從江香豬miR-146b-3p 的組織表達(dá)、靶基因預(yù)測(cè)及其初步研究

崔小芝，許厚強(qiáng),*，熊 訊，陳 晨，許家利，諶穎蓮，敖 政，倪萌萌，阮 涌，陳 偉

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

從江香豬（Sus scrofa）作為我國(guó)特有的地方豬種資源，具有肉質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)特性；而大白豬（Sus scrofa）雖然在生長(zhǎng)速度上具有優(yōu)勢(shì)，但其肉品質(zhì)達(dá)不到消費(fèi)者的要求[1]。從江香豬較大白豬生長(zhǎng)遲緩，了解從江香豬生長(zhǎng)遲緩的成因機(jī)制，對(duì)提高從江香豬養(yǎng)殖效率具有重要意義。因此，解析從江香豬生長(zhǎng)緩慢的分子機(jī)制，是目前相關(guān)課題亟需攻克的難點(diǎn)。microRNA（miRNA）是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約18～25 個(gè)核苷酸，其通過(guò)與靶mRNA 的3'UTR 端區(qū)域結(jié)合來(lái)抑制靶基因的翻譯或降解靶基因的表達(dá)[2]，發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 在細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲、凋亡與腫瘤等生物過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。首先，在人體中miR-146b 基因位于10 號(hào)染色體q24-32，miR-146b-3p 和miR-146b-5p 是miR-146b 的不同成熟產(chǎn)物，miR-146b-3p 通過(guò)抑制靶基因NF2 促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。而涂鎮(zhèn)波[5]用腫瘤細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了超表達(dá)miR-146b-5p 能抑制急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的侵襲與浸潤(rùn)，miR-146b-5p 還可調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞的發(fā)育成熟和間充質(zhì)干細(xì)胞成脂的分化[6]。其次，在探索博來(lái)霉素所致肺纖維化（Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis）作用機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)可以促進(jìn)小鼠肺組織中miR-146b 的表達(dá)上調(diào)[7]，miR-146b 上調(diào)后，還可通過(guò)降低細(xì)胞色素P450 芳香化酶（CytochromeP450-19A1,CYP19A1）促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[8]。彭永東[9]還發(fā)現(xiàn)miR-146 能調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝。此外，還有研究顯示miR-146b-3p在雞（Gallus gallus）生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，如miR-146b-3p 能直接抑制PI3K/AKT 通路和MDFIC，進(jìn)一步抑制雞成肌細(xì)胞的增殖與分化[10]。但miRNA 在不同物種之間具有高度的保守性[11]，且miR-146b-3p 在豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本文以上述研究為基礎(chǔ)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究miR-146b-3p 在豬生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制，旨在為從江香豬分子遺傳育種工作提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取飼養(yǎng)環(huán)境相同的240 日齡健康從江香豬與大白豬各3 頭，采集心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸和背最長(zhǎng)肌8 個(gè)組織樣，用0.9%的生理鹽水、DEPC 水處理后，錫箔紙包裝，做好標(biāo)記，先放置液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。用于各組織RNA 與DNA 的提取。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴州大學(xué)種豬場(chǎng)提供。

載體pMD-19-T 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PM-U6 微小miRNA 超表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建（圖1）；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、從江香豬肌細(xì)胞均由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 PM-U6 真核表達(dá)載體

1.2 試劑與儀器 DM 2000 Marker 購(gòu)自擎科生物技術(shù)有限公司（北京）；2×EsTaq Master Mix 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、75%的酒精購(gòu)自宏達(dá)爾生物科技有限公司（貴州）；DNA 提取試劑盒Tissue DNA Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾生物科技有限公司（美國(guó)）；質(zhì)粒抽提試劑盒、Trizol 試劑購(gòu)自英駿生物技術(shù)有限公司（Gibco,美國(guó)）；超微量紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為T(mén)hermo ManoDrop 2000,美國(guó)）、梯度PCR儀（型號(hào)為ABI VeritiTM,德國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織RNA 的提取 從-80℃冰箱中取出組織樣品置于冰盒中，用已滅菌好的剪刀、鑷子取50～150 mg組織于研缽中，加入液氮研磨組織成粉末，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中，根據(jù)Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取從江香豬和大白豬各組織的總RNA，對(duì)提取的總RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定后各取2 μg 總量，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。

