慢性心陽虛大鼠模型制備改良研究

王恩慈，霍艷穎，吳實權(quán)，梁冰冰，張云茜，趙一帆，馬洪海，姜代勛，霍桂桃2

(1.北京農(nóng)學院 動物科學技術(shù)學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京102206；2.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京100176)

心陽虛是臨床常見證候，其病因主要與心陽不足和虛寒內(nèi)生有關(guān)。為深入探討心陽虛的現(xiàn)代機理，研究者分別應用阿霉素[1]、垂體后葉素[2]、普羅帕酮[3]及冠狀動脈結(jié)扎[4]、腹主動脈縮窄[5]等方法制備出多種心陽虛大鼠模型并進行了評價。心陽虛模型除使動物表現(xiàn)出心力不足或衰竭外，還需具備神疲乏力、畏寒肢冷等陽氣不振或陽虛的癥狀[6]。余洪等以阿霉素結(jié)合低溫刺激法制備的慢性心衰心陽虛大鼠模型，與單用阿霉素比較，造模時間短、成功率高[1]。由此可見，采用西醫(yī)疾病模型與中醫(yī)證候模型相結(jié)合的方式是制備心陽虛動物模型的關(guān)鍵，即以藥物等直接損傷心臟，造成慢性心衰；以寒邪強加于機體，損傷陽氣，尤損心陽[7]，造成陽虛。最終，通過“以病帶證”或“病證結(jié)合”的方式得到心陽虛動物模型。在余洪等基礎上對慢性心衰心陽虛大鼠模型的制備方法進行了改良：以阿霉素誘導不變，低溫刺激由原來的冰柜冷凍改為冰水浴游泳，進一步增加寒冷刺激并消耗體能，同時對大鼠一般狀況、體溫、心肌酶、腦利鈉肽(BNP)、心電圖及心肌病理學等指標進行了測定和評價，為心陽虛動物模型的制備研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與材料

SPF Sprague Dawley大鼠 25 只(雌性，6 周齡，體質(zhì)量(165±5)g)，斯貝福生物技術(shù)有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2016-0002)。大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房，每日燈光照射12 h，室溫(25±2) ℃，相對濕度(55±5)%。給予充足飲用水和飼料，飲用水為煮沸并恢復至室溫的自來水，飼料由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2015-0015)。涉及的動物試驗均嚴格按照北京農(nóng)學院動物福利與倫理委員會有關(guān)規(guī)定進行(批準號：BUAJDX2019001)。

鹽酸多柔比星(批號bzl020766)購自山西普德藥業(yè)有限公司，心肌酶活性測試片(AST、ALT、CK、LDH批號分別為6847513、4305921、6205317、4163275)購自愛德士生物科技公司，大鼠BNP 45 ELISA試劑盒(貨號ab108816)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，肝素鋰抗凝真空采血管(批號19076101)購自河北鑫樂醫(yī)療器械科技股份有限公司，真空采血針(批號20170606)購自浙江康德萊醫(yī)療器械股份有限公司，0.9 %氯化鈉注射液(批號201901216)購自辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗方法

大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組(10只)和模型組(15只)。對照組：試驗第1、8、15、22、29、36天，按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射0.9 %氯化鈉注射液，1次/7 d，連續(xù)48 d。模型組：試驗第1、8、15、22、29、36天，按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射2 mg/mL的鹽酸多柔比星溶液(0.9 %氯化鈉注射液配制)，即注射鹽酸多柔比星4 mg/kg體質(zhì)量，1次/7 d，連續(xù)48 d，累計給藥量24 mg/kg體質(zhì)量。造模期間，每天上午將模型組大鼠置于冰水(0 ± 2) ℃中游泳3 min，每天1次，連續(xù)48 d，冰水浴后用干毛巾將大鼠皮毛擦干。造模期間，所有大鼠均自由采食和飲水。造模完成后，觀察2組大鼠臨床癥狀或表現(xiàn)。

1.3 體溫測量

在試驗第0、7、14、21、28、35、42天的8:00，使用耳溫槍(德國博朗公司，型號IRT6520WE)測量大鼠耳洞溫度，每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4 心電圖和心率檢測

在試驗第0、7、14、21、28、35、42天上午進行心電圖檢測。腹腔注射1 %戊巴比妥鈉(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉大鼠，仰臥保定，通過Ⅱ?qū)?lián)將生物電纜連接至大鼠右前肢和雙后肢皮下的無菌針灸針上。采用多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號RM6240)，記錄大鼠3 min的心電圖，每隔2 min測定1次心率，共測3次，取平均值。

