基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機(jī)制

姜 晨，徐榮佳，崔師妍，徐鵬昊，夏澤魯，楊洪濤

基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機(jī)制

姜 晨，徐榮佳，崔師妍，徐鵬昊，夏澤魯，楊洪濤*

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心 腎病科，天津 300384

采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS/MS）挖掘益腎化濕顆粒的主要成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)益腎化濕顆粒主要成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并運(yùn)用TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分靶點(diǎn)；采用GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得IgA腎病的疾病靶點(diǎn)，對(duì)藥效疾病靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，進(jìn)一步運(yùn)用Cytoscape_v3.8.2構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)；應(yīng)用Atuodock軟件對(duì)篩選靶點(diǎn)及主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)模擬驗(yàn)證。共鑒定出益腎化濕顆粒主要成分68個(gè)，包括香豆素類、三萜類和黃酮類等化合物；共獲得益腎化濕顆粒治療IgA腎病活性成分43個(gè)，活性成分與疾病交集靶點(diǎn)74個(gè)，其中包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ、皮質(zhì)醇受體基因等；涉及通路包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路等。分子對(duì)接結(jié)果顯示，柴胡皂苷A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、澤瀉醇A與IgA腎病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)有良好的結(jié)合活性。益腎化濕顆粒能夠通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善類固醇效應(yīng)等治療IgA腎病，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

益腎化濕顆粒；IgA腎??；HPLC-Q-TOF-MS/MS；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；柴胡皂苷A；黃芪甲苷III；黃芪甲苷IV；澤瀉醇A

IgA腎病是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最常見的慢性進(jìn)展性原發(fā)性腎小球疾病。盡管大部分患者呈良性進(jìn)展，但仍有10%～25%的患者于10年后進(jìn)展至終末期腎臟病，因其難治性及發(fā)展迅速的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響著公眾健康。目前其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有效的治療方法（如糖皮質(zhì)激素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷劑等）仍存在爭(zhēng)議。近30年，中醫(yī)藥治療IgA腎病療效顯著，并在藥理學(xué)、多系統(tǒng)組學(xué)研究等方面取得重大進(jìn)展。因此，在難治性慢性腎臟病領(lǐng)域發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)，深入探索中醫(yī)藥治療IgA腎病的有效方法及藥物確切作用機(jī)制意義重大。

益腎化濕顆粒的主要藥效物質(zhì)包含香豆素類、三萜類和黃酮類等成分。目前文獻(xiàn)報(bào)道了以現(xiàn)代色譜技術(shù)鑒定益腎化濕顆粒中重要藥味的化學(xué)成分，如盧秋梅等[1]以薄層色譜法定性和高效液相色譜法測(cè)定處方中人參、黃芪、甘草、黃連、陳皮、獨(dú)活、白芍的主要化學(xué)成分。但由于鑒定的藥物數(shù)目不全、藥物化學(xué)成分?jǐn)?shù)目較少等原因，尚不能較系統(tǒng)地反映益腎化濕顆粒的整體化學(xué)成分特征。目前，由于中藥復(fù)雜體系的科學(xué)內(nèi)涵與中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方優(yōu)化、中藥活性成分篩選及辨識(shí)等方面表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步研究提供了重要手段。

基于此，本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-Q-TOF-MS/MS），并以鑒定得到的化學(xué)成分為切入點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其預(yù)防或治療IgA腎病的活性成分和作用靶點(diǎn)，通過基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)分析其作用特點(diǎn)，進(jìn)一步采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，為深入研究益腎化濕顆粒主要活性成分治療IgA腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑

益腎化濕顆粒（10 g/袋，批號(hào)20201118）購(gòu)自廣州康臣藥業(yè)有限公司；色譜級(jí)甲酸購(gòu)自阿拉丁公司；乙醇（分析純）購(gòu)自購(gòu)自北京化工廠；純水使用Mill-Q純水機(jī)制備。

1.2 儀器

HPLC-Q-TOF-MS/MS（美國(guó)Waters公司）；萬分之一電子天平（海精密科學(xué)儀器有限公司）；渦旋儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；移液槍（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SHIZ-95B型循環(huán)式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/）；ETCM網(wǎng)站（www.tcmip.cn/ etcm/index.php/ home/index/index.html）；SymMAP網(wǎng)站（http://www.symmap.org/）；Meatascape網(wǎng)站（https://metascape.org/gp/index.html）；Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）；Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// www.pharmgkb.org）；TID數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab. net/ttd）；DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank. ca）；Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）；RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）；PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；Cytoscape 3.7.2軟件；Autodock Vina 1.5.6軟件；MassLynx V4.2軟件；Pymol 2.5.1軟件。

