基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信號(hào)通路的玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝作用機(jī)制研究

馬國(guó)萍，陳 丹，陳 紅，熊朝棟，余文靜

基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信號(hào)通路的玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝作用機(jī)制研究

馬國(guó)萍1, 2，陳 丹1*，陳 紅2*，熊朝棟1，余文靜1

1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122 2. 福建省立醫(yī)院 干部特診科，福建 福州 350001

探究玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝作用及其分子機(jī)制。建立預(yù)防性高脂血癥（hyperlipidemia）大鼠病理模型，以非諾貝特、辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥，考察玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)；采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)大鼠肝臟腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）及過(guò)氧化物酶增殖物激活受體α（peroxidase proliferators activate receptors α，PPARα）信號(hào)通路相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)。預(yù)防性給藥玳玳果黃酮后，與模型組相比，各劑量玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥大鼠血脂及肝臟脂肪變性均有明顯的改善作用（＜0.05、0.01）；可促AMPK磷酸化，使其mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.05、0.01）；顯著抑制并明顯下調(diào)SREBP-1c、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）蛋白和mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；可促進(jìn)PPARα、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-l）蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（＜0.05、0.01）。玳玳果黃酮可有效改善脂質(zhì)代謝紊亂，防治高脂血癥。其作用機(jī)制是通過(guò)激活A(yù)MPK促其磷酸化，從而抑制脂質(zhì)合成，促進(jìn)脂肪酸氧化分解，由此減少脂肪沉積，發(fā)揮調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用。

玳玳果黃酮；脂質(zhì)代謝；腺苷酸激活蛋白激酶；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白；過(guò)氧化物酶增殖物激活受體

現(xiàn)代社會(huì)隨著人口老齡化及生活和飲食習(xí)慣的改變，患高脂血癥（hyperlipidemia）的人群不斷增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅人類健康。藥物治療是目前調(diào)控脂質(zhì)代謝異常的主要方法，但臨床上使用的化學(xué)類調(diào)脂藥物存在諸多毒副作用。因此，尋找有效而低毒的調(diào)脂中藥，探討其調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制，具有十分重要的意義。玳玳L(zhǎng). var.Tanaka（Daidai）又稱代代，是蕓香科柑桔亞屬植物，酸橙的變種，未成熟果實(shí)稱玳玳花枳殼或蘇枳殼[1]；據(jù)《飲片新參》[2]記載：“玳玳性微寒，味苦、酸，有行氣寬中、消食、化痰的功能，藥食同源”。課題組前期研究表明，由玳玳果制備的有效部位提取物玳玳果黃酮[3]具有良好的調(diào)血脂、抗氧化作用[4-5]；該提取物的主要效應(yīng)組分為新橙皮苷及柚皮苷，并已明確了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)處置過(guò)程，經(jīng)體內(nèi)外質(zhì)量評(píng)價(jià)，提取物組分群整體表征穩(wěn)定[6-7]。

腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種能量傳感器，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、調(diào)節(jié)脂肪含量、影響脂質(zhì)代謝平衡的關(guān)鍵酶蛋白[8-9]?；罨疉MPK磷酸化，若激活下游分子通路信號(hào)，既可增加能量的分解代謝（如脂肪酸氧化分解代謝）又可能關(guān)閉合成代謝（如脂質(zhì)的從頭合成途徑），是脂質(zhì)代謝的2條重要通路[10-12]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated peceptor α，PPARα）分別是調(diào)控脂質(zhì)從頭合成途徑與脂肪酸氧化分解代謝途徑中的重要的轉(zhuǎn)錄因子[13-16]，其下游的關(guān)鍵靶基因還包括乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，F(xiàn)AS）、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransterase-1，CPT-l）等[17-19]。因此，為探究玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制，基于AMPK/SREBP-1c、ACC、FAS及PPARα、CPT-l調(diào)控脂質(zhì)代謝的重要信號(hào)通路關(guān)鍵酶，以臨床上常用的調(diào)脂藥物非諾貝特（Fenofibrate）、辛伐他?。⊿imvastatin）為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)預(yù)防性高脂血癥大鼠病理模型實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)低、中、高劑量玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)代謝作用，并進(jìn)一步考察玳玳果黃酮是否通過(guò)激活A(yù)MPK促進(jìn)其磷酸化（p-AMPK）上調(diào)，由此對(duì)其下游的脂質(zhì)從頭合成途徑以及脂類氧化分解代謝途徑的靶基因和蛋白產(chǎn)生影響，闡釋玳玳果黃酮體現(xiàn)其整體作用的調(diào)控脂質(zhì)代謝的多靶點(diǎn)分子作用機(jī)制，為玳玳果黃酮的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電泳轉(zhuǎn)模儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ChemiDocXRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；C1000TMTermalcircle PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystem公司）；DM4000B LED光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；HFUU586超低溫冰箱（美國(guó)ThermoFisherScientific）等。

