等因素相關(guān),病因多樣且發(fā)病機制復(fù)雜。目前少有研究能將其發(fā)病機制完全闡明，因此臨床上還未有特異性治療藥物[1]。常規(guī)西醫(yī)治療方法副作用較大，且難以完全治愈，所以在人醫(yī)臨床上常應(yīng)用中醫(yī)藥對患者進行治療且療效顯著[2]。目前寵物臨床中犬后肢關(guān)節(jié)炎發(fā)病率較高，尚無特效藥物，而應(yīng)用傳統(tǒng)復(fù)方中藥進行動物后肢關(guān)節(jié)炎疾病的治療鮮有報道。關(guān)節(jié)炎在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中為“痹癥”中的一種，在經(jīng)典古方中，獨活寄生湯、定痛散及七厘散可用于“痹癥”的治療，因此本研究旨在探討?yīng)毣罴纳鷾⒍ㄍ瓷⒓捌呃迳笾P(guān)節(jié)炎的治療效果，以期為寵物臨床中應(yīng)用傳統(tǒng)經(jīng)典中藥復(fù)方治療動物后肢關(guān)節(jié)炎疾病積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組及給藥

SD大鼠50只，雌雄各半，體重188～212 g，分籠飼養(yǎng)，室溫25 ℃，相對濕度40 %～60 %。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、模型組、3種復(fù)方中藥治療組(獨活寄生湯組、定痛散組、七厘散組)，每組10只。除對照組外，對其余4組大鼠進行造模，造模成功后，3種復(fù)方中藥治療組每組分別給予10 g/kg大鼠體重的生藥灌胃，每日1次。對照組、模型組同時給予10 g/kg體重生理鹽水灌胃，每日1次。連續(xù)給藥14 d。

1.2 主要儀器及試劑

II 型膠原蛋白酶，美國Sigma；大鼠TNF-α ELISA Kit，日本TaKaRa；大鼠IL-1β ELISA Kit，日本TaKaRa。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R501，上海申順生物科技公司；全自動高壓滅菌器；真空干燥箱DZF6090型，上海一恒科技有限公司；超純水儀，日本Millipol；LBY-BX紅細胞變形儀，北京普利生儀器有限公司；LBY-N6B 全自動自清洗血流變儀，北京普利生儀器有限公司；LBY2 F200B微量血漿黏度計，北京普利生儀器有限公司；激光散斑血流系統(tǒng)，Perimed AB。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠后肢關(guān)節(jié)炎模型的建立

將II型膠原蛋白與無菌生理鹽水充分混勻，制成0.2 mg/mL乳劑注射，按0.1 mL/只大鼠劑量，注射于大鼠關(guān)節(jié)腔[3]。對照組大鼠于相同部位注射等量生理鹽水。同時，為了造成血瘀證導(dǎo)致慢性關(guān)節(jié)炎的效果，使用冰水浴浸泡大鼠雙后肢，每天1次，每次10 min，連續(xù)3周。造模成功的判定標準為大鼠后肢膝關(guān)節(jié)腫脹，伸直和屈曲的活動角度和對照組相比顯著降低，血液流變學(xué)指標及血流灌注量指標和對照組相比有顯著差異。

1.3.2 中藥復(fù)方生藥的制備 獨活寄生湯組方：獨活9 g、桑寄生、細辛、秦艽、防風(fēng)、肉桂、牛膝、杜仲、熟地、當歸、川芎、白芍、黨參、茯苓、甘草各6 g；定痛散組方：天花粉500 g(炒)、甘草75 g(炒)、沒藥、木香各30 g，乳香45 g、陳皮75 g、當歸45 g、血竭45 g、大附子10 g；七厘散組方：血竭500 g、乳香(制)75 g、沒藥(制)75 g、 紅花75 g、兒茶120 g、冰片6 g、麝香6 g、朱砂60 g。采用水提醇沉法制備生藥，中藥飲片加涼水浸泡1 h，使水面高出飲片2～3 cm，大火煮沸后，再用文火煮30 min，每劑煎3次。將3次藥液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮生藥藥液至1 g/mL備用[4,5]。

