循環(huán)腫瘤細胞分型與非小細胞肺癌臨床病理特征相關(guān)性研究

黃祥奇?李文娟?梁靜?潘宇航?陳健寧?何丹

【摘要】目的 探討不同類型循環(huán)腫瘤細胞（CTC）與非小細胞肺癌（NSCLC）臨床病理特征的相關(guān)性。方法 選取121例NSCLC患者（NSCLC組）作為研究對象，另以40例非腫瘤肺部良性病變患者（良性病變組）和10名健康志愿者（健康對照組）作為對照。采集所有患者靜脈血，使用納米膜富集技術(shù)過濾分離CTC，再用mRNA多重原位雜交法分析檢測CTC上皮或間質(zhì)基因，比較不同組CTC陽性率的差異，探討NSCLC患者CTC與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 NSCLC組患者的CTC陽性率為86%，其中上皮型、混合型、間質(zhì)型陽性率分別為31%、74%及23%;良性病變組的CTC陽性率為15%，其中上皮型、混合型、間質(zhì)型陽性率分別為3%、15%及0%，健康對照組未檢出CTC。NSCLC組CTC陽性率及混合型CTC陽性率均高于良性病變組及健康對照組（P均< 0.017）。121例NSCLC患者中，臨床分期高（Ⅲ ～ Ⅳ期）者的CTC陽性率高于臨床分期低（Ⅰ ～ Ⅱ期）者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1 ～ N3）者的CTC陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N0）者（P均< 0.05）。Spearman秩相關(guān)分析顯示，CTC總數(shù)與臨床分期呈正相關(guān)（rs = 0.254，P = 0.005），其中上皮型CTC（r = 0.202，P = 0.026）、混合型CTC（rs = 0.247，P = 0.006）的數(shù)量均與臨床分期呈正相關(guān)，而間質(zhì)型CTC與臨床分期無關(guān)（P > 0.05）。CTC總數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（rs = 0.218，P = 0.016），其中混合型CTC的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈正相關(guān)（rs = 0.247，P = 0.006），而上皮型CTC及間質(zhì)型CTC的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無關(guān)（P均> 0.05）。結(jié)論 NSCLC患者CTC陽性率與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可考慮作為臨床分期及預后評估的附加指標。

【關(guān)鍵詞】非小細胞肺癌;循環(huán)腫瘤細胞;臨床病理特征

Correlation between types of circulating tumor cells and clinicopathological features of patients with non-small cell lung cancer Huang Xiangqi， Li Wenjuan， Liang Jing， Pan Yuhang， Chen Jianning， He Dan. Department of Pathology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， He Dan， E-mail： hedan76@ 126. com

【Abstract】Objective To explore the correlation between different types of circulating tumor cells （CTCs） and the clinicopathological features of patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods In total， 121 NSCLC patients were assigned into the NSCLC group， 40 patients with benign lung diseases into the benign lung disease group and 10 healthy volunteers into the control group， respectively. The venous blood of all patients was collected， and the epithelial or mesenchymal genes of CTCs in the peripheral blood were detected by Nanofilm enrichment technology and multiple mRNA-ISH analysis. The positive rates of CTCs were statistically compared among different groups. The correlation between CTCs type and clinicopathological characteristics in the peripheral blood of NSCLC patients was analyzed. Results In the NSCLC group， the positive rate of CTCs was 86%， and the positive rates of epithelial， biophenotypic and mesenchymal CTCs were 31% （38/121）， 74% （90/121） and 23% （24/121）， respectively. The positive rates of epithelial， biophenotypic and mesenchymal CTCs in the benign lung lesion group were 3% （3/40）， 15.0% （6/40） and 0% （0/40）， respectively. No CTCs were detected in the healthy volunteers. The positive rate of CTCs and biophenotypic CTCs in the NSCLC group were significantly higher compared with those in the benign lung lesion and healthy control groups. Among 121 NSCLC patients， the positive rate of CTCs in patients with stage Ⅲ and Ⅳ NSCLC was significantly higher than that in their counterparts with stageⅠand Ⅱ NSCLC， and the positive rate of CTCs in patients with lymph node metastasis （N1-N3） was remarkably higher than that in those without lymph node metastasis （N0） （both P < 0.05）. Spearman correlation analysis demonstrated that the total count of CTCs was positively correlated with clinical staging （rs = 0.254， P = 0.005）. The count of epithelial and biophenotypic CTCs was positively associated with clinical staging （rs = 0.202， P = 0.026; rs = 0.247， P = 0.006）， whereas that of mesenchymal CTCs was not correlated with clinical staging （P > 0.05）.? The total count of CTCs was positively correlated with lymph node metastasis （rs = 0.218， P = 0.016）. The count of biophenotypic CTCs was positively associated with lymph node metastasis （rs = 0.247， P = 0.006）， whereas those of epithelial and mesenchymal CTCs were not associated with lymph node metastasis （both P > 0.05）. Conclusion The positive rate of CTCs in the peripheral blood of NSCLC patients is correlated with clinical staging of NSCLC and lymph node metastasis， which can be considered as an additional parameter to evaluate tumor staging and clinical prognosis.

