病毒誘導(dǎo)基因沉默對(duì)葉用萵苣內(nèi)源激素含量的影響

許夢(mèng)男，郝新迪，陳 麗，韓瑩琰

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

葉用萵苣屬菊科萵苣屬，原產(chǎn)于歐洲地中海沿岸，為1～2年生的草本植物，口感清脆，食用方便，富含鐵和鎂等許多礦物質(zhì)，并含有鉀、鈣、磷、硫等人體必需元素，營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值高，受到廣大消費(fèi)者的青睞。葉用萵苣屬于一類(lèi)重要的葉類(lèi)蔬菜，近年來(lái)也成為菊科植物基因組計(jì)劃中被廣泛研究的重要物種。

內(nèi)源激素對(duì)植物有重要作用，是植物在特定環(huán)境信號(hào)誘導(dǎo)下通過(guò)自身代謝產(chǎn)生的小分子有機(jī)化合物。植物的一生都在受激素的調(diào)節(jié)，從種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)果再到衰老凋謝[1]。這些簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化效應(yīng)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響。生長(zhǎng)素和赤霉素主要功能是促使細(xì)胞分裂分化，促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)，有研究發(fā)現(xiàn)在水稻、擬南芥受到病原物侵染時(shí)，這兩種激素可以起防御作用[2]。脫落酸又稱(chēng)應(yīng)激激素，它可以使植物在受到外界不良刺激時(shí)誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生相關(guān)酶，提高自身抗性[3]。茉莉酸可以提高植物的防御能力，茉莉酸途徑中COI1基因編碼的F-box蛋白在植物防御反應(yīng)中具有重要功能[4]。幾種激素在植物體內(nèi)可以單獨(dú)行使功能，各激素的信號(hào)途徑又可以相互交叉，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在植物體內(nèi)發(fā)揮重要效應(yīng)，使植物在受到一定的生物和非生物脅迫時(shí)，能夠提高自身防御性和恢復(fù)能力。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，周期短，方法操作簡(jiǎn)單，該技術(shù)是用病毒攜帶目的基因侵染植物，使其表型和生理上出現(xiàn)變化，從而研究該基因在植物中行使的功能[5]。最早被用來(lái)描述植物受病毒侵染后癥狀的恢復(fù)情況，現(xiàn)已有效運(yùn)用于鑒定植物對(duì)脅迫做出的應(yīng)答反應(yīng)[6,7]。植物在受到病毒侵染后會(huì)將病毒的mRNA降解掉，出現(xiàn)一定程度的抗性，形成一種保護(hù)自身穩(wěn)定的機(jī)制，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的是TRV病毒載體，成功的應(yīng)用于辣椒、馬鈴薯、煙草等植物上[8,9]。

ZFP鋅指蛋白是一種具有指狀結(jié)構(gòu)并且需要與Zn2+結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中被廣泛研究，該蛋白主要參與植物的形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育，抵抗非生物脅迫及激素響應(yīng)，除此之外，ZFP鋅指蛋白在植物受到生物脅迫后也會(huì)做出防御反應(yīng)，對(duì)促進(jìn)植物的生命進(jìn)程有重要影響[10,11]，本試驗(yàn)利用VIGS技術(shù)侵染葉用萵苣，誘導(dǎo)LsZFP1沉默后，測(cè)定葉用萵苣內(nèi)源激素含量，分析經(jīng)TRV介導(dǎo)侵染后，各處理葉用萵苣內(nèi)源激素含量有何變化，為進(jìn)一步探究LsZFP1在葉用萵苣中行使的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

葉用萵苣品種‘PS-11’由北京開(kāi)心格林科技有限公司提供，種植于北京農(nóng)學(xué)院計(jì)算機(jī)溫室。選取干凈無(wú)雜質(zhì)的種子進(jìn)行催芽處理，播種于50孔穴盤(pán)，幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，單棵定植在營(yíng)養(yǎng)缽中，緩苗7 d后，進(jìn)行TRV病毒侵染。試驗(yàn)處理為：攜帶LsZFP1基因的病毒載體(TRV-LsZFP1)，空載(TRV)，空白對(duì)照(WT)。