1.3.3 關(guān)節(jié)炎屈曲度相關(guān)指標的檢測 膝關(guān)節(jié)活動范圍的檢測：處死前測量大鼠膝關(guān)節(jié)活動范圍。用測量儀測量其完全伸直到彎曲的角度，即關(guān)節(jié)活動最大值。每只大鼠重復(fù)測量3次，取平均值作為最終測量值。關(guān)節(jié)炎指數(shù)的檢測：觀察關(guān)節(jié)腫脹程度并采用4分制記分，無關(guān)節(jié)腫脹為0分，關(guān)節(jié)輕度發(fā)紅、腫脹為1分，關(guān)節(jié)重度發(fā)紅、腫脹為2分；膝關(guān)節(jié)及整個趾端嚴重發(fā)紅、腫脹為3分；嚴重腫脹且不能負重為4分[6]。四肢積分累積為AI值，最高為16分[7]。

1.3.4 血流灌注量及血液流變學(xué)指標的檢測 采用速眠新麻醉大鼠，固定其頭部及四肢，暴露頸部以下被毛。使用激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)檢測大鼠血流灌注量變化。檢測部位為3 mm2的腫脹部位區(qū)域及背部區(qū)域(基本覆蓋小鼠背部)，在背部區(qū)域中劃定約40 mm2的圓形區(qū)域，固定激光探頭到皮膚距離為20 cm，連續(xù)檢測15 min。計算第10 min至15 min平穩(wěn)狀態(tài)下，該區(qū)域的平均血流灌注量。采用快速心臟采血，在2 h內(nèi)檢測血樣的全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集及變形指數(shù)。

1.3.5 外周血及關(guān)節(jié)液中相關(guān)炎性因子的檢測 用ELISA法測定大鼠外周血及關(guān)節(jié)液中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

使用SPSS16. 0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，表現(xiàn)形式為平均數(shù)±標準差(Mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種復(fù)方中藥對模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和膝關(guān)節(jié)伸直與屈曲角度的影響

如表1結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，關(guān)節(jié)炎指數(shù)極顯著增加(P<0.01)，伸直角度極顯著降低(P<0.01)，屈曲角度極顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，獨活寄生湯組關(guān)節(jié)炎指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，伸直角度顯著增加(P<0.05)；七厘散組關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低(P<0.05)，伸直度顯著增加(P>0.05)，屈曲度顯著降低(P<0.05)；定痛散組關(guān)節(jié)炎指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，伸直角度與屈曲角度變化差異不顯著。

2.2 3種復(fù)方中藥對模型大鼠血液流變學(xué)指標的影響

如表1結(jié)果顯示，模型組與對照組比較10S-1全血黏度、60S-1全血黏度、血漿黏度、紅細胞聚集指數(shù)、均極顯著升高(P<0.01)，紅細胞變形指數(shù)顯著降低(P<0.01)；獨活寄生湯組與模型組比較，10S-1全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)，紅細胞變形指數(shù)極顯著升高(P<0.01)；定痛散組與模型組比較，10S-1全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)極顯著升高(P<0.01)，60S-1全血黏度、150S-1全血黏度顯著降低(P<0.05)；紅細胞變形指數(shù)顯著升高(P<0.05)；七厘散組與模型組比較，僅紅細胞聚集指數(shù)顯著下降(P<0.05)。

2.3 3種復(fù)方中藥對模型大鼠血流灌注量的影響

如表1結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，局部血流灌注量顯著降低(P<0.05)，背部血流灌注量極顯著降低(P<0.01)。獨活寄生湯組與模型組比較，局部血流灌注量極顯著增加(P<0.01)，背部血流灌注量顯著升高(P<0.05)；定痛散組與模型組比較，局部血流灌注量變化差異不顯著(P>0.05)，背部血流灌注量極顯著增加(P<0.01)；七厘散組與模型組比較，局部血流灌注量變化差異不顯著(P>0.05)，背部血流灌注量極顯著增加(P<0.01)。

2.4 3種復(fù)方中藥對模型大鼠炎性因子的影響

如表1結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，血清中IL-1β與TNF-ɑ水平及關(guān)節(jié)液中IL-1β與TNF-ɑ水平均極顯著增加(P<0.01)。獨活寄生湯組與模型組比較，血清中IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，TNF-ɑ水平極顯著降低(P<0.01)。關(guān)節(jié)液中IL-1β水平極顯著降低(P<0.01)，TNF-ɑ水平顯著降低(P<0.05)；定痛散組與模型組比較，血清IL-1β水平、關(guān)節(jié)液IL-1β水平與關(guān)節(jié)液TNF-ɑ水平均顯著降低(P<0.05)；七厘散組與模型組比較，關(guān)節(jié)液TNF-ɑ水平顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