1.3.2 DNA 的提取 組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5 g 組織，放入1.5 mL 離心管中，剪碎，按照Tissue DNA Kit（Omega Biotek,美國(guó)）試劑盒說(shuō)明書(shū)提取模板DNA，將所提取的DNA 儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)miR-146b-3p 的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)序列擴(kuò)增引物和miR-146b-3p 頸環(huán)引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3.4 miR-146b-3p 靶基因預(yù)測(cè) 本文采用miRNA22.2與TargetScan 靶基因在線軟件預(yù)測(cè)miR-146b-3p 的靶基因（http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22_targets.html）。miR-146b-3p 序列來(lái)源于miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org/），miR-146b-3p 的成熟序列為：GCCCT GTGGACTCAGTTCTGGT。靶基因（Growth hormone receptor，GHR）3'UTR（GenBank NO:XM_01399063 6.2）序列來(lái)源于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）以逆轉(zhuǎn)錄獲得的各組織cDNA 為模板，利用qRT-PCR 檢測(cè)miR-146b-3p 在各樣本中的相對(duì)表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參基因，以大白豬心臟組織為對(duì)照樣本，運(yùn)用2-ΔΔCt[12]計(jì)算出miR-146b-3p 在不同樣本中的相對(duì)表達(dá)量。qRTPCR 采用10 μL 反應(yīng)體系：2×UltraSYBR Mixture（High ROX）5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL、cDNA 0.5 μL、ddH2O 4 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，57℃退火40 s，40 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)溶解曲線來(lái)判斷PCR 反應(yīng)的特異性。

1.3.6 miR-146b-3p 前體序列擴(kuò)增及超表達(dá)載體的構(gòu)建以提取的DNA 為模板對(duì)miR-146b-3p 前體序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系20 μL：Taq DNA 聚合 酶10 μL，上下游引物（10 pmol/ L）各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)償延伸10 min。對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將片段大小相符的PCR 產(chǎn)物根據(jù)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD-19-T 載體在16℃條件下連接16 h 后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)繁及PCR 檢測(cè)，將陽(yáng)性樣本交送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證；T 克隆產(chǎn)物與PM-U6空載體利用SalI 和HandIII 雙酶切，純化后在16℃條件下連接16 h 后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)繁及PCR 檢測(cè)，將PM-U6-miR-146b-3p 超表達(dá)陽(yáng)性樣本交送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)2-ΔΔCt對(duì)qRT-PCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，利用軟件SPSS 19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，不同字母表示差異顯著（P＜0.05）；*為差異顯著（P＜0.05）；** 為差異極顯著（P＜0.01）；樣本重復(fù)數(shù)n=3。

2 結(jié)果

2.1 miR-146b-3p 在從江香豬及大白豬各組織中的表達(dá)分析 以大白豬的心臟組織為對(duì)照，利用qRT-PCR 檢測(cè)到miR-146b-3p 在從江香豬和大白豬各個(gè)組織均有表達(dá)，結(jié)果如圖2 所示。在從江香豬中，miR-146b-3p 在小腸中的表達(dá)量最高，極顯著高于其余組織，其余組織表達(dá)量由高到低依次為大腸、肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌均有不同程度的表達(dá)，背最長(zhǎng)肌表達(dá)量最低（P＜0.01）；在大白豬中，miR-146b-3p 在肺臟中表達(dá)量最高，在其他組織中的表達(dá)量由高到底依次為小腸、大腸、脾臟、背最長(zhǎng)肌、肝臟、腎臟、心臟。miR-146b-3p 在從江香豬小腸、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟和背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著高于大白豬。

圖2 miR-146b-3p 在從江香豬和大白豬不同組織中的表達(dá)

2.2 miR-146b-3p 靶基因預(yù)測(cè) 采用RNA22.2 在線軟件，將豬GHR、IGF-1序列與miR-146b-3p 的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示：GHR的3'UTR 序列中含有miR-146b-3p 的結(jié)合位點(diǎn)（圖3），可能是miR-146b-3p 的候選靶基因，IGF-1的3'UTR 序列沒(méi)有任何結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 miR-146b-3p 在候選靶基因中的靶位點(diǎn)

2.3 miR-146b-3p 克隆載體和重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定miR-146b-3p 克隆載體菌液PCR 鑒定結(jié)果（圖4）與雙酶切結(jié)果（圖5）均顯示條帶為99 bp，測(cè)序結(jié)果（圖6）顯示與miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列一致，沒(méi)有突變位點(diǎn)，由此鑒定了miR-146b-3p 在從江香豬組織中存在。

圖4 miR-146b-3p 前體序列的PCR 擴(kuò)增

圖5 PM-U6-miR-146b-3p 雙酶切圖

圖6 PM-U6-miR-146b-3p 產(chǎn)物序列分析

2.4 miR-146b-3p 超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染從江香豬肌細(xì)胞 將miR-146b-3p 超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至從江香豬肌細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總RNA，在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)miR-146b-3p 及GHR、IGF-1的表達(dá)情況。qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明（圖7），miR-146b-3p 超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染從江香豬肌細(xì)胞后miR-146b-3p 的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)，GHR的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)，IGF-1也有所下調(diào)但差異不顯著。