【Key words】Non-small cell lung cancer;Circulating tumor cell;Clinicopathological feature

肺癌是成人中最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)WHO 2018年統(tǒng)計，我國肺癌新增病例數(shù)和死亡人數(shù)均居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡原因首位[1]。非小細胞肺癌（NSCLC）與小細胞肺癌（SCLC）相比，癌細胞生長和分裂相對緩慢，腫瘤的增殖和遠處轉(zhuǎn)移相對較晚，但不幸的是，這些患者在得到明確診斷時，多數(shù)已經(jīng)錯過了最佳手術(shù)時間[2]。如果能更早地獲得準確診斷，NSCLC患者將獲得更全面的術(shù)后復發(fā)評估及治療策略選擇機會，使整體治療效果或生存質(zhì)量有明顯的提升[3]。

循環(huán)腫瘤細胞（CTC）最早是由澳大利亞Thomas Ashwoth于1869年在一名男性轉(zhuǎn)移癌患者的血液中發(fā)現(xiàn)[4]。CTC是從腫瘤組織中脫離出來的腫瘤細胞，通過血管內(nèi)壁進入血液循環(huán)，進行遠處播散和轉(zhuǎn)移[5]。近年的多項研究表明，干細胞特性的CTC具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的能力，是肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸、肺癌等惡性腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的主要始動因素，在臨床分期中具有潛在應用價值，可預測多種實體瘤的預后。但由于富集技術(shù)和鑒定方法的不確定性，目前尚無用于肺癌臨床的CTC檢測方法[6]。因此，本研究采用納米膜過濾富集技術(shù)，進一步用mRNA多重原位雜交法檢測其類型，分析不同類型CTC與NSCLC臨床病理特征相關(guān)性及其在臨床應用中的價值。

對象與方法

一、研究對象

選擇2016年3月至2019年10月在我院住院的121例NSCLC患者（NSCLC組）作為研究對象，患者年齡59 （31，78） 歲，其中男76例、女45例。另外選取同期在我院住院的40例非腫瘤肺部良性病變患者（良性病變組）和10名健康志愿者（健康對照組）作為對照，入選者年齡50（22，83）歲，男14例、女36例。NSCLC組納入標準：病理診斷為NSCLC。排除標準：合并其他惡性腫瘤。良性病變組和健康對照組納入標準：病理及臨床診斷排除惡性腫瘤的肺部良性病變患者或健康人。研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入組者均已經(jīng)簽署知情同意書。

二、組織學評估

收集121例NSCLC術(shù)中切除標本及活組織檢查（活檢）標本以4%中性緩沖甲醛固定，采用石蠟包埋，3.5 μm厚切片，HE染色光鏡下觀察。根據(jù)“2015年WHO肺部腫瘤組織學分類標準”，由1名中級和1名副高級病理專科醫(yī)師同時診斷。具體根據(jù)組織學診斷，分為肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌及大細胞癌。

