產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖的提取和抗血流感染作用的研究

章 楊，周 強(qiáng)，陳禮文，劉 周,韓清珍，史進(jìn)方

產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌(

Corynebacterium

pyruviciproducens

，CP)由Tong et al在1例腹股溝膿腫中發(fā)現(xiàn)的一種革蘭陽性棒狀桿菌。另有研究表明CP與傳統(tǒng)的免疫佐劑痤瘡丙酸桿菌(

Propionibacterium

acnes

)相比，CP的免疫調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)是細(xì)菌細(xì)胞壁的特有組成成分，可以刺激免疫細(xì)胞，發(fā)揮各種免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮該作用的機(jī)制與途徑取決于細(xì)胞壁中PGN的含量與結(jié)構(gòu)。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant

Staphylococcus

aureus

，MRSA)是醫(yī)院血流感染的主要致病菌。通過前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖(CP-PGN)對MRSA血流感染具有明顯的防治效果。為研究CP-PGN對革蘭陰性菌及真菌是否有同樣的抗血流感染作用，該研究選取了醫(yī)院感染中具有代表性的革蘭陰性桿菌-多重耐藥的肺炎克雷伯菌(

Klebsiella

pneumoniae

，KPN)及真菌-白色念珠菌(

Candida

albicans

，CAL)，建立小鼠血流感染模型，探討CP-PGN對不同病原菌的抗血流感染能力，為將細(xì)菌性免疫調(diào)節(jié)劑作為臨床血流感染的一種輔助治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌由美國加州大學(xué)洛杉磯分校 Olive View 醫(yī)學(xué)中心提供；產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提取并保存；多重耐藥的KPN、CAL均為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離株；BABL/c 小鼠6～8周齡，體質(zhì)量(25±2)g，雌性，15～18只，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，按照動(dòng)物房的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

溶菌酶購自美國Amresco公司。酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；超聲破碎儀購自美國SONICS公司；S433D型氨基酸分析儀購自德國SYKAM公司。

1.3 方法

1

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3

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1

CP菌體的制備 將凍存的CP菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，無菌挑取一定量的菌落接種于含5%植物油的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)液離心，收集菌體，最后用無菌生理鹽水多次洗滌離心直至菌體沉淀為乳白色，靜置，待水分自然蒸發(fā)后對其稱重。

1

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3

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2

CP

-

PGN的提取 采用三氯乙酸法(TCA法)提取PGN。取洗滌離心得到的80 g CP菌體，提取步驟主要包括磷壁酸的去除、蛋白的去除、脂類物質(zhì)的去除，再用無水乙醇脫水并稱重(干燥前)，置于70 ℃恒溫烘箱中徹底烘干，最終得到褐色膠狀物(干燥后)。根據(jù)下列公式計(jì)算肽聚糖提取率：

肽聚糖提取率(%)=干燥前肽聚糖重量/收集的菌體重量×100%

1

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3

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3

CP

-

PGN的純度驗(yàn)證 采用溶菌酶溶解試驗(yàn)，用0.1 mol/L pH6.2的PBS將溶菌酶配成200 μg/ml的溶液。將一定量的CP-PGN加入該溶液中配制成5 mg/ml 的終溶液，立即用BioTek酶標(biāo)儀在450 nm處讀取第1個(gè)吸光度值，然后于37 ℃恒溫?fù)u床中140 r/min振蕩反應(yīng)，每小時(shí)讀取1個(gè)吸光度值并記錄。

1

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3

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4

CP

-

PGN的結(jié)構(gòu)分析 將提取的CP-PGN送至科譜研發(fā)技術(shù)中心(青島)有限公司，對其分子量、結(jié)構(gòu)(傅里葉紅外光譜分析)進(jìn)行分析。

1

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3

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5

CP

-

PGN的氨基酸組成 將一定量的提取物與6 mol/L的鹽酸溶液在110 ℃的真空條件下作用20 h，經(jīng)氨基酸分析儀檢測該肽聚糖的氨基酸組成。

1

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3

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6

CP和CP

-

PGN的抗感染動(dòng)物模型構(gòu)建

1

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3

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6

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1

熱滅活的CP及CP-PGN溶液的制備 收集培養(yǎng)48 h后的CP菌液，離心去上清液。再用滅菌PBS離心洗滌沉淀2遍，去上清液。將該沉淀加入滅菌PBS充分混勻，置于62 ℃水浴滅活3 h后，通過將溶液接種于血瓊脂平板培養(yǎng)檢測是否完全滅活。剩余的CP菌液分裝保存?zhèn)溆?。將一定量的固體狀CP-PGN溶解于滅菌PBS中，通過超聲破碎儀進(jìn)行破碎溶解，配制成相應(yīng)濃度的溶液供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1

