轉(zhuǎn)hTERT 基因牛胎盤滋養(yǎng)層細胞生長及分泌特性研究

李茜茹，邢 凱，蘇 月，李博宇，蘇運澤，王春偉，郭 勇，肖龍菲，齊曉龍，盛熙暉，倪和民，王相國*

（1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第七師畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830000）

胎盤是妊娠期間維持胎兒生長發(fā)育的器官，由胎盤滋養(yǎng)層細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及二者之間的基膜構(gòu)成[1]。早期絨毛組織中主要為滋養(yǎng)層細胞（Trophoblast Cell）[2]，在胎盤發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。滋養(yǎng)層細胞在桑葚胚時期形成，后分化形成細胞滋養(yǎng)層細胞（Cytotrophoblast Cells）和絨毛外滋養(yǎng)層細胞（Extravillous Trophoblast Cells，ETCs）。細胞滋養(yǎng)層細胞繼續(xù)形成合體滋養(yǎng)層細胞，參與營養(yǎng)、分泌和代謝等過程[3]；絨毛外滋養(yǎng)層細胞主要通過遷移和侵襲作用侵入子宮內(nèi)膜，在胚胎附植、血管重塑[4]及胎盤形成等方面均有重要作用。因此，滋養(yǎng)層細胞異常形態(tài)及功能障礙往往是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的誘因[5]。

王專家等[6]探索了綿羊多核絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的體外分離培養(yǎng)方法并進行了細胞鑒定。趙志文等[7]采用聯(lián)合消化法對牦牛胎盤滋養(yǎng)層細胞進行分離純化，優(yōu)化培養(yǎng)體系。目前很多研究通過體外培養(yǎng)獲取該細胞后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)依舊受到很大限制。端粒酶的過度表達與細胞癌變及細胞永生有關(guān)。有研究將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）基因?qū)胝＜毎?，利用端粒酶異常表達，使細胞獲得旺盛的增殖能力[8]。這一研究為導(dǎo)入hTERT基因延長細胞生長周期提供了可能。本研究嘗試將外源hTERT基因?qū)朐ＬケP滋養(yǎng)層細胞，使其獲得更強的增殖能力，并通過多種方法鑒定其生物學特征，以獲得更有效的體外培養(yǎng)細胞，從而為后續(xù)實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 完整妊娠 45～60 d 健康牛子宮采自河北省大廠縣某屠宰場，妊娠時間根據(jù)胎兒的頂臀長度計算。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo 公司），BCA 蛋白定量檢測試劑盒（北京Leagene 公司），兔抗牛角蛋白7 抗體、兔抗牛波形蛋白抗體、兔抗牛端粒酶抗體及兔抗牛E-鈣黏蛋白抗體均（美國Abcam 公司）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），高速臺式離心機（德國Eppendorf 公司），凝膠成像儀（美國Alpha Inotech 公司）。

1.3 牛胎盤滋養(yǎng)層細胞分離培養(yǎng) 取妊娠45～60 d 的完整牛子宮低溫運輸至實驗室。清洗后在無菌環(huán)境下打開，取出完整胎盤放于含雙抗的DPBS 液中清洗。剪下胎盤子葉，浸入75%酒精15～30 s，立即放入新的DPBS 緩沖液內(nèi)清洗。處理好的胎盤組織剪碎至1～2 cm3置于細胞瓶內(nèi)，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h 后，顛倒觀察無脫落，向瓶內(nèi)補加含雙抗的20% DMEM/F12 完全培養(yǎng)基2 mL。于補液后24 h 和48 h 時進行細胞換液，之后每3 d 換液，至細胞爬出后進行純化傳代。棄去培養(yǎng)液，用DPBS 清洗后加入1 mL 胰蛋白酶，熱臺上放置1 min，細胞變圓有部分漂浮時加入完全培養(yǎng)基終止消化，移液槍輕吹至全部漂浮后移入離心管，1 500 r/min、5 min。棄上清，適量培養(yǎng)基重懸細胞，置入新培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1 h，取上清液種入新培養(yǎng)瓶。

1.4pc1-neo-hTERT質(zhì)粒純化及鑒定 采用OMEGA 公司生產(chǎn)的Endo-free plasmid midi kit 按照說明書操作步驟進行質(zhì)粒提取。利用Nanodrop 2000 紫外分光光度計檢測質(zhì)粒的濃度和純度，分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物hTERT-F：5'-TATGCTGTGGTCCAGAAGG-3'；hTERT-R：5'-CAAGAAATCATCGACCAAACG-3'。將提取的pCI-neo-hTERT質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切體系：1 μL 10×限制性內(nèi)切酶緩沖液（Buffer H），0.5 μLEcoRI（12 U/μL），0.5 μLSalI（12 U/μL），0.25 μL BSA（10 mg/mL），4 μL DNA，3.75 μL ddH2O。渦旋儀充分混勻，37℃ 2 h，65℃ 10 min，加入2 μL 6×DNA 上樣緩沖液，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5hTERT基因轉(zhuǎn)染牛胎盤滋養(yǎng)層細胞 確定新霉素（G418）最佳篩選濃度。第2 代牛胎盤滋養(yǎng)層細胞接種于24 孔板，生長至70%～80%，加入不同濃度G418（100、150、200、250、300、350、400 μg/mL）篩選培養(yǎng)基，每個梯度3 個重復(fù)，培養(yǎng)基3 d 一換，選取2 周內(nèi)殺死所有細胞的最小濃度。采用Lipofectamine 2000 Regent 轉(zhuǎn)染試劑將pc1-neo-hTERT質(zhì)粒導(dǎo)入原代細胞，含最佳篩選濃度G418（300 μg/mL）的DMEM/F12 培養(yǎng)基，待2 周后對照孔細胞全部死亡，遞減G418濃度至獲得單克隆細胞。利用Western Blot 檢測hTERT基因表達情況。