三、CTC檢測方法

分別收集3組的外周血，采用益善公司Can PatrolTM CTC 二代技術(shù)，先使用納米膜過濾分離CTC，再用基于分支DNA信號擴增技術(shù)進行RNA原位雜交，根據(jù)EMT標志物區(qū)分不同類型CTC。操作如下：將患者外周血5 ml移入乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，用連通器轉(zhuǎn)移至紅細胞裂解緩沖液處理完全混合30 min，室溫下1850轉(zhuǎn)/分離心5 min，然后用直徑8 μm納米膜過濾器進行分離和過濾，一般固定后，在1 ml 50%、70%、100%梯度乙醇脫水各2 min。細胞消化預處理后，使用上皮細胞黏附分子（EpCAM）、細胞角蛋白8（CK8）、CK18、CK19、波形蛋白（VIM）、TWIST轉(zhuǎn)錄因子1（TWIST1）和CD45基因RNA捕獲探針40℃充分雜交3 h，洗滌后用支鏈DNA信號擴增探針40 ℃進行30 min擴增放大，使用顯色緩沖液40℃溫育20 min，最后DAPI染液復染全自動掃描鏡檢。

四、結(jié)果判定標準

根據(jù)核型特征及不同顏色熒光表達水平對細胞進行分型：鏡下細胞核上有紅色信號基因表達EpCAM（+）、CK8（+）、CK18（+）、CK19（+）且DAPI（+）、CD45（-）為上皮型CTC;有綠色信號基因表達VIM（+）、TWIST1（+）且DAPI（+）、CD45（-）為間質(zhì)型CTC;有紅色及綠色兩種熒光同時表達為混合型CTC;有白色熒光信號點表達CD45（+）為非CTC;紅綠白信號點均以≥7為有效表達。同一細胞僅出現(xiàn)上述其中一種表達，同一患者可以同時出現(xiàn)上述4種細胞，總的CTC數(shù)量為上皮型、間質(zhì)型和混合型CTC數(shù)量之和。CTC數(shù)量≥3個/5 ml定為陽性，反之為陰性。

五、統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。計量資料因不符合正態(tài)分布，故用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示;計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，兩兩比較采用Bonferroni法;等級資料相關(guān)性應用Spearman秩相關(guān)分析。α= 0.05。

結(jié)果

一、CTC分型檢測結(jié)果

上皮型CTC、間質(zhì)型CTC、混合型CTC的表達見圖1。

二、NSCLC組、良性病變組及健康對照組各型CTC陽性率比較

NSCLC患者CTC陽性率及混合型CTC均高于良性病變組及健康對照組（P均< 0.017），良性病變組與健康對照組3種型別CTC陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表1。

三、不同臨床病理特征NSCLC患者的CTC陽性率分布

121例NSCLC患者中，臨床分期高（Ⅲ ～ Ⅳ期）者的CTC陽性率高于臨床分期低（Ⅰ ～ Ⅱ期）者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1 ～ N3）者的CTC陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N0）者（P均< 0.05）。不同性別、年齡、是否吸煙、有無胸腔積液、組織分型、腫瘤大小間NSCLC患者CTC陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表2。

四、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CTC數(shù)量的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析顯示，CTC總數(shù)與臨床分期呈正相關(guān)（rs = 0.254，P = 0.005），其中上皮型CTC（rs = 0.202，P = 0.026）、混合型CTC的數(shù)量均與臨床分期呈正相關(guān)（rs = 0.247，P = 0.006），而間質(zhì)型CTC與臨床分期無關(guān)（P > 0.05）。CTC總數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（rs = 0.218，P = 0.016），其中混合型CTC的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈正相關(guān)（rs = 0.247，P = 0.006），而上皮型CTC及間質(zhì)型CTC的數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無關(guān)（P均> 0.05），見表3。