3.1 大鼠后肢關(guān)節(jié)炎模型的建立

文獻記載中后肢關(guān)節(jié)炎造模方法主要有手術(shù)法、非手術(shù)法、自發(fā)模型三類[8-10]。十字韌帶切開法等手術(shù)法需手術(shù)操作，恢復(fù)期較長且造模后模型動物后肢關(guān)節(jié)炎損傷程度及穩(wěn)定性難以統(tǒng)一[11]，自發(fā)模型價格昂貴[12]。因此，經(jīng)過比較選取了非手術(shù)法中的膠原蛋白酶注射法進行大鼠后肢關(guān)節(jié)炎模型的建立。在注射膠原蛋白酶的基礎(chǔ)上，采用了冰水浴刺激大鼠，模擬氣滯血瘀狀態(tài)下的慢性關(guān)節(jié)炎。通過該方法成功建立氣滯血瘀型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并通過觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度、關(guān)節(jié)伸直曲屈角度、血液流變學(xué)指標、血流灌注量及炎癥因子水平，對造模效果進行評價。結(jié)果顯示，模型組大鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹明顯,膝關(guān)節(jié)伸直角度極顯著減小，屈曲角度極顯著增大，膝關(guān)節(jié)活動范圍下降，除150S-1切變率下全血黏度變化不顯著，其余不同切變率下全血黏度，血漿黏度，紅細胞聚集指數(shù)均有增加，紅細胞變形指數(shù)下降均差異極顯著。且局部血流灌注量顯著減少，背部血流灌注量極顯著減少。以上說明模后大鼠血液循環(huán)障礙，血液流通不暢，可認為其血液瘀滯，氣血運行不暢，從中醫(yī)角度判斷，符合中醫(yī)理論中“痹癥”致病因素的描述[13]。模型組血清和關(guān)節(jié)液中炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平極顯著升高(P<0.01)，關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)明顯。因此綜合以上結(jié)果，說明已成功建立大鼠后肢關(guān)節(jié)炎模型，可用于后續(xù)中藥復(fù)方治療效果的研究。

表1 大鼠關(guān)節(jié)炎相關(guān)指標檢測結(jié)果Tab.1 Results of arthritis related indexes in rats

3.2 3種復(fù)方中藥對模型大鼠的綜合治療效果觀察

研究結(jié)果顯示，獨活寄生湯能夠減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，增加膝關(guān)節(jié)活動范圍，降低其血清與關(guān)節(jié)液中炎性因子水平，增加血液灌注量，降低血液黏度，促進血液循環(huán)，定痛散也能夠減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，增加膝關(guān)節(jié)活動范圍，效果與獨活寄生湯相近。在改善血液流變性質(zhì)方面，定痛散強于獨活寄生湯和七厘散。定痛散能夠增加血流灌注量，但僅在促進背部血流灌注方面表現(xiàn)優(yōu)異，其有一定降低炎癥因子水平的作用，但效果弱于獨活寄生湯，優(yōu)于七厘散。七厘散在減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度、改善血液循環(huán)和降低炎癥因子水平方面均有一定效果, 但僅在促進背部血流灌注方面優(yōu)于獨活寄生湯。綜合上述各項指標，獨活寄生湯在減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹、促進血液循環(huán)、降低炎癥因子水平方面均效果較好，其綜合治療效果強于定痛散和七厘散。分析獨活寄生湯組方，其中獨活、秦艽、防風(fēng)、細辛為君藥能祛風(fēng)濕、止痹痛。桑寄生配伍杜仲、牛膝能益肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕為臣藥。當歸、川芎、白芍、熟地黃養(yǎng)血兼活血，黨參、茯苓補氣健脾，肉桂溫通血脈共為佐藥。甘草為使藥益氣扶正，調(diào)和諸藥，諸藥合用祛除風(fēng)濕、強筋健骨、養(yǎng)血活血、補氣健脾[14]。有現(xiàn)代研究指出，獨活寄生湯能夠有效改善患者微循環(huán)狀態(tài)，緩解炎癥癥狀，延緩關(guān)節(jié)炎病癥發(fā)展[15]，本試驗結(jié)果與該文獻報道相符。