1.6 免疫熒光檢測各組細胞角蛋白7（CK7）將滅菌蓋玻片置于6 孔板中，按1×105個細胞/孔接種，待細胞至70%～80%進行后續(xù)實驗。棄液后DPBS 洗3 次，4% 多聚甲醛固定，室溫30 min，0.1% TritonX-100 通透，室溫10 min，1% BSA-PBS 封閉，室溫30 min，棄液DPBS 充分清洗3 次，每次3 min，分別加入兔抗牛細胞角蛋白7 抗體（CK7，1:100）和兔抗牛波形蛋白抗體（Vim，1:100），4℃過夜。棄液DPBS 充分清洗，F(xiàn)ITC 標記的鼠抗兔IGg（1:50）避光孵育，室溫2 h，棄液DPBS 充分清洗，PI 染核10 min，棄液DPBS 充分清洗，用熒光顯微鏡拍照。

1.7 酶聯(lián)免疫檢測絨毛膜促性腺激素（CG）、胎盤催乳素（PL）收集細胞培養(yǎng)液，低溫離心，分裝保存于-20℃。實驗開始前將各試劑平衡至室溫，并充分混勻。設(shè)標準孔、空白孔、待測樣品孔，按照ELISA 試劑盒說明書進行CG、PL 檢測，均進行3 次重復(fù)。最后利用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。

1.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用軟件Excel 2010 進行整理，對ELISA 檢測獲得的OD 值進行獨立樣本t檢驗，結(jié)果均以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1pc1-neo-hTERT質(zhì)粒鑒定pc1-neo-hTERT質(zhì)粒全長8 900 bp，hTERT基因片段長3 450 bp。利用EcoRI 和SalI 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切片段與預(yù)期大小一致（圖1），表明提取的質(zhì)粒確為pc1-neohTERT質(zhì)粒，且可用于細胞轉(zhuǎn)染。

圖1 雙酶切法鑒定pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒

2.2 牛胎盤滋養(yǎng)層細胞形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察培養(yǎng)的牛胎盤子葉組織塊，第7 天開始，組織塊周圍遷出細胞，細胞形態(tài)多樣，呈圓形、長梭形或不規(guī)則多邊形，分布不均勻（圖2-A）；經(jīng)差速貼壁法純化后，大多數(shù)細胞輪廓清晰（圖2-B、C），細胞在低密度時出現(xiàn)偽足（圖2-D、E），密度增加至鋪滿后呈鋪路石狀，單層生長（圖2-F），均勻分布，為上皮樣細胞形態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后細胞形態(tài)及生長狀態(tài)均無變化，表明轉(zhuǎn)染外源hTERT基因的牛胎盤滋養(yǎng)層細胞不受其影響。

圖2 原代牛胎盤滋養(yǎng)層細胞與轉(zhuǎn)染hTERT 基因細胞

2.3 轉(zhuǎn)染前后細胞特征鑒定 通過Western Blot 檢測，顯示hTERT基因轉(zhuǎn)染成功且能夠正常表達（圖3-A）。通過免疫熒光組化鑒定培養(yǎng)的原代牛胎盤滋養(yǎng)層細胞與轉(zhuǎn)染后細胞均表達CK7（圖3-B），且純化分離的細胞沒有成纖維細胞污染。

圖3 轉(zhuǎn)染前后細胞蛋白表達情況

2.4 轉(zhuǎn)染前后細胞表達功能檢測 通過酶聯(lián)免疫檢測方法對轉(zhuǎn)染后細胞與原代牛胎盤滋養(yǎng)層細胞中分泌的CG和PL 檢測結(jié)果顯示，與原代細胞的分泌水平差異不顯著（表1）。

