李茜茹,邢 凱,蘇 月,李博宇,蘇運(yùn)澤,王春偉,郭 勇,肖龍菲,齊曉龍,盛熙暉,倪和民,王相國(guó)*
(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師畜牧獸醫(yī)站,新疆烏魯木齊 830000)
胎盤是妊娠期間維持胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的器官,由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及二者之間的基膜構(gòu)成[1]。早期絨毛組織中主要為滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast Cell)[2],在胎盤發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞在桑葚胚時(shí)期形成,后分化形成細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(Cytotrophoblast Cells)和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(Extravillous Trophoblast Cells,ETCs)。細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞繼續(xù)形成合體滋養(yǎng)層細(xì)胞,參與營(yíng)養(yǎng)、分泌和代謝等過(guò)程[3];絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞主要通過(guò)遷移和侵襲作用侵入子宮內(nèi)膜,在胚胎附植、血管重塑[4]及胎盤形成等方面均有重要作用。因此,滋養(yǎng)層細(xì)胞異常形態(tài)及功能障礙往往是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的誘因[5]。
王專家等[6]探索了綿羊多核絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法并進(jìn)行了細(xì)胞鑒定。趙志文等[7]采用聯(lián)合消化法對(duì)牦牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分離純化,優(yōu)化培養(yǎng)體系。目前很多研究通過(guò)體外培養(yǎng)獲取該細(xì)胞后,繼續(xù)傳代培養(yǎng)依舊受到很大限制。端粒酶的過(guò)度表達(dá)與細(xì)胞癌變及細(xì)胞永生有關(guān)。有研究將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)基因?qū)胝<?xì)胞中,利用端粒酶異常表達(dá),使細(xì)胞獲得旺盛的增殖能力[8]。這一研究為導(dǎo)入hTERT基因延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)周期提供了可能。本研究嘗試將外源hTERT基因?qū)朐LケP滋養(yǎng)層細(xì)胞,使其獲得更強(qiáng)的增殖能力,并通過(guò)多種方法鑒定其生物學(xué)特征,以獲得更有效的體外培養(yǎng)細(xì)胞,從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 完整妊娠 45~60 d 健康牛子宮采自河北省大廠縣某屠宰場(chǎng),妊娠時(shí)間根據(jù)胎兒的頂臀長(zhǎng)度計(jì)算。
1.2 試劑與儀器 胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone 公司),Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen 公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo 公司),BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒(北京Leagene 公司),兔抗牛角蛋白7 抗體、兔抗牛波形蛋白抗體、兔抗牛端粒酶抗體及兔抗牛E-鈣黏蛋白抗體均(美國(guó)Abcam 公司)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司),熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司),高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司),凝膠成像儀(美國(guó)Alpha Inotech 公司)。
1.3 牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分離培養(yǎng) 取妊娠45~60 d 的完整牛子宮低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。清洗后在無(wú)菌環(huán)境下打開(kāi),取出完整胎盤放于含雙抗的DPBS 液中清洗。剪下胎盤子葉,浸入75%酒精15~30 s,立即放入新的DPBS 緩沖液內(nèi)清洗。處理好的胎盤組織剪碎至1~2 cm3置于細(xì)胞瓶?jī)?nèi),于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置1 h 后,顛倒觀察無(wú)脫落,向瓶?jī)?nèi)補(bǔ)加含雙抗的20% DMEM/F12 完全培養(yǎng)基2 mL。于補(bǔ)液后24 h 和48 h 時(shí)進(jìn)行細(xì)胞換液,之后每3 d 換液,至細(xì)胞爬出后進(jìn)行純化傳代。棄去培養(yǎng)液,用DPBS 清洗后加入1 mL 胰蛋白酶,熱臺(tái)上放置1 min,細(xì)胞變圓有部分漂浮時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化,移液槍輕吹至全部漂浮后移入離心管,1 500 r/min、5 min。棄上清,適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,置入新培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1 h,取上清液種入新培養(yǎng)瓶。
1.4pc1-neo-hTERT質(zhì)粒純化及鑒定 采用OMEGA 公司生產(chǎn)的Endo-free plasmid midi kit 按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取。利用Nanodrop 2000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒的濃度和純度,分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