討論

近年來，為了追求精準的腫瘤治療，對腫瘤靶向分子的精準檢測提出更高的要求。NSCLC的精準治療需要高度依賴腫瘤驅(qū)動基因的檢測。然而，單純活檢并不能反映腫瘤的所有分子改變。要持續(xù)監(jiān)測和了解腫瘤耐藥進展中的分子變化，就不可避免地會對患者產(chǎn)生影響，進行復雜的有創(chuàng)性二次活檢。目前，CTC作為液體活檢三駕馬車之一，為腫瘤患者實現(xiàn)腫瘤動態(tài)監(jiān)測開辟了新的可能。由于外周血易于獲得，且可以均質(zhì)化的反映腫瘤細胞的全貌，對其可行性的研究也越來越多。因此，循環(huán)中的腫瘤細胞作為動態(tài)觀察腫瘤預后的重要手段之一越來越受到重視[7]。

本研究通過對121例NSCLC患者、40例非腫瘤肺部良性病變和10名健康志愿者的CTC計數(shù)結(jié)果顯示，NSCLC 患者CTC陽性率高于良性病變組和健康對照組。值得注意的是，有6例良性病變組患者CTC呈陽性。此前，有針對168例COPD患者進行CTC檢測的報道，6例陽性患者在隨后的1～4年中肺部出現(xiàn)了小結(jié)節(jié)，最終被確診為早期原位癌[8]。CTC檢測可能是NSCLC重要的早期篩查手段之一[9]。

本研究中，NSCLC組不同性別、年齡、吸煙、有無胸腔積液、病理組織學分型、腫瘤分化程度、腫瘤大小者其CTC陽性比較差異均無統(tǒng)計學意義，但CTC陽性率與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。相關(guān)性分析表明，臨床分期為Ⅲ ～ Ⅳ期患者陽性檢出率及CTC總個數(shù)高于Ⅰ ～ Ⅱ期患者，且NSCLC臨床分期總CTC數(shù)呈正相關(guān)，說明分期水平越高，CTC陽性率越高。Wei等[10]對73例不同臨床階段的NSCLC患者進行了CTC檢測，發(fā)現(xiàn)Ⅳ期患者CTC多于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者，與本研究結(jié)果基本一致。因此，CTC檢測可考慮作為臨床分期指標的潛在補充，使目前的分期方法更為準確，更好地反映患者預后[11]。

與結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等實體瘤等一樣，腫瘤轉(zhuǎn)移幾乎成為患者死亡的直接原因。同時，CTC已被證實與多種實體瘤患者的生存期相關(guān)，有望成為獨立于TNM分期的一種新的預后評估生物標記物[12]。鑒于CTC作為早期診斷和治療指標的重要性，本研究分析了CTC與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示NSCLC患者的CTC陽性率與總CTC數(shù)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。經(jīng)亞組分析，上皮型和間質(zhì)型CTC數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，混合型CTC與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。同時筆者還注意到，CTC陽性以混合型為主，提示CTC經(jīng)歷EMT的過程或疾病向嚴重發(fā)展[13]。這些數(shù)據(jù)有助于闡明CTC在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用。然而，亦有研究者用同類檢測方法得出不同結(jié)論，Xie等[14]的研究中僅間質(zhì)型CTC與NSCLC臨床病理分期呈正相關(guān)，而上皮型CTC和混合型CTC與TNM分期無關(guān)。這可能與不同實驗室不同解釋標準和技術(shù)方法的穩(wěn)定性有關(guān)，說明該技術(shù)的穩(wěn)定性還有改進空間。

綜上所述，NSCLC患者中CTC的檢出率較高，且與臨床病理特征有一定關(guān)系，可為NSCLC篩查提供一種參考手段，也可作為臨床分期的一個潛在附加指標。但由于CTC富集分離技術(shù)方法多樣性，以及腫瘤細胞鑒定方法的優(yōu)缺點，目前不同實體瘤的診斷界值也沒有統(tǒng)一標準，NSCLC患者CTC與腫瘤TNM的相關(guān)性與臨床應用仍存在爭議[15-19]。由于本研究樣本量較少，仍有必要進一步進行多中心的臨床研究加以驗證。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-04-20）

（本文編輯：林燕薇）