表1 轉(zhuǎn)染前后細胞CG、PL 分泌情況

3 討論

組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶消化法是目前原代細胞獲取最常用的方法。Tzschoppe 等[9]采用胰蛋白酶-DNaseI酶聯(lián)合消化法獲得細胞懸液，又采用Percoll 密度梯度離心法獲得純度較高的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞。劉慧等[10]采用組織塊法獲得滋養(yǎng)層細胞，又用差速消化法獲得純度較高的綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細胞。王專家等[6]改良劉慧等[10]有關(guān)綿羊胎盤滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng)方法，用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化法會獲得滋養(yǎng)層細胞，使細胞產(chǎn)量和質(zhì)量有所提升。胰蛋白酶法獲得的細胞液混雜有大量成纖維細胞、紅細胞及其他細胞，對滋養(yǎng)層細胞的生長有限制。組織塊培養(yǎng)法獲得的細胞純度更高，但耗時較長，通常10～20 d 才會出現(xiàn)細胞。本研究聯(lián)合使用組織塊培養(yǎng)法與酶消化法，獲取的體外培養(yǎng)細胞純度高、活性好，且耗時較短，培養(yǎng)第7 天即出現(xiàn)細胞。第二、三代原代細胞增殖效率快，細胞活性高，可用做大多數(shù)研究。但繼續(xù)傳代至五、六代時，細胞活性明顯下降。孕早期的滋養(yǎng)層細胞隨著妊娠過程的推進，其增殖分化能力逐漸下降。體外培養(yǎng)的細胞也出現(xiàn)可連續(xù)傳代次數(shù)少或隨傳代細胞活性下降的問題。端粒是位于線性真核生物染色體末端的、重復(fù)DNA 序列和蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜核蛋白[11]，可防止染色體降解并能修復(fù)DNA 復(fù)制過程中末端丟失序列[12-13]，其合成由一個特殊的具有反轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白酶——端粒酶完成。端粒酶是RNA 模板和蛋白亞基組成的核蛋白顆粒，能解決染色體末端問題，該基因過度表達可使細胞獲得更強的增殖分化能力。

本研究利用導(dǎo)入外源hTERT基因使細胞獲得連續(xù)增殖分化的能力。轉(zhuǎn)染后的細胞通過不斷優(yōu)化的培養(yǎng)體系，成功連續(xù)傳至十五代以上，暫稱為hTERT-btc 細胞株。經(jīng)Western Blot 檢測，hTERT基因成功轉(zhuǎn)染且能夠正常表達，相比原代細胞，hTERT-btc 細胞株端粒酶活性顯著增加，細胞在連續(xù)傳代過程中細胞活性保持良好。經(jīng)熒光免疫檢測，轉(zhuǎn)染前后細胞中CK7 表達正常，無顯著差異[14-15]。妊娠過程中，CG 和PL 的分泌是胎盤滋養(yǎng)層細胞的重要生物學功能之一。通過酶聯(lián)免疫檢測CG、PL 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后細胞分泌無顯著差異[15]。胎盤滋養(yǎng)層細胞為上皮樣細胞，體外培養(yǎng)的第二代btc 與第十五代hTERT-btc 均單層貼壁生長，低密度下伸出偽足相互接觸，細胞呈多樣性，密度增加逐漸形成鋪路石樣，呈典型上皮樣細胞體外生長特點。胎盤滋養(yǎng)層細胞作為胎盤中的主要功能細胞，在整個妊娠過程中發(fā)揮重要作用，通過遷移、侵襲和內(nèi)分泌等功能，在胎盤形成、妊娠建立與胎兒發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hTERT基因后，細胞獲得更強的增殖分化能力，且仍具有正常的生物學功能，CK7 正常表達，CG、PL 表達量處于正常范圍。

胎盤是雌性哺乳動物在妊娠期間出現(xiàn)的重要臨時性器官，早期的胚胎絨毛組織中，胎盤滋養(yǎng)層細胞可分化為2種：一是絨毛內(nèi)滋養(yǎng)層細胞，包括細胞滋養(yǎng)層細胞和由其融合形成的合體滋養(yǎng)層細胞；二是絨毛外滋養(yǎng)層細胞，與子宮內(nèi)膜緊密接觸、侵入其中以保證胎盤穩(wěn)固[16]。滋養(yǎng)層細胞通過分泌整合素、E-鈣黏蛋白及免疫球蛋白超家族[17]等黏附因子對子宮內(nèi)膜上皮細胞進行識別及黏附，誘導(dǎo)胚胎完成植入。另可分泌表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Gro wth Factor，TGF）和集落刺激因子（Colony Stimulating Factor，CSF）等細胞因子調(diào)節(jié)自身功能[18-20]。滋養(yǎng)層細胞分泌的CG 和孕酮（Progesterone，P）等可維持早期胚胎發(fā)育及妊娠建立，這些因子與母體激素聯(lián)合作用，配合細胞強大的遷移、侵襲功能，對母體子宮內(nèi)膜上皮進行黏附與侵入，最終完成血管重塑與胎盤建立。

本研究通過向原代胎盤滋養(yǎng)層細胞轉(zhuǎn)染外源hTERT基因獲得的細胞株，相較于其他同類細胞，具有穩(wěn)定且增加的傳代數(shù)和正常的生物學特性及生理功能，為后續(xù)相關(guān)研究提供了新的思路與方法，為更多實驗提供參考。