3.3 3種復(fù)方中藥對模型大鼠的治療機理分析

3.3.1 血液流變學(xué)指標變化及其意義 目前臨床多通過血液流變學(xué)指標變化反應(yīng)患者血管及血細胞功能狀態(tài)，檢測血液流變學(xué)數(shù)據(jù)能夠更全面的了解中藥復(fù)方的作用效果[16]。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生湯組10S-1全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)均極顯著降低，紅細胞變形指數(shù)極顯著升高。定痛散組10S-1全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)極顯著降低，60S-1全血黏度、150S-1全血黏度顯著降低，紅細胞變形指數(shù)顯著升高。該結(jié)果說明，經(jīng)過獨活寄生湯和定痛散給藥后，CIA大鼠的血液粘稠程度降低，流動性增強，紅細胞的狀態(tài)和活性得到改善，從而使大鼠的血液流變學(xué)指標趨于正常，且定痛散對于血液流變學(xué)指標的改善效果強于獨活寄生湯。七厘散對血液流變學(xué)各項指標的作用效果有限。該結(jié)果說明獨活寄生湯和定痛散可降低CIA大鼠的血液粘稠度、改善血流速度和紅細胞狀態(tài)，從而達到對CIA大鼠行氣活血的治療效果，與文獻中指出獨活寄生湯對血液流變學(xué)有著明顯的改善作用的報道相符[16,17]。

3.3.2 微循環(huán)指標變化及其意義 微循環(huán)對維持組織和器官的生理功能起重要作用，文獻報道證明關(guān)節(jié)炎與微循環(huán)障礙有關(guān)，血流灌注量指標在很大程度上可反應(yīng)動物機體微循環(huán)的狀態(tài)[18]。獨活寄生湯組與模型組比較，局部血流灌注量極顯著升高，背部血流灌注量顯著升高，說明獨活寄生湯對于促進血液循環(huán)的作用效果明顯，使局部與背部的血流灌注量均得到改善。定痛散組和七厘散組對局部血流灌注量的作用效果不顯著，僅使背部血流灌注量極顯著增加，說明定痛散與七厘散均有一定促進血液循環(huán)的作用，但對病變局部的作用效果有限。該結(jié)果說明獨活寄生湯對CIA大鼠發(fā)揮較好的治療作用與其能夠提高大鼠的血流灌注量從而改善大鼠微循環(huán)狀態(tài)，達到活血化瘀的治療效果有關(guān)，與相關(guān)文獻報道相符[19]。

3.3.3 炎性指標變化及其意義 IL-1β、TNF-ɑ是關(guān)節(jié)炎癥中的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)。獨活寄生湯組大鼠血清IL-1β水平、關(guān)節(jié)液TNF-ɑ水平顯著降低，血清TNF-ɑ水平、關(guān)節(jié)液IL-1β水平極顯著降低。該結(jié)果說明獨活寄生湯可降低CIA大鼠機體內(nèi)炎癥因子的水平，從而減輕炎癥反應(yīng)，對大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用。定痛散組大鼠血清IL-1β水平、關(guān)節(jié)液IL-1β水平與關(guān)節(jié)液TNF-ɑ水平均顯著降低，該結(jié)果說明定痛散對于CIA大鼠也具有一定的抗炎治療效果，但其抗大鼠關(guān)節(jié)炎的效果弱于獨活寄生湯。七厘散組大鼠僅關(guān)節(jié)液TNF-ɑ水平顯著降低，其他各項指標未見顯著差異，說明七厘散對CIA大鼠發(fā)揮抗炎效果有限，其抗炎效果弱于獨活寄生湯和定痛散。有文獻報道中指出，獨活寄生湯可有效降低動物機體炎癥因子水平，達到抗炎抗風(fēng)濕的效果[20]。本試驗結(jié)果與該文獻報道相符，且其抗炎效果的發(fā)揮與其降低大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平有關(guān)。

綜上所述，3種復(fù)方中藥對CIA大鼠均顯示出一定治療效果，其中獨活寄生湯效果最佳，定痛散次之，其機理與降低炎性因子的水平、降低血液粘稠度以及改善微循環(huán)的活血化瘀作用有關(guān)。該結(jié)果說明應(yīng)用傳統(tǒng)中藥復(fù)方治療關(guān)節(jié)炎有潛在的臨床價值。