2 方法

2.1 供試品的制備

取益腎化濕顆粒（碾成粉末）100 mg，置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，加入水適量，超聲溶解，放冷至室溫后定容，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液于4 ℃保存。

2.2 色譜條件

Waters X select HSS T3 C18色譜柱（210 mm×1.8 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；樣品室溫度為4 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；載氣體積流量為3.0 L/min；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），洗脫程序：0～11 min，16% B；11～22 min：6%～28% B；22～32 min，28%～47% B；32～40 min，7%～63% B；40～42 min，63%～85% B；42～48 min，85%～100% B；48～50 min，1% B。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，V模式；正、負(fù)離子模式；負(fù)離子模式：Lockmass采用LEA（[M－H]?553.277 5）；正離子模式：Lockmass采用LEA（[M＋H]＋555.293 1）。毛細(xì)管電壓為2.5 kV；錐孔電壓為45 V；離子源溫度為100 ℃；脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氮?dú)怏w積流量為600 L/h；錐孔氣體積流量為50 L/h；采樣頻率0.1 s，間隔0.02 s；/50～1700；碰撞能為21 eV。

2.4 益腎化濕顆?；钚猿煞趾桶悬c(diǎn)篩選

以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為篩選條件，利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得成分的分子式，在TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù)搜集益腎化濕顆?；钚猿煞?，通過挖掘文獻(xiàn)補(bǔ)充靶點(diǎn)。

2.5 IgA腎病疾病靶點(diǎn)篩選

IgA腎病疾病靶點(diǎn)的搜集以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞，檢索5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、DrugBank），通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白信息轉(zhuǎn)化為Uniprot ID，合并重復(fù)靶點(diǎn)基因，與獲得的成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對(duì)獲取交集靶點(diǎn)。

2.6 互作關(guān)系靶點(diǎn)關(guān)系與信號(hào)通路分析

將IgA腎病、益腎化濕顆粒主成分交集靶點(diǎn)經(jīng)metascape平臺(tái)注釋進(jìn)行蛋白互作（protein protein interaction，PPI）分析，應(yīng)用MCODE算法識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的模塊。對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行通路和過程富集分析，對(duì)其進(jìn)行功能進(jìn)行描述。并通過metascape平臺(tái)輸出的KEGG及GO分析結(jié)果輸入cytoscape軟件進(jìn)行可視化。

2.7 活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

利用Atuodock軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。選擇度值≥5、OB≥30%，從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載候選蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的二維結(jié)構(gòu)文件，通過去水、加氫、轉(zhuǎn)換格式，對(duì)接結(jié)果參考結(jié)合能大小，對(duì)接能量值≤?25.10 kJ/mol表示有較好的結(jié)合活性，利用Pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出優(yōu)化。

3 結(jié)果

3.1 益腎化濕顆粒成分鑒定

益腎化濕顆粒的提取總離子流圖（total ion chromatography，TIC）見圖1，通過對(duì)負(fù)離子模式的成分解析，MassLynxV4.2工作站得到可能的元素組成，對(duì)誤差小于10以內(nèi)的分子式進(jìn)行文獻(xiàn)匹配，共獲得68個(gè)主峰化合物，包括香豆素類化合物（A）、三萜類化合物（B）、黃酮類化合物（C）、苷類化合物（D）、異喹啉類生物堿（E）、內(nèi)酯類化合物（F）、醇類化合物（G）、酚類化合物（H）、有機(jī)酸類化合物（I），結(jié)合出峰先后進(jìn)行順序標(biāo)號(hào)見表1，與文獻(xiàn)報(bào)道益腎化濕顆粒的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一致[1]。