1.2 試藥

玳玳果黃酮[3]（自制，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.83%，批號(hào)20171114）；辛伐他汀片（規(guī)格20 mg/片，批號(hào)H20171161，杭州默沙東制藥有限公司產(chǎn)品），非諾貝特膠囊（規(guī)格200 mg/粒，批號(hào)H20160155，法國(guó)利博福尼制藥公司）?？偰懝檀迹╰otal cholesterol，TC，批號(hào)20180104）、三酰甘油（triglycerides，TG，批號(hào)20180605）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號(hào)20180107）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號(hào)20180317）等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)20171216）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)080919190917）、增強(qiáng)型RIPA裂解液（批號(hào)080919180723）均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20180904，蘇州宇恒生物技術(shù)有限公司）。RNA提取試劑盒（貨號(hào)R401-01）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)R123-01）、CPT-1抗體（貨號(hào)15184-1-AP）均購(gòu)自南京諾維贊生物科技公司；AMPKα抗體（貨號(hào)10929-2-AP）、ACC抗體（貨號(hào)21923-1-AP）、FAS/CD95抗體（貨號(hào)13098-1-AP）、SREBP1抗體（貨號(hào)14088-1-AP）、PPARα抗體（貨號(hào)15540-1-AP）、β-actin抗體（貨號(hào)66009-1-ig）、羊抗鼠IgG（H＋L）、羊抗兔IgG（H＋L）等均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；phospho-AMPK（Thr172）抗體（貨號(hào)bs-4002R，北京博奧森生物技術(shù)公司）。中性樹脂、組織包埋盒等購(gòu)自索萊寶科技有限公司。

1.3 飼料

大鼠基礎(chǔ)飼料（福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；高脂飼料（HD001，北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司），總熱量比為4.7 kcal/grm，熱量百分比為蛋白質(zhì)19.8%、碳水化合物35.2%、脂肪45.0%。

1.4 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，7～8周齡，56只，體質(zhì)量（260±10）g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±4）℃，環(huán)境濕度（50±5）%，晝夜12 h交替，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。定點(diǎn)投喂，自由飲水，每日更換飲水及飼料。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)SYXK（閩）2014-0005。實(shí)驗(yàn)操作均按照福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)要求嚴(yán)格執(zhí)行（批準(zhǔn)號(hào) [2018] 福中醫(yī)倫理審字第（031）號(hào)）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、高脂血癥模型組、非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組（Fen）、辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組（Sim）及玳玳果黃酮低、中、高劑量組，每組8只。

2.2 藥液制備

2.2.1 玳玳果黃酮藥液 精密稱取玳玳果黃酮適量，加0.5% CMC-Na生理鹽水，分別配制成質(zhì)量濃度為0.012、0.024、0.036 g/mL的低、中、高劑量玳玳果黃酮藥液。

2.2.2 陽(yáng)性藥液 非諾貝特膠囊臨用前配制成4 mg/mL的非諾貝特陽(yáng)性藥液。辛伐他汀片臨用前配制成0.4 mg/mL的辛伐他汀陽(yáng)性藥液。

2.3 給藥方案及造模

對(duì)照組大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組及各給藥組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)。對(duì)照組和模型組大鼠以0.01 g/(kg·d) 劑量ig 0.5% CMC-Na生理鹽水。Sim組大鼠以0.004 g/(kg·d) 劑量ig辛伐他汀陽(yáng)性藥液，F(xiàn)en組以0.04 g/(kg·d) 劑量ig非諾貝特陽(yáng)性藥液。玳玳果黃酮低、中、高劑量組大鼠分別以0.12、0.24、0.36 g/(kg·d) 劑量（參照課題組前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]，按人體與鼠體表面積換算，從生藥量折算）ig玳玳果黃酮藥液。預(yù)防性給藥，模型組及各給藥組高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)每天9:00～10:00 ig給藥1次，連續(xù)給藥45 d。大鼠自由飲水。