1.5 心肌酶活性檢測

試驗第42天，在記錄完心電圖后，腹主動脈采血，肝素鋰抗凝并分離血漿。應用生化分析儀(愛德士生物科技公司，型號Catalyst Dx)進行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測。

1.6 血漿BNP測定

試驗第42天，在記錄完心電圖后，腹主動脈采血，肝素鋰抗凝并分離血漿。應用ELISA法測定血漿BNP含量，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 心肌組織病理觀察

試驗第42天，大鼠采血后處死，迅速摘取心臟，按常規(guī)方法制備心肌組織切片，并于光學顯微鏡(Olympus, 型號BX51)下觀察，采集圖像。

結(jié)果主要以折線圖/柱形圖±標準差(折線圖結(jié)果偏高組采用+標準差，結(jié)果偏低組采用-標準差，柱形圖采用+標準差)表示，采用t-檢驗分析對照組與模型組差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀況

造模結(jié)束后，對照組大鼠無死亡，精神狀態(tài)良好，十分活躍，被毛整齊有光澤，無畏縮扎堆現(xiàn)象，姿勢狀態(tài)正常，大便正常，攝食及飲水正常。模型組大鼠死亡5只，4只死于麻醉，1只死于肺實變，生存率為66.7 %，大鼠精神萎靡，活動量減少，被毛疏松、無光澤，呈黃白色，身體蜷縮，有明顯畏縮和扎堆現(xiàn)象，大便較軟、甚至稀溏，采食量及飲水量均減少，臨床一般狀況表現(xiàn)出陽虛。

2.2 生理指標變化

由圖1可知，造模期間，大鼠的體溫、心肌酶活性、血漿BNP及心率變化如下。對照組大鼠體溫均在37 ℃以上，模型組大鼠體溫呈緩慢性下降趨勢，且第7天起降至37 ℃以下(圖1-A)。與對照組比較，模型組大鼠體溫在第28、35和42天明顯降低(P<0.01)。造模后模型組大鼠心肌酶各指標與對照組比較均出現(xiàn)升高的變化(圖1-B)。其中，ALT、AST以及LDH活性均明顯升高，差異極顯著(P<0.01)； CK活性顯著升高，差異顯著(P<0.05)。造模后模型組大鼠血漿BNP含量與對照組比較顯著升高(圖1-C)，約高于對照組4倍，差異顯著(P<0.05)。造模期間，模型組大鼠心率呈降低趨勢(圖1-D)。與對照組比較，模型組大鼠在第14、21、28天心率顯著降低(P<0.05)，在第35、42天心率極顯著降低(P<0.01)。

2.3 心電圖變化

由圖2可知，造模期間，大鼠心電圖變化如下。在造模的第42天，模型組大鼠與對照組比較R波和S波振幅增大，QRS間期變寬，ST段呈明顯弓背型向上抬高，且與T波相連形成單向曲線(圖2-A,B)。在造模的第14天，模型組大鼠與對照組比較QRS間期顯著延長，差異顯著(P<0.05)；在第21和35天，模型組大鼠QRS間期均明顯延長，差異極顯著(P<0.01)(圖2-C)。模型組大鼠ST段呈抬高趨勢(圖2-D)。在造模的第35、42天模型組大鼠與對照組比較ST段明顯抬高，差異極顯著(P<0.01)。

2.4 心肌病理學變化

由圖3可見，對照組大鼠心肌形態(tài)正常，排列整齊，未見異常變化(圖3-C1，C2，C3)。模型組大鼠中可見心臟間質(zhì)單個核細胞浸潤(圖3 -M1)；心肌細胞空泡變性(圖3-M2)；心肌變性及大量單個核細胞浸潤(圖3-M3)。

3 討 論

阿霉素屬于抗生素類抗腫瘤藥，因能選擇性造成心臟毒性和損傷，所以常被用于制備心病動物模型，包括心陽虛大鼠模型。由結(jié)果可知，模型組大鼠在造模結(jié)束后出現(xiàn)了精神萎靡、活動減少、身體蜷縮等癥狀；體溫在造模后期的第28、35和42天也出現(xiàn)明顯降低的狀況(P<0.01)，因而，該模型在中醫(yī)上可辨為陽虛。研究表明心陽虛大鼠的藥物造模法體溫會出現(xiàn)降低，如試驗中的模型組大鼠與高脂飲食聯(lián)合腦垂體后葉素制備的冠心病心陽虛證模型大鼠體溫均出現(xiàn)明顯降低[8]，而手術(shù)造模法如冠狀動脈結(jié)扎法、腹主動脈縮窄法制備的心陽虛模型大鼠體溫則沒有異常變化[4,5]。另外，模型組大鼠在造模結(jié)束后僅死亡5只，生存率為66.7%，高于阿霉素加冷柜刺激制備的心陽虛模型大鼠53.3%的生存率[1]。