圖1 正離子模式下益腎化濕顆?？傠x子流圖

表1 益腎化濕顆粒成分鑒定

續(xù)表1

峰號(hào)來源化合物tR/min分子式相對(duì)分子質(zhì)量m/zMS/MS編號(hào) 理論值實(shí)際值 57羌活香豆酸39.81C6H4O4140.092 3141.093 3141.092 675.443 9, 53.240 3F3 58生姜10-姜辣醇40.28C21H34O4350.490 8351.492 0351.491 8213.368 9, 138.089 9G1 59陳皮檸檬苦素40.41C26H30O8470.511 6471.513 3471.513 8369.454 9, 287.080 5B18 60人參人參皂苷Rb243.56C53H90O221 079.262 11 080.263 61 080.263 9433.188 9, 369.488 5, 263.194 5B3 61生姜6-姜烯酚43.60C17H24O3276.372 6277.373 6277.373 7124.736 7, 64.723 4G3 62黃芪黃芪皂苷II43.82C43H70O15827.002 4828.003 6828.003 9385.601 3, 68.367 9B12 63黃芪黃芪甲苷44.12C41H68O14784.971 6785.973 7785.973 2204.458 5, 148.422 6B14 64黃連藥根堿44.52C20H20NO4338.382 1339.383 9339.383 9243.499 4, 130.822 7E2 65黃芪黃芪皂苷III44.55C43H70O15827.002 4828.002 4828.003 0468.041 9, 268.200 0B13 66甘草異甘草苷45.28C21H22O9418.392 6419.394 2419.393 8366.681 1, 109.463 8C9 67人參人參皂苷Re45.70C48H82O18947.151 0948.151 4948.151 3498.586 3, 420.388 4, 197.679 9B4 68茯苓茯苓酸49.10C33H52O5528.761 3529.761 7529.761 9434.552 7, 248.597 9B6

3.2 益腎化濕顆?；钚猿煞趾妥饔冒悬c(diǎn)篩選

由表1可知，益腎化濕顆粒主要成分包括芍藥苷、柴胡皂苷A、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、人參皂苷Rg1、黃芪皂苷、茯苓酸等，基本反映了益腎化濕顆粒的化學(xué)物質(zhì)組成。選取鑒定的全部益腎化濕顆?；钚猿煞肿鳛槟繕?biāo)成分，其中61個(gè)成分被PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，利用TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取235個(gè)成分的相關(guān)靶點(diǎn)。另外7個(gè)成分如紫花前胡苷元、去甲升麻素、5-去甲川陳皮素等由于相關(guān)研究不多，未找到作用靶點(diǎn)。構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明有43個(gè)成分參與調(diào)控IgA腎病的分子網(wǎng)絡(luò)，其中茯苓酸、川陳皮素等在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中影響程度較大，同時(shí)具有良好的OB，可為益腎化濕顆粒預(yù)防或治療IgA腎病提供新的活性成分。

3.3 IgA腎病疾病靶點(diǎn)篩選

以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞，檢索5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、Drug Bank），得到1415個(gè)與IgA腎病相關(guān)的作用靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白信息轉(zhuǎn)化為Uniprot ID，合并重復(fù)靶點(diǎn)基因，與獲得的成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對(duì)，最終獲得74個(gè)治療IgA腎病潛在的靶點(diǎn)基因（圖2），并經(jīng)metascape平臺(tái)注釋進(jìn)行PPI分析，應(yīng)用MCODE算法識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的模塊。對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行通路和過程富集分析，對(duì)其進(jìn)行功能進(jìn)行描述。根據(jù)值，保留3個(gè)最佳評(píng)分項(xiàng)描述相應(yīng)模塊的功能（圖3），主要與急性炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子正向調(diào)節(jié)、CD4＋T細(xì)胞因子產(chǎn)生、生長(zhǎng)發(fā)育、白細(xì)胞分化等過程相關(guān)，其中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase pi-1，GSTP1）、IL-1β、核受體亞家族3C組成員2（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、核受體視黃酸X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRA）、原癌基因（JUN）、核因子-κB（nuclear factor kappa B subunit，NF-κB）為篩選的核心靶點(diǎn)。

圖2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

圖3 藥物與疾病交集靶點(diǎn)PPI分析

3.4 互作靶點(diǎn)及通路分析

GO功能注釋是通過生物過程（cellular component，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。如圖4所示，交集靶點(diǎn)涉及藥物反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)及結(jié)合、急性炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)反應(yīng)、氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞增殖、白細(xì)胞分化等20個(gè)BP條目；膜筏、薄膜側(cè)面、無花果酶1顆粒、細(xì)胞質(zhì)小泡腔、囊泡腔等9個(gè)CC條目；轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、類固醇激素受體活性等13個(gè)CC條目。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