引物hTERT-F:5'-TATGCTGTGGTCCAGAAGG-3';hTERT-R:5'-CAAGAAATCATCGACCAAACG-3'。將提取的pCI-neo-hTERT質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,酶切體系:1 μL 10×限制性內(nèi)切酶緩沖液(Buffer H),0.5 μLEcoRI(12 U/μL),0.5 μLSalI(12 U/μL),0.25 μL BSA(10 mg/mL),4 μL DNA,3.75 μL ddH2O。渦旋儀充分混勻,37℃ 2 h,65℃ 10 min,加入2 μL 6×DNA 上樣緩沖液,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.5hTERT基因轉(zhuǎn)染牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞 確定新霉素(G418)最佳篩選濃度。第2 代牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于24 孔板,生長(zhǎng)至70%~80%,加入不同濃度G418(100、150、200、250、300、350、400 μg/mL)篩選培養(yǎng)基,每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù),培養(yǎng)基3 d 一換,選取2 周內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最小濃度。采用Lipofectamine 2000 Regent 轉(zhuǎn)染試劑將pc1-neo-hTERT質(zhì)粒導(dǎo)入原代細(xì)胞,含最佳篩選濃度G418(300 μg/mL)的DMEM/F12 培養(yǎng)基,待2 周后對(duì)照孔細(xì)胞全部死亡,遞減G418濃度至獲得單克隆細(xì)胞。利用Western Blot 檢測(cè)hTERT基因表達(dá)情況。
1.6 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞角蛋白7(CK7)將滅菌蓋玻片置于6 孔板中,按1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種,待細(xì)胞至70%~80%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。棄液后DPBS 洗3 次,4% 多聚甲醛固定,室溫30 min,0.1% TritonX-100 通透,室溫10 min,1% BSA-PBS 封閉,室溫30 min,棄液DPBS 充分清洗3 次,每次3 min,分別加入兔抗牛細(xì)胞角蛋白7 抗體(CK7,1:100)和兔抗牛波形蛋白抗體(Vim,1:100),4℃過(guò)夜。棄液DPBS 充分清洗,F(xiàn)ITC 標(biāo)記的鼠抗兔IGg(1:50)避光孵育,室溫2 h,棄液DPBS 充分清洗,PI 染核10 min,棄液DPBS 充分清洗,用熒光顯微鏡拍照。
1.7 酶聯(lián)免疫檢測(cè)絨毛膜促性腺激素(CG)、胎盤催乳素(PL)收集細(xì)胞培養(yǎng)液,低溫離心,分裝保存于-20℃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將各試劑平衡至室溫,并充分混勻。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行CG、PL 檢測(cè),均進(jìn)行3 次重復(fù)。最后利用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD 值)。
1.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用軟件Excel 2010 進(jìn)行整理,對(duì)ELISA 檢測(cè)獲得的OD 值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果均以平均值表示。
2.1pc1-neo-hTERT質(zhì)粒鑒定pc1-neo-hTERT質(zhì)粒全長(zhǎng)8 900 bp,hTERT基因片段長(zhǎng)3 450 bp。利用EcoRI 和SalI 雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切片段與預(yù)期大小一致(圖1),表明提取的質(zhì)粒確為pc1-neohTERT質(zhì)粒,且可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
圖1 雙酶切法鑒定pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒
2.2 牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察培養(yǎng)的牛胎盤子葉組織塊,第7 天開(kāi)始,組織塊周圍遷出細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)多樣,呈圓形、長(zhǎng)梭形或不規(guī)則多邊形,分布不均勻(圖2-A);經(jīng)差速貼壁法純化后,大多數(shù)細(xì)胞輪廓清晰(圖2-B、C),細(xì)胞在低密度時(shí)出現(xiàn)偽足(圖2-D、E),密度增加至鋪滿后呈鋪路石狀,單層生長(zhǎng)(圖2-F),均勻分布,為上皮樣細(xì)胞形態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)均無(wú)變化,表明轉(zhuǎn)染外源hTERT基因的牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞不受其影響。
圖2 原代牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞與轉(zhuǎn)染hTERT 基因細(xì)胞
2.3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞特征鑒定 通過(guò)Western Blot 檢測(cè),顯示hTERT基因轉(zhuǎn)染成功且能夠正常表達(dá)(圖3-A)。通過(guò)免疫熒光組化鑒定培養(yǎng)的原代牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞均表達(dá)CK7(圖3-B),且純化分離的細(xì)胞沒(méi)有成纖維細(xì)胞污染。
圖3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞蛋白表達(dá)情況
2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表達(dá)功能檢測(cè) 通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞與原代牛胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中分泌的CG和PL 檢測(cè)結(jié)果顯示,與原代細(xì)胞的分泌水平差異不顯著(表1)。
表1 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞CG、PL 分泌情況