實(shí)驗(yàn)期間，觀察大鼠的一般情況、飲食狀況、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況等，每天監(jiān)測(cè)各組大鼠進(jìn)食量。每周稱量各組大鼠體質(zhì)量并記錄。直至45 d時(shí)，從對(duì)照組、模型組分別隨機(jī)取3只大鼠，眼眶取血，分離血清，檢測(cè)其中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量，判斷高脂血癥模型是否制備成功。

2.4 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，血液室溫靜置30 min后，3000 r/min離心15 min，分離血清。分離肝臟，稱質(zhì)量并根據(jù)公式計(jì)算臟器指數(shù)。取部分肝臟組織，分裝于不同凍存管，置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱保存，用于相關(guān)基因、蛋白指標(biāo)的測(cè)定。

臟器指數(shù)＝臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量

2.5 血清及肝臟脂質(zhì)含量測(cè)定

取部分肝臟右葉組織制作勻漿，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書提供的方法，分別測(cè)定大鼠血清、肝臟組織中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

2.6 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠肝臟，肉眼觀察肝臟組織外觀形態(tài)及色澤。采用常規(guī)石蠟包埋、切片制片、HE染色，經(jīng)脫水、透明、中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)病理變化。

2.7 大鼠肝臟組織相關(guān)指標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，提取大鼠肝臟組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。

實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)蛋白基因、、、、、等內(nèi)參序列，由上海尚亞生物技術(shù)公司代為設(shè)計(jì)并合成引物（訂單編號(hào)SY805387）。引物序列見表1。

2.8 大鼠肝臟組織相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)量檢測(cè)

取各組大鼠的肝臟組織，加入RIPA裂解液裂解勻漿，AMPK提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、ACC、FAS、PPARa、CPT-1抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。室溫二抗孵育1～2 h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)曝光條帶，使用 Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

表1 各引物序列

2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的影響

3.1.1 大鼠一般狀況與攝食量變化 給藥期間，各組大鼠均無(wú)死亡，對(duì)照組大鼠精神狀況良好，靈敏多動(dòng)，皮毛整潔光亮，飲食飲水正常，大小便正常，體質(zhì)量保持穩(wěn)定增長(zhǎng)。模型組大鼠反應(yīng)較遲鈍，不活躍，常靜臥不動(dòng)，毛色光亮，飲食飲水量及尿量明顯增多，部分大鼠大便稀軟異味重，體質(zhì)量明顯增加；而玳玳果黃酮低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的一般狀況較模型組均有明顯改善。

實(shí)驗(yàn)前3周，大鼠的攝食量逐漸增多，至實(shí)驗(yàn)第5周后各組大鼠的攝食量趨于穩(wěn)定，模型組總體攝食量水平高于對(duì)照組，對(duì)照組的攝食水平總體趨于穩(wěn)定。陽(yáng)性對(duì)照組及玳玳果黃酮各劑量組，實(shí)驗(yàn)初期由于ig的刺激及藥物干預(yù)，攝食量有所下降，但在ig適應(yīng)后各組的攝食量又恢復(fù)上升，且經(jīng)造模后各組大鼠的體質(zhì)量較造模前均明顯增加。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠攝食量變化

3.1.2 各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量與肝指數(shù)變化 高脂飲食誘導(dǎo)造模45 d后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)均明顯增加（0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及玳玳果黃酮各劑量組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)均不同程度明顯降低（＜0.05）。提示玳玳果黃酮的干預(yù)可不同程度降低大鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)，中劑量組和高劑量組表現(xiàn)尤為突出，高劑量組的降低作用與陽(yáng)性對(duì)照組相近。結(jié)果見表2。

表2 給藥45 d后大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟指數(shù) ()

與對(duì)照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05

#< 0.05control group;*< 0.05model group

3.1.3 對(duì)大鼠肝臟勻漿脂質(zhì)含量影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟勻漿TG、TC、LDL-C含量均顯著升高，HDL-C含量均顯著降低（＜0.01），提示高脂血癥大鼠模型成功。與模型組相比，玳玳黃酮低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠肝勻漿TG、TC、LDL-C含量均顯著降低（＜0.01），HDL-C含量均顯著提高（＜0.01）。提示玳玳果黃酮表征出調(diào)控肝勻漿脂質(zhì)積聚的作用，且呈劑量依賴性。其中，玳玳果黃酮中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組效果相當(dāng)；高劑量組調(diào)控TC、HDL-C的效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見表3。