對(duì)BP富集條目展示對(duì)應(yīng)藥效靶點(diǎn)，其中GSTP1與炎癥、脂代謝、營(yíng)養(yǎng)及藥物反應(yīng)密切相關(guān)（圖5）。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶家族在解毒和抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、NF-κB、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路的相互作用參與抗炎、促凋亡過程，在以系膜細(xì)胞增殖為主的IgA腎病中提供潛在的治療機(jī)制。

圖5 BP富集條目對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

如圖6所示，益腎化濕顆?？赡芡ㄟ^作用于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等治療IgA腎病。

圖6 交集靶點(diǎn)KECG富集分析

3.5 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選擇KEGG通路富集結(jié)果前20條中的與IgA腎病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的14條信號(hào)通路，集中展示活性成分對(duì)作用靶點(diǎn)的所在通路。43個(gè)主要活性成分可能通過作用于74個(gè)靶點(diǎn)，在14條信號(hào)通路中發(fā)揮作用，繪制益腎化濕顆?！盎钚猿煞?疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)交互機(jī)制圖（圖7）。

3.6 益腎化濕顆粒活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接

利用Atuodock軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明活性成分中均與8個(gè)核心蛋白結(jié)合能均≤?25.10 kJ/mol，柴胡皂苷A與TNF結(jié)合能最高為?39.71 kJ/mol，澤瀉醇A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷Ⅳ、柴胡皂苷A、人參皂苷結(jié)合能較高（表2），部分蛋白和化合物的分子對(duì)接情況見圖8。

圖7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

表2 核心活性成分與核心蛋白結(jié)合能

圖8 部分蛋白和化合物的分子對(duì)接圖

4 討論

益腎化濕顆粒為李杲《脾胃論》之名方“升陽(yáng)益胃湯”化裁而來，此方乃東垣治所生受病肺經(jīng)之方，后世在臨床實(shí)踐中逐漸擴(kuò)大了此方的應(yīng)用范圍，將此方用于治療IgA腎病便是其中之一。IgA腎病在中醫(yī)學(xué)屬“尿血”“水腫”“腎風(fēng)”“尿濁”等范疇，以本虛標(biāo)實(shí)為基本病機(jī)特點(diǎn)，本虛以脾腎氣虛為主，標(biāo)實(shí)以濕熱及水濕之邪為常。國(guó)醫(yī)大師張琪教授強(qiáng)調(diào)脾胃失調(diào)是慢性腎病的病機(jī)關(guān)鍵，善于以脾論治慢性腎臟病[2]。楊洪濤教授傳承發(fā)展了張琪教授從脾治腎思想，探索以益腎化濕顆粒治療IgA腎病[3]。益腎化濕顆粒中重用黃芪為君，以升陽(yáng)固表、益氣利水；配伍人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草補(bǔ)氣養(yǎng)胃；柴胡、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)為升舉清陽(yáng)、祛風(fēng)除濕；半夏、陳皮、澤瀉、黃連除濕清熱；白芍固護(hù)陰液，防升陽(yáng)祛風(fēng)燥濕太過；全方共奏益腎健脾、升陽(yáng)化濕、祛風(fēng)利水之功效。既往臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，益腎化濕顆?？烧{(diào)節(jié)慢性微炎癥狀態(tài)、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、減輕氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[4-8]。本研究發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆粒的43個(gè)活性成分與74個(gè)IgA腎病疾病靶點(diǎn)密切相關(guān)，并通過14條信號(hào)通路發(fā)揮作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示，黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、柴胡皂苷A、人參皂苷、澤瀉醇A等活性成分與IgA腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接分?jǐn)?shù)較高，表明有良好的的結(jié)合活性。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)合PPI分析，得到益腎化濕顆粒可通過TNF、IL-6、IL-1β、PPARγ、GSTP1、NF-κB、NR3C1、RXRA、JUN等9個(gè)核心基因調(diào)控IgA腎病。