1.2 方 法

1.2.1 侵染葉用萵苣 將配置好的侵染液用不帶針頭的注射器注入葉片背面，直至有明顯水漬狀，每個(gè)處理注射30株，每株注射2片葉子，每片葉子以葉脈為中心注射兩處。注射21 d后，取其功能葉片和莖，速凍于液氮后，-80 ℃保存，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 鑒定侵染植株 用TRV特異性引物(TRV-F：5′-GCTTTATTATTACGGACGAGTGG-3′； TRV-R：5′-GAACCTAAAACTTCAGACACGGAT-3′)檢測(cè)處理植株。

1.2.3 內(nèi)源激素測(cè)定 酶聯(lián)免疫法測(cè)定四種激素含量，選用ELISA試劑盒。稱(chēng)0.7 g樣品于研缽中，研缽提前冰浴，后續(xù)研磨也一直處于冰浴狀態(tài)，加入2 mL 提取液將樣品磨碎，轉(zhuǎn)入離心管中，再用提取液沖洗研缽一并轉(zhuǎn)入管中，4 ℃下提取6 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液并記錄體積。上清液過(guò)固相萃取柱后轉(zhuǎn)入離心管中，吹干，用樣品稀釋液定容至2 mL，490 nm波長(zhǎng)，上酶聯(lián)免疫儀(BIO-RAD Mode 550)讀數(shù)[12]。

采用Excel 2019處理數(shù)據(jù)，使用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)鑒定結(jié)果

如圖1所示，TRV出現(xiàn)200 bp左右的條帶，侵染植株TRV-LsZFP1出現(xiàn)400 bp左右條帶，空白處理無(wú)條帶，結(jié)果表明，TRV病毒成功侵染到植株中。

2.2 侵染后葉用萵苣脫落酸含量變化

脫落酸作為應(yīng)激激素，在植物受到不良刺激后含量會(huì)迅速上升，提高自身抗性。圖2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株莖、葉中脫落酸含量都很高，均到400 μg/L以上；空白處理的植株中，莖、葉脫落酸含量是TRV-LsZFP1侵染植株的65%，顯著降低，可以看出脫落酸含量受LsZFP1基因表達(dá)的影響。TRV侵染植株中脫落酸含量在320 μg/L左右，2個(gè)處理脫落酸含量都顯著高于空白對(duì)照。

2.3 侵染后葉用萵苣生長(zhǎng)素含量變化

圖2可以看出，TRV-LsZFP1和TRV侵染的植株莖、葉中生長(zhǎng)素含量高，均達(dá)到100 μg/L左右，空白處理的植株中，莖、葉生長(zhǎng)素含量是75 μg/L左右，和侵染植株相比顯著降低40%左右。

2.4 侵染后葉用萵苣茉莉酸含量變化

茉莉酸主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫反應(yīng)，可以從多方面增強(qiáng)植物對(duì)細(xì)菌、病毒的抗性。圖2可以看出，每個(gè)處理葉中茉莉酸含量要高于莖中茉莉酸含量。TRV-LsZFP1侵染植株葉中茉莉酸含量顯著高于空白對(duì)照，其含量為1 311.92 μg/L，與TRV處理相比提高18%，相比空白對(duì)照提高38%。TRV-LsZFP1侵染植株和TRV莖中茉莉酸含量達(dá)到1 200 μg/L左右，顯著高于對(duì)照組32%。

2.5 侵染后葉用萵苣赤霉素含量變化

赤霉素會(huì)促進(jìn)植物莖的伸長(zhǎng)，當(dāng)赤霉素合成受到抑制時(shí)，葉用萵苣莖伸長(zhǎng)時(shí)間(抽薹)會(huì)延后，有利于對(duì)葉用萵苣抗抽薹方面的研究。圖2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株與其他兩個(gè)處理差異是顯著的。總體來(lái)看，TRV-LsZFP1侵染的植株中赤霉素含量最低，莖中赤霉素含量為498.26μg/L，葉中含量為460.39 μg/L；TRV侵染的植株和空白對(duì)照莖、葉中赤霉素含量相近，為590 μg/L左右， TRV-LsZFP1侵染植株與兩者相比，下降了21.6%。