3.1.4 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組大鼠肝臟顏色呈暗紅色，質(zhì)地均勻，表面光滑，邊緣銳利，有韌性；模型組大鼠肝臟顏色呈偏黃泛白，表面明顯彌漫性腫大，邊緣較厚且多不規(guī)則，質(zhì)脆并有油膩感，肝臟體積較其他組明顯增大，切面呈極為明顯花斑狀；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及玳玳果黃酮各劑量組大鼠的肝臟顏色呈現(xiàn)不同程度的灰紅色，其中Fen組的顏色趨于暗紅色，肝臟質(zhì)地松軟，表面較光滑，有不同程度花斑；玳玳果黃酮組肝臟顏色、質(zhì)地均有好轉(zhuǎn)，中、高劑量組好轉(zhuǎn)明顯。提示玳玳果黃酮具有改善肝組織脂質(zhì)積聚作用。結(jié)果見圖2。

表3 玳玳果黃酮對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響()

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01

##< 0.01control group;**< 0.01model group

圖2 各組大鼠肝臟形態(tài)

3.1.5 大鼠肝臟病理學(xué)組織切片觀察 對(duì)照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常，未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞排列為以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴分布。模型組大鼠肝臟出現(xiàn)重度彌漫性脂肪病變，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等、數(shù)量不一的彌散性空泡狀脂滴，為典型的脂肪肝。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量干預(yù)后，大鼠肝細(xì)胞脂肪變性均呈現(xiàn)出不同程度的改善，胞漿內(nèi)脂滴空泡數(shù)減少，體積變??；Fen組的肝細(xì)胞腫大和泡狀脂肪變性基本恢復(fù)正常，肝竇清晰可見，胞漿質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于肝細(xì)胞中央，與對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本一致，偶見脂滴；Sim組大鼠的肝細(xì)胞脂肪變性程度為輕度，胞漿內(nèi)中等細(xì)小脂滴較少，脂滴泡不大，但仍有少量大脂滴。提示玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥大鼠肝組織脂肪變性具有較明顯的改善作用，具有良好的調(diào)脂預(yù)防和治療作用，且呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見圖3。

3.1.6 玳玳果黃酮對(duì)大鼠血清脂質(zhì)含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，均具有極顯著性差異（＜0.01），提示高脂血癥大鼠模型造模成功。與模型組相比，玳玳果黃酮低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，大鼠血清TG、TC、LDL-C含量均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C含量均顯著升高（＜0.05、0.01）。提示玳玳果黃酮具有調(diào)控血清脂質(zhì)TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的作用，效果與陽(yáng)性對(duì)照藥相當(dāng)，且呈一定的劑量相關(guān)性。其中，玳玳果黃酮降低血清TC含量水平趨勢(shì)明顯，調(diào)控HDL-C含量水平的效果優(yōu)于辛伐他汀，而與非諾貝特相似。結(jié)果見表4。

圖3 肝臟病理組織切片圖(10×40倍鏡)

表4 玳玳果黃酮對(duì)大鼠血清脂質(zhì)含量的影響 ()

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.2 玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥模型大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟mRNA及p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮中、高劑量組及Sim組的大鼠肝臟mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性，玳玳果黃酮上調(diào)效果與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，其中玳玳果黃酮高劑量組上調(diào)效果最佳。與模型組比較，玳玳果黃酮不同劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠肝臟p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（＜0.05、0.01），玳玳果黃酮各劑量組表征的效果與陽(yáng)性對(duì)照藥組相當(dāng)。提示高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥可引起大鼠肝臟mRNA及p-AMPK蛋白表達(dá)水平下調(diào)；玳玳果黃酮、陽(yáng)性對(duì)照藥辛伐他汀、非諾貝特均可使mRNA及p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，可激活A(yù)MPK磷酸化。結(jié)果見圖4。

3.3 玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥模型大鼠肝臟SREBP-1c、ACC、FAS蛋白和mRNA表達(dá)的影響

3.3.1 高脂血癥模型大鼠肝臟SREBP-1c蛋白和mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯升高（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮不同劑量組及陽(yáng)性對(duì)照藥組的大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），其中提取物高劑量組的抑制效果介于陽(yáng)性對(duì)照Sim組與Fen組之間。提示玳玳果黃酮可顯著抑制高脂血癥大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果見圖5。