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3

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6

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2

感染病原菌的制備 將臨床分離的KPN和CAL接種于LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h后的細(xì)菌培養(yǎng)液用滅菌PBS進(jìn)行10、10、10一系列倍數(shù)稀釋，具體操作方法為：分別吸取1 μl KPN/CAL培養(yǎng)液加入到含有999 μl滅菌PBS的滅菌EP管中進(jìn)行10稀釋；將該稀釋液按照同樣的方法再次進(jìn)行10稀釋，配制成稀釋10的稀釋菌液；最后將稀釋10的稀釋菌液分別進(jìn)行10、100、1 000倍稀釋后，將100 μl的該稀釋菌液置于血平板中，用一次性L型無菌涂布棒采用平板涂布法使其均勻分布整個(gè)血平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)平板中的菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)將菌液稀釋成最終注射濃度。

1

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3

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6

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3

動(dòng)物感染模型的構(gòu)建 構(gòu)建KPN/CAL血流感染的動(dòng)物模型。6～8周的BALB/c小鼠隨機(jī)分成對照組(Control組)、產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌組(CP組)和產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖組(CP-PGN組)，每組5～6只。參考相關(guān)文獻(xiàn)對小鼠CP/CP-PGN的最佳注射濃度進(jìn)行多次摸索，注射一定濃度的CP/CP-PGN后，主要根據(jù)小鼠的精神狀態(tài)、活躍程度、呼吸頻率等指標(biāo)確定最佳注射劑量。經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射滅菌PBS、CP(500 μg/只)、CP-PGN(100 μg/只)。24 h后3組小鼠同時(shí)尾靜脈注射KPN(10×10/只)/CAL(1×10/只)菌液。觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況，記錄小鼠的生存時(shí)間。獲取3組小鼠的脾臟組織，對其重量和體積(長×寬×高)進(jìn)行測量和分析。

2 結(jié)果

2.1 CP-PGN提取率的計(jì)算

本次實(shí)驗(yàn)共收集了80 g CP菌體，最終提取的肽聚糖量為0.241 4 g，則該肽聚糖提取率為0.3%。

2.2 溶菌酶溶解實(shí)驗(yàn)

CP-PGN與溶菌酶溶液作用后的吸光度值變化如圖1所示，在最開始的2 h內(nèi)吸光度值大幅度的降低，2 h之后吸光度值趨于穩(wěn)定。表明提取物可以被溶菌酶降解，證實(shí)為肽聚糖。

圖1 肽聚糖的溶菌酶溶解實(shí)驗(yàn)

2.3 CP-PGN的結(jié)構(gòu)分析

圖2顯示CP-PGN的分子量為18 774 u。圖3的傅里葉紅外光譜分析顯示，提取的CP-PGN在3 500～3 200 cm、3 000～2 800 cm、1 400～1 200 cm處存在多糖類物質(zhì)的特征吸收峰；1 650 cm處是酰胺特征吸收峰；862 cm處是β-吡喃糖苷件吸收峰；1 560～1 540 cm處為N-H變角振動(dòng)峰；1 055 cm處有C-O振動(dòng)吸收峰和O-H變角振動(dòng)峰2個(gè)峰。

圖2 肽聚糖分子量分析結(jié)果

圖3 肽聚糖傅里葉紅外光譜分析

2.4 CP-PGN的氨基酸組成及含量

CP-PGN的氨基酸組成及其含量見表1所示，結(jié)果表明CP-PGN的氨基酸組成中，含量較多的依次為谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸。

表1 肽聚糖的氨基酸組成及其含量[n(%)]

2.5 CP-PGN能增強(qiáng)小鼠抗KPN/CAL引起的血

流感染的能力

在小鼠感染KPN/CAL之前，提前注射CP/CP-PGN，可顯著增強(qiáng)小鼠的抵抗力。CP和CP-PGN兩組的小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度等均高于Control組小鼠，CP-PGN組作用更明顯。繪制的生存曲線顯示， CP-PGN能有效延長KPN/CAL感染組小鼠的生存時(shí)間，提高存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，如圖4所示。脾臟是機(jī)體的一種重要免疫器官，它的重量和大小能夠間接反映機(jī)體的免疫功能。感染KPN后，CP組小鼠的脾臟體積和重量明顯大于Control組(

t

=4.824，

P

=0.008；

t

=5.266，

P

=0.004)；而在CAL感染后，CP-PGN組小鼠的脾臟體積和重量明顯大于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=5.639，