3 討 論

植物在受到生物和非生物脅迫時(shí)，為了維持自身正常的生理機(jī)能，會(huì)啟動(dòng)自身防御網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)是由復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成的一套防御系統(tǒng)，植物體內(nèi)各種激素相互作用形成的生理效應(yīng)就是此防御系統(tǒng)的重要組成部分[13,14]。許多研究表明，茉莉酸、脫落酸在植物受到病原體侵染過(guò)程中會(huì)發(fā)揮重要功能，積極防御病原體對(duì)植物產(chǎn)生的不良反應(yīng)[15]。茉莉酸主要是通過(guò)調(diào)節(jié)茉莉酸途徑中的轉(zhuǎn)錄因子，受體復(fù)合物和相關(guān)茉莉酸合成基因組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來(lái)抵抗病原體對(duì)植物體造成的危害[16]。植物受侵染出現(xiàn)傷口后，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生電位變化，加速茉莉酸的合成[17]。脫落酸參與植物脅迫反應(yīng)，通過(guò)誘導(dǎo)與抗性有關(guān)酶的合成而提高植物在不良環(huán)境中的適應(yīng)能力。脫落酸也會(huì)促進(jìn)茉莉酸信號(hào)路徑的分支反應(yīng)，當(dāng)死體營(yíng)養(yǎng)性病原物侵染擬南芥時(shí)，茉莉酸受脫落酸影響，在擬南芥中的含量水平會(huì)升高，使擬南芥增強(qiáng)對(duì)病原體的抗性[18]。本試驗(yàn)中，將TRV病毒載體注射侵染葉用萵苣后，侵染植株脫落酸和茉莉酸含量較對(duì)照植株會(huì)顯著升高，表明葉用萵苣受到病毒注射傷害后，為了抵抗脅迫，會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控內(nèi)源激素含量發(fā)生變化，來(lái)增加自身抗性。ZFP鋅指蛋白也是植物抵抗脅迫過(guò)程中的重要組成部分[19]，本試驗(yàn)中，LsZFP1轉(zhuǎn)入TRV病毒載體后侵染葉用萵苣，TRV-LsZFP1植株赤霉素顯著低于其他兩組對(duì)照，而TRV處理組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，赤霉素含量下降可能是由于TRV-LsZFP1經(jīng)農(nóng)桿轉(zhuǎn)導(dǎo)侵染葉用萵苣后，LsZFP1表達(dá)受到抑制，而在某種通路中促進(jìn)DELLA蛋白合成，使赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到阻礙導(dǎo)致含量降低。另外一種可能是葉用萵苣受到病毒侵染后，與赤霉素合成相關(guān)的反饋調(diào)節(jié)的敏感性降低，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究[3]。當(dāng)赤霉素途徑受到抑制時(shí)，赤霉素合成含量降低，有另外一點(diǎn)優(yōu)勢(shì)是可以延長(zhǎng)葉用萵苣莖伸長(zhǎng)的時(shí)間，這有助于對(duì)葉用萵苣抽薹作用的研究。生長(zhǎng)素也能有效參與植物抵抗脅迫的過(guò)程，在本試驗(yàn)中，TRV-LsZFP1和TRV侵染植株生長(zhǎng)素含量較空白對(duì)照植株顯著增加，我們推測(cè)當(dāng)葉用萵苣受到TRV病毒侵染后，影響生長(zhǎng)素合成的相關(guān)通路，使生長(zhǎng)素含量在植物受到病毒侵染后顯著增加，促進(jìn)侵染傷口盡快恢復(fù)[20]。植物體內(nèi)各種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，組成了植物防御反應(yīng)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。