3.3.2 高脂血癥模型大鼠肝臟ACC蛋白和mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟ACC蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮不同劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照藥組的大鼠肝臟ACC蛋白及mRNA表達(dá)水平均不同程度顯著降低（＜0.01），玳玳果黃酮各劑量組對(duì)大鼠肝臟mRNA表達(dá)的抑制效果介于陽(yáng)性對(duì)照Sim組與Fen組之間；玳玳果黃酮高劑量組抑制大鼠肝臟ACC蛋白表達(dá)水平效果優(yōu)于Sim組，與Fen組相當(dāng)，并呈劑量相關(guān)性。提示玳玳果黃酮可使ACC蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低，其中高劑量組與Fen組效果相當(dāng)。結(jié)果見圖6。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3.3.3 高脂血癥模型大鼠肝臟FAS蛋白和mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（＜0.05、0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥組的大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01），其中玳玳果黃酮中、高劑量組及Sim組對(duì)大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)顯著。提示玳玳果黃酮可顯著抑制高脂血癥大鼠肝臟FAS 蛋白及mRNA表達(dá)水平上調(diào)，使其在大鼠肝臟中表達(dá)水平明顯降低。結(jié)果見圖7。

3.4 玳玳果黃酮對(duì)高脂血癥模型大鼠肝臟PPARα、CPT-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響

3.4.1 高脂血癥模型大鼠肝臟PPARα蛋白和mRNA表達(dá)影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照藥組的大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；玳玳果黃酮各劑量組升高大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達(dá)水平的效果明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。提示玳玳果黃酮可明顯抑制高脂血癥大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)，使其表達(dá)水平顯著升高。結(jié)果見圖8。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.4.2 高脂血癥模型大鼠肝臟CPT-1蛋白和mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯降低（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照藥組的大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；玳玳果黃酮各劑量組升高大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)水平的效果與陽(yáng)性對(duì)照藥基本相當(dāng)。提示玳玳果黃酮可明顯抑制高脂血癥大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)，使CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高。結(jié)果見圖9。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

4 討論

研究表明[10-11]，他汀類的代表藥物之一辛伐他汀可顯著降低體內(nèi)TC和LDL-C水平，多用于高膽固醇癥治療，可通過(guò)激活A(yù)MPK，調(diào)節(jié)下游受體蛋白SREBP和PPARs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低TC及膽固醇酯的生成，減少內(nèi)源性脂肪酸的合成；非諾貝特是貝特類調(diào)脂藥物的代表，可顯著降低體內(nèi)TG和LDL-C水平，同時(shí)也有增高HDL-C水平的作用，且作為PPARα配體的激活劑，可通過(guò)激活與其編碼相關(guān)的脂肪酸氧化蛋白基因，在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)脂蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)TG水解及脂肪酸氧化，減少肝臟中LDL的合成與分泌。故實(shí)驗(yàn)選擇辛伐他汀與非諾貝特為陽(yáng)性對(duì)照藥。

本研究采用預(yù)防性高脂血癥病理模型實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)作用。結(jié)果證實(shí)，玳玳果黃酮可顯著改善高脂血癥大鼠體質(zhì)量及肝脂比等體征狀態(tài)；可有效降低高脂血癥大鼠血清及肝勻漿的TC、TG和LDL水平，提升HDL-C水平；病理學(xué)切片結(jié)果顯示，玳玳果黃酮可明顯改善大鼠脂肪肝組織病變，且均表現(xiàn)出良好的劑量相關(guān)性。提示玳玳果黃酮具有良好的防治高脂血癥的作用，可有效調(diào)控改善脂質(zhì)代謝紊亂，且對(duì)TC、HDL-C水平的調(diào)控效果尤為顯著。

AMPK是機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵性蛋白靶點(diǎn)，SREBP-1c主要分布在肝臟、脂肪組織及大鼠骨骼肌中，可促進(jìn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄合成，影響相關(guān)靶點(diǎn)ACC、FAS等表達(dá)，SREBP-1c的過(guò)度表達(dá)將引起脂質(zhì)代謝紊亂，而激活A(yù)MPK可下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)，從而抑制TG和脂肪酸的合成[12-16]。PPARα主要在肝臟、腸道及心臟組織中高表達(dá)，能誘導(dǎo)肝臟的線粒體脂肪酸氧化的限速酶CPT-1表達(dá)，AMPK激活后蛋白磷酸化，可上調(diào)PPARα和CPT-l的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體對(duì)脂肪酸的利用和氧化[16-19]。預(yù)試驗(yàn)表明，玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)作用與AMPK存在量效關(guān)系，并表征出多靶點(diǎn)的特性。故實(shí)驗(yàn)提出基于AMPK，探究玳玳果黃酮調(diào)控脂質(zhì)作用與AMPK及其下游信號(hào)通路靶點(diǎn)SREBP-1c、ACC、FAS及PPARα、CPT-l信號(hào)通路的相關(guān)性，闡釋其調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用靶點(diǎn)、通路及機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥模型大鼠可引起肝臟mRNA和p-AMPK蛋白表達(dá)水平下調(diào)，使SREBP-1c、ACC和FAS的蛋白及mRNA表達(dá)均明顯升高，PPARα、CPT-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低。預(yù)防性給藥玳玳果黃酮后，可顯著激活大鼠肝臟組織的AMPK，促使其磷酸化，使mRNA和p-AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，顯著下調(diào)和抑制SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白和mRNA表達(dá)；同時(shí)，明顯促進(jìn)PPARα、CPT-1蛋白和mRNA表達(dá)水平的顯著提升。