圖7 miR-146b-3p 在從江香豬肌細(xì)胞中超表達(dá)后對(duì)GHR 基因表達(dá)的影響

3 討論

miRNA 是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA。關(guān)于miRNA 在不同物種上的功能與機(jī)制研究取得了很多研究成果，但是關(guān)于豬miRNA 的研究以及其數(shù)據(jù)相對(duì)于人類(lèi)miRNA 來(lái)說(shuō)還有很大的探索空間。已有研究證實(shí)miR-146b-3p 參與細(xì)胞增殖分化，進(jìn)一步調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[13]，但miR-146b-3p 在從江香豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)理尚不清楚。之前關(guān)于miR-146b-3p 都是在特定的組織與細(xì)胞中進(jìn)行研究[14]，miRNA 在不同物種和組織中的表達(dá)模式不同，功能也會(huì)隨之不同[15]。構(gòu)建miRNA 組織表達(dá)譜也是研究其功能的一種有力方法，其成本低、簡(jiǎn)單易行，且能夠?qū)iRNA 進(jìn)行定量分析。因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)miR-146b-3p 在各組織中的表達(dá)差異性，發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p在從江香豬和大白豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、背最長(zhǎng)肌8 個(gè)組織中均有表達(dá)；miR-146b-3p 在從江香豬小腸和大腸中的表達(dá)量顯著高于大白豬，這與miR-let-7a 在大腸和小腸均有高表達(dá)量一致，miR-let-7a 對(duì)豬在腸道吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有調(diào)控作用[16]，這是否揭示miR-146b-3 也在豬腸道吸收營(yíng)養(yǎng)過(guò)程有重要的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。而miR-146b-3p 在從江香豬肝臟和脾臟中的表達(dá)量也高于大白豬，肝臟在動(dòng)物體的生物學(xué)過(guò)程中具有非常重要的作用，如參與三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維生素、激素等代謝過(guò)程，還參與分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等過(guò)程，脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，且肝臟和脾臟會(huì)嚴(yán)重影響豬的采食量、生長(zhǎng)速度、抗病能力、生產(chǎn)性能[17]，miR-146b-3p 在從江香豬和大白豬中存在差異性，其可能是從江香豬和大白豬生長(zhǎng)速度存在差異的調(diào)控基因?；诒菊n題組前期研究GHR在從江香豬與大白豬各組織中均有表達(dá)的基礎(chǔ)[18]，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 與GHR3'UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)，而與IGF-1的3'UTR 沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性作用機(jī)制[19]，有類(lèi)似的研究驗(yàn)證miR-139 與miRNA let-7b 能靶向負(fù)調(diào)控GHR3'UTR，進(jìn)一步介導(dǎo)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[20]，所以miR-146b-3p 也有可能通過(guò)結(jié)合GHR3'UTR 靶位點(diǎn)來(lái)抑制GHR的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步影響生長(zhǎng)基因IGF-1的表達(dá)，從而導(dǎo)致從江香豬的生長(zhǎng)速度低于大白豬。此外，GHR在大白豬心臟、腎臟、大腸、小腸、背最長(zhǎng)肌、脂肪中的表達(dá)量均高于從江香豬，IGF-1在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、背最長(zhǎng)肌中均顯著高于從江香豬[21]，而本研究miR-146b-3p 的表達(dá)量相反，在從江香豬各組織中的表達(dá)量均顯著高于大白豬，進(jìn)一步顯示miR-146b-3p 可能是生長(zhǎng)速度相關(guān)的差異基因。

此外，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建的miR-146b-3p 真核載體轉(zhuǎn)染至從江香豬肌細(xì)胞中，從細(xì)胞分子水平檢測(cè)miR-146b-3p 對(duì)GHR表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 在從江香豬肌細(xì)胞中超表達(dá)后，能夠使GHR的表達(dá)極顯著下調(diào)，而IGF-1表達(dá)量下調(diào)不顯著，這與Ouyang[13]發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 通過(guò)靶向結(jié)合GHR的3'UTR 使GHR下調(diào)的結(jié)果一致，表明miR-146b-3p 能夠通過(guò)影響生長(zhǎng)相關(guān)GHR與IGF-1的表達(dá)來(lái)影響豬的生長(zhǎng)。

綜上，miR-146b-3p 在從江香豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能扮演著至關(guān)重要的角色，對(duì)進(jìn)一步探究miR-146b-3p的功能及挖掘新的特色基因奠定基礎(chǔ)，為解析從江香豬生長(zhǎng)緩慢、個(gè)體矮小成因機(jī)制提供了理論支撐。

4 結(jié)論

除心臟與大腸外，miR-146b-3p 在從江香豬其余組織中的表達(dá)量均顯著高于大白豬，并在從江香豬肌細(xì)胞中超表達(dá)后使GHR表達(dá)量極顯著下降，揭示miR-146b-3p 可能對(duì)GHR存在負(fù)向調(diào)控作用，進(jìn)一步調(diào)控豬生長(zhǎng)發(fā)育。本研究為解析從江香豬生長(zhǎng)緩慢與地方豬種的遺傳改良提供了重要參考數(shù)據(jù)。