P

=0.008；

t

=3.560，

P

=0.02)，說明在感染KPN/CAL之前注射CP或CP-PGN，對小鼠的免疫能力產(chǎn)生不同程度的影響，如圖5、6所示。

圖4 KPN/CAL血流感染模型的小鼠生存曲線與Control組比較：*P<0.05；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

圖5 KPN血流感染模型小鼠的脾臟指標(biāo)與Control組比較：**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

圖6 CAL血流感染模型小鼠的脾臟指標(biāo)(體積與重量)與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

3 討論

肽聚糖作為細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，提取方法多樣。本研究選用了用時(shí)短、操作簡便的三氯乙酸法進(jìn)行CP-PGN的提取。本次研究中CP-PGN的提取率為0.3%。提取后的終產(chǎn)物經(jīng)過相關(guān)驗(yàn)證、分析與檢測，表明提取的褐色膠狀物主要成分即為肽聚糖。不同種類的細(xì)菌，其細(xì)胞壁的厚度及肽聚糖的含量也存在差別，因此用同種方法進(jìn)行肽聚糖的提取也會(huì)造成提取率的不同，這也是本研究中CP-PGN提取率稍低的一個(gè)重要原因。為了提高提取效率，更好地保持其結(jié)構(gòu)的完整性，CP-PGN的提取方法還有待進(jìn)一步的摸索與優(yōu)化。此外，不同種類的細(xì)菌肽聚糖，發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用因肽聚糖的結(jié)構(gòu)與含量不同而存在差異。因此本研究有關(guān)CP-PGN的分子量、結(jié)構(gòu)、氨基酸等方面的分析，為后續(xù)的抗血流感染作用的研究提供理論支持。

血流感染是一種嚴(yán)重的全身性感染疾病，是病原菌在血液循環(huán)中短暫或者持續(xù)性的存在，能夠引起患者多器官衰竭，甚至死亡，對患者的生命健康造成威脅。引起醫(yī)院血流感染的病原菌可分為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌三大類。肺炎克雷伯菌是重要的腸桿菌科細(xì)菌，引起的醫(yī)院內(nèi)感染越來越廣泛，發(fā)生率僅次于凝固酶陰性葡萄球菌，位居醫(yī)院血流感染的革蘭陰性菌第二位。由于廣譜抗生素的過度使用及更新?lián)Q代，肺炎克雷伯菌的耐藥性問題也越來越嚴(yán)重，從而加大了臨床的治療難度。念珠菌是院內(nèi)血流感染位居第四的病原菌，其發(fā)病率和致死率不斷升高。引起念珠菌血流感染的念珠菌種類多，最常見的念珠菌為白色念珠菌。近年來，真菌的耐藥性也在逐漸的加重，從而導(dǎo)致該菌血流感染發(fā)病率的增加。在全球抗生素危機(jī)情況下，需要尋找新的預(yù)防感染及治療方法來應(yīng)對挑戰(zhàn)，而免疫調(diào)節(jié)劑可以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫力，因此聯(lián)合或者代替抗生素應(yīng)用，為血流感染的預(yù)防與治療提供一種新型的治療方案，從而減輕抗生素的使用量。

本研究顯示，在感染KPN/CAL之前，預(yù)先注射CP-PGN，與未注射CP/CP-PGN的對照組相比，小鼠的精神及活動(dòng)狀態(tài)均有所改善，明顯延長了小鼠的生存時(shí)間，提高了生存率，免疫器官-脾臟在體積和重量上都有不同程度的增加，免疫能力有所增強(qiáng)，表明CP-PGN對KPN和CAL引起的血流感染具有一定的預(yù)防作用，可作為一種有潛力的新的免疫調(diào)節(jié)劑，為預(yù)防和治療血流感染提供輔助治療。在面臨抗生素危機(jī)的情況下，將抗生素和合適的免疫調(diào)節(jié)劑組合治療也是一種新的治療方法，從而減少對抗生素的過度依賴，一定程度上緩解全球抗生素危機(jī)。以上有關(guān)CP-PGN抗KPN/CAL血流感染的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，聯(lián)合前期抗MRSA感染作用的數(shù)據(jù)證實(shí)，CP-PGN在血流感染的防治上發(fā)揮著重要作用，而CP-PGN在對抗MRSA/KPN/CAL三種病原菌的感染中發(fā)揮著不同程度的防治效果，造成效果差異的具體機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究，為CP-PGN作為免疫增強(qiáng)劑在臨床上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論支持。