綜上所述，玳玳果黃酮可通過(guò)激活A(yù)MPK促其磷酸化，從而抑制AMPK下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控抑制下游脂質(zhì)生成相關(guān)靶點(diǎn)FAS、ACC表達(dá)，抑制脂質(zhì)從頭合成，降低肝臟脂質(zhì)的生成；同時(shí)，玳玳果黃酮的干預(yù)可上調(diào)脂質(zhì)代謝信號(hào)通路關(guān)鍵酶PPARα蛋白及mRNA表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)控增加下游脂質(zhì)代謝相關(guān)酶CPT-1的表達(dá)，提高酶活性，促進(jìn)脂肪酸氧化分解；由此起到調(diào)控改善脂質(zhì)代謝紊亂，減少脂質(zhì)沉積的作用。該研究結(jié)果也為探究中藥多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控脂質(zhì)代謝作用提供了有益的研究思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Studies on mechanism of lipid metabolism regulation ofvar.flavonoids extract based on AMPK/SREBP-1 and PPARα pathway

MA Guo-ping1, 2, CHEN Dan1, CHEN Hong2, XIONG Chao-dong1, YU Wen-jing1

1. Department of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China 2. Cadre Special Department, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, China

To explore the lipid metabolism regulation effect and molecular mechanism of flavonoids from Daidai (L. var.Tanaka) fruit.The hyperlipidemia (HLP) rat pathological model was established, and Fenofibrate and Simvastatin were used as positive control drugs to explore the effect of different doses of flavonoids from Daidai fruit on the regulation of lipid metabolic mechanism. The morphology of liver tissues was observed by light microscope. Real-time quantitative PCR (qRT-PCT) and Western blotting were used to measure the mRNA and the protein levels that are related to adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK), sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c), and peroxidase proliferators activate receptors α (PPARα) signal pathway of rat liver tissues respectively.As compared to the model group, the result showed dose dependency after preventive administration of flavonoids from Daidai fruit, each dose of flavonoids from Daidai fruit were significantly able to improve blood lipid and liver steatosis in the hyperlipidemia rats (< 0.05, 0.01); promote the phosphorylation of AMPK, and increase the levels of mRNA and protein expression for AMPK significantly (< 0.05, 0.01); significantly inhibit and down-regulate the levels of mRNA and protein expression for SREBP-1c, fatty acid synthase (FAS), and acetyl CoA carboxylase (ACC) (< 0.05, 0.01); increase the levels of mRNA and protein expression for PPARα and carnitine palmityl transferase-1 (CPT-1) (< 0.05, 0.01).The flavonoids from Daidai fruit can effectively improve lipid metabolism disorder and prevent hyperlipidemia. Its mechanism of action is to activate AMPK to promote its phosphorylation, which inhibits lipid synthesis and promotes the oxidative decomposition of fatty acids, thereby reducing fat deposition and regulating lipid metabolism.

flavonoids ofvar.fruit; lipid metabolism; adenosine monophosphate activated protein kinase; sterol regulatory element binding protein-1c; peroxidase proliferators activate receptors α

R285

A

0253 - 2670(2021)21 - 6598 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.018

2021-04-15

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018J01253）；福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目（2016-CX-45）；福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010Y2004）

馬國(guó)萍（1992—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評(píng)價(jià)。Tel: 18344980693 E-mail: 1342341856@qq.com

陳 丹（1961—），女，博士，教授。Tel: 13515026709 E-mail: 2536282060@qq.com

陳 紅（1966—），女，學(xué)士，主任醫(yī)師。Tel: 18950339443 E-mail: chyed@sina.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]