組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶消化法是目前原代細(xì)胞獲取最常用的方法。Tzschoppe 等[9]采用胰蛋白酶-DNaseI酶聯(lián)合消化法獲得細(xì)胞懸液,又采用Percoll 密度梯度離心法獲得純度較高的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞。劉慧等[10]采用組織塊法獲得滋養(yǎng)層細(xì)胞,又用差速消化法獲得純度較高的綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞。王專家等[6]改良劉慧等[10]有關(guān)綿羊胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法,用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化法會(huì)獲得滋養(yǎng)層細(xì)胞,使細(xì)胞產(chǎn)量和質(zhì)量有所提升。胰蛋白酶法獲得的細(xì)胞液混雜有大量成纖維細(xì)胞、紅細(xì)胞及其他細(xì)胞,對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)有限制。組織塊培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞純度更高,但耗時(shí)較長(zhǎng),通常10~20 d 才會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞。本研究聯(lián)合使用組織塊培養(yǎng)法與酶消化法,獲取的體外培養(yǎng)細(xì)胞純度高、活性好,且耗時(shí)較短,培養(yǎng)第7 天即出現(xiàn)細(xì)胞。第二、三代原代細(xì)胞增殖效率快,細(xì)胞活性高,可用做大多數(shù)研究。但繼續(xù)傳代至五、六代時(shí),細(xì)胞活性明顯下降。孕早期的滋養(yǎng)層細(xì)胞隨著妊娠過(guò)程的推進(jìn),其增殖分化能力逐漸下降。體外培養(yǎng)的細(xì)胞也出現(xiàn)可連續(xù)傳代次數(shù)少或隨傳代細(xì)胞活性下降的問(wèn)題。端粒是位于線性真核生物染色體末端的、重復(fù)DNA 序列和蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜核蛋白[11],可防止染色體降解并能修復(fù)DNA 復(fù)制過(guò)程中末端丟失序列[12-13],其合成由一個(gè)特殊的具有反轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白酶——端粒酶完成。端粒酶是RNA 模板和蛋白亞基組成的核蛋白顆粒,能解決染色體末端問(wèn)題,該基因過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的增殖分化能力。
本研究利用導(dǎo)入外源hTERT基因使細(xì)胞獲得連續(xù)增殖分化的能力。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞通過(guò)不斷優(yōu)化的培養(yǎng)體系,成功連續(xù)傳至十五代以上,暫稱為hTERT-btc 細(xì)胞株。經(jīng)Western Blot 檢測(cè),hTERT基因成功轉(zhuǎn)染且能夠正常表達(dá),相比原代細(xì)胞,hTERT-btc 細(xì)胞株端粒酶活性顯著增加,細(xì)胞在連續(xù)傳代過(guò)程中細(xì)胞活性保持良好。經(jīng)熒光免疫檢測(cè),轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中CK7 表達(dá)正常,無(wú)顯著差異[14-15]。妊娠過(guò)程中,CG 和PL 的分泌是胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的重要生物學(xué)功能之一。通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)CG、PL 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞分泌無(wú)顯著差異[15]。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞,體外培養(yǎng)的第二代btc 與第十五代hTERT-btc 均單層貼壁生長(zhǎng),低密度下伸出偽足相互接觸,細(xì)胞呈多樣性,密度增加逐漸形成鋪路石樣,呈典型上皮樣細(xì)胞體外生長(zhǎng)特點(diǎn)。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤中的主要功能細(xì)胞,在整個(gè)妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要作用,通過(guò)遷移、侵襲和內(nèi)分泌等功能,在胎盤形成、妊娠建立與胎兒發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hTERT基因后,細(xì)胞獲得更強(qiáng)的增殖分化能力,且仍具有正常的生物學(xué)功能,CK7 正常表達(dá),CG、PL 表達(dá)量處于正常范圍。
胎盤是雌性哺乳動(dòng)物在妊娠期間出現(xiàn)的重要臨時(shí)性器官,早期的胚胎絨毛組織中,胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞可分化為2種:一是絨毛內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞,包括細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和由其融合形成的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞;二是絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞,與子宮內(nèi)膜緊密接觸、侵入其中以保證胎盤穩(wěn)固[16]。滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)分泌整合素、E-鈣黏蛋白及免疫球蛋白超家族[17]等黏附因子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別及黏附,誘導(dǎo)胚胎完成植入。另可分泌表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Gro wth Factor,TGF)和集落刺激因子(Colony Stimulating Factor,CSF)等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)自身功能[18-20]。滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的CG 和孕酮(Progesterone,P)等可維持早期胚胎發(fā)育及妊娠建立,這些因子與母體激素聯(lián)合作用,配合細(xì)胞強(qiáng)大的遷移、侵襲功能,對(duì)母體子宮內(nèi)膜上皮進(jìn)行黏附與侵入,最終完成血管重塑與胎盤建立。
本研究通過(guò)向原代胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源hTERT基因獲得的細(xì)胞株,相較于其他同類細(xì)胞,具有穩(wěn)定且增加的傳代數(shù)和正常的生物學(xué)特性及生理功能,為后續(xù)相關(guān)研究提供了新的思路與方法,為更多實(shí)驗(yàn)提供參考。