心肌酶是存在于心肌細胞中一類較特殊的酶類，包括AST、ALT、LDH、CK等。當心肌發(fā)生炎癥或受損時，心肌酶被釋放到血液中，使酶活性升高。連續(xù)48 d應用多柔比星造模后，模型組大鼠血漿ALT、AST、CK、LDH活性明顯升高(P<0.01/P<0.05)，提示模型組大鼠心肌出現(xiàn)了炎癥或損傷。相反，在造模后期注射垂體后葉素制備的冠心病心陽虛證大鼠模型AST、ALT活性沒有顯著變化，而CK、CK-MB活性則顯著升高[8]。

BNP是利鈉肽家族成員之一，主要來源于心室。心肌缺血、壞死、損傷等可刺激BNP的合成與分泌，具有強大的擴張血管和利鈉、利尿作用。研究表明，BNP 為左心室功能及預后評價的可靠指標[9]，在心血管病的診斷、治療和預后等方面已成為研究熱點。徐攀等在腹主動脈縮窄法制備心陽虛大鼠模型中引入了BNP指標，試驗結(jié)果表明心陽虛大鼠模型血清BNP含量明顯增高[5]。以多柔比星聯(lián)合冰水浴刺激制備的慢性心衰心陽虛大鼠模型血漿BNP含量也顯著升高(P<0.05)，提示心肌存在缺血或壞死。由此可知，BNP可成為評價心陽虛動物模型的一個有效指標。

心電圖可反映心臟每一心動周期所產(chǎn)生的電活動變化，通過其波形變化可分析心肌受損程度、房室功能障礙以及心律異常等情況。已有研究表明，心陽虛大鼠模型心電圖波形存在異常變化[8,10]。心電圖中，QRS間期及ST段能反映心室功能。QRS波群是心室的去極化，由負向、振幅較小的Q波和聳立向上的R波以及向下的S波組成，是整個心動周期中振幅最大、最明顯的波群。QRS間期變寬往往與心室擴大、肥厚或室內(nèi)傳導阻滯有關(guān)[11]。在造模過程中，模型組大鼠QRS間期呈延長趨勢，其中，第14、21和35天，QRS間期顯著延長(P<0.01/P<0.05)，提示心室功能異常或存在器質(zhì)性變化。ST段是QRS波群終點到T波開始前的一段，即心室去極化完成到復極化尚未開始的階段，正常情況處于等電位線上。ST段異常抬高提示心肌缺血和梗死，ST段抬高形態(tài)不同則提示心肌缺血部位或損傷程度存在差異[12, 13]。研究表明冠狀動脈結(jié)扎法制備心陽虛大鼠模型在術(shù)后30 d內(nèi)ST段升高個數(shù)明顯增多[14]。試驗結(jié)果顯示，模型組大鼠ST段從造模第7天開始即呈抬高趨勢，在第35、42天時ST段異常抬高(P<0.01)，提示心肌缺血或損傷。

心率變化與心臟功能和疾病緊密相關(guān)[15,16]。研究表明不同的心陽虛大鼠模型制備方法，對心率影響不同：手術(shù)造模方法如冠狀動脈結(jié)扎或腹主動脈縮窄法制備的心陽虛大鼠模型心率出現(xiàn)升高[4,5]，而藥物造模方法如垂體后葉素、普羅帕酮或普萘洛爾法誘導的心陽虛大鼠模型心率則存在降低的變化[3,10,17]。試驗結(jié)果顯示，模型組大鼠從14 d開始至造模結(jié)束心率顯著降低(P<0.01/P<0.05)，與前述藥物造模法對心陽虛大鼠模型心率影響結(jié)果一致。

組織病理學檢查是疾病診斷、確診的直接和最終定性方法。根據(jù)結(jié)果，多柔比星聯(lián)合冰水浴刺激誘導的模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)了單個核細胞浸潤、心肌細胞空泡變性和心肌變性等炎癥性病理學改變，與阿霉素誘導的急、慢性心臟毒性模型或心力衰竭心陽虛模型大鼠心肌病理學變化基本相似[18-20]。

綜上可知，鹽酸多柔比星聯(lián)合冰水浴寒冷刺激法可制備出具有陽虛癥狀和心臟損傷特征的慢性心陽虛大鼠模型。該法操作相對簡單，造模成功率高，是制備心陽虛動物模型的一種可供參考的方法。