脾虛證是IgA腎病中醫(yī)病機(jī)本虛證的主要體現(xiàn)，脾虛運(yùn)化障礙下，水谷精微轉(zhuǎn)運(yùn)異常，引發(fā)能量代謝障礙，可促使線粒體功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，健脾益氣之法可調(diào)控線粒體自噬水平，在修復(fù)IgA腎病損傷組織中起調(diào)節(jié)作用[9]。PI3K/Akt通路是參與細(xì)胞自噬與調(diào)亡的關(guān)鍵通路，過度激活進(jìn)而促進(jìn)β-鏈蛋白核移位介導(dǎo)細(xì)胞增殖，在IgA腎病患者B淋巴細(xì)胞、系膜細(xì)胞及單核細(xì)胞增殖發(fā)揮作用[10]。PI3K亦可激活單核細(xì)胞其表面受體CD89，變體后與聚合性IgA形成IgA1-CD89免疫復(fù)合物，影響IgA腎病疾病進(jìn)展[11]。PI3K/Akt通路的下游分子腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）/STAT3通路促進(jìn)IgA腎病腎間質(zhì)纖維化[12]。黃芪甲苷可通過調(diào)控PI3K/Akt/p53信號(hào)通路抑制IgA腎病腎小球系膜細(xì)胞增生[13]。GSTP1可抑制PI3K/Akt誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的激活而促進(jìn)自噬下調(diào)炎癥小體水平，保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損害[14]，本研究發(fā)現(xiàn)GSTP1是益腎化濕顆粒作用的關(guān)鍵基因之一，體現(xiàn)了健脾益氣藥物用以治療IgA腎病的重要靶點(diǎn)。此外，脾虛證影響B(tài)細(xì)胞抗體表達(dá)使體液免疫功能異常，表現(xiàn)為免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）和補(bǔ)體的含量異常[15-16]。糖皮質(zhì)激素通常作為IgA腎病有效的治療方式來調(diào)控免疫。皮質(zhì)醇受體基因NR3C1不僅反饋糖皮質(zhì)激素功能，并作為其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)器，影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和目標(biāo)組織的分化[17]。在IgA腎病患者中，NR3C1影響IgA腎病異常表達(dá)的各種下游分子[18]，本研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濕顆粒中人參皂苷、茯苓酸、澤瀉醇A等多種成分均可與皮質(zhì)醇受體基因NR3C1有效對(duì)接，提示益腎化濕顆粒有助于發(fā)揮糖皮質(zhì)激素效能。

“風(fēng)濕擾腎”是IgA腎病中免疫炎癥啟動(dòng)系膜細(xì)胞活化的病機(jī)關(guān)鍵，該環(huán)節(jié)與活動(dòng)期/進(jìn)展期IgA腎病病理?yè)p傷密切相關(guān)?！帮L(fēng)”“濕”等致病因素在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的重要因素。本研究中黃芪主要成分黃芪皂苷可通過調(diào)控TGF-β1/Smad通路激活，調(diào)控p38活化和NF-κB的表達(dá)，從而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[19]。白術(shù)所含的白術(shù)內(nèi)酯I調(diào)控CD14、TLR4和MyD88的表達(dá)，抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子水平，減弱NF-κB的活性和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）和p38 MAPK的磷酸化，并通過抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。柴胡皂苷A可抑制c-Jun/MAPK、NF-κB的通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)繼而減輕炎癥反應(yīng)[20-22]。黃芪甲苷作為經(jīng)典抗炎、調(diào)節(jié)免疫單體可以減輕IL-1β及NF-κB的釋放，發(fā)揮腎保護(hù)作用[23]。以上結(jié)果闡述為益腎化濕治療IgA腎病關(guān)鍵靶點(diǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的藥效基礎(chǔ)。

PPAR家族調(diào)控參與細(xì)胞增殖、分化以及炎癥和免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)。PPARγ主要在脂肪組織、腸、腎上皮和免疫系統(tǒng)中表達(dá)，其編碼蛋白PPARγ可抑制p65的磷酸化和核易位從而調(diào)控NF-κB表達(dá)，進(jìn)一步降低TNF-α水平，在炎癥反應(yīng)及IgA腎病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[24]。PPAR家族（PPARα、PPARβ及PPARγ）同時(shí)也是參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵細(xì)胞因子[25]。脂代謝紊亂常與腎功能及腎間質(zhì)纖維化有直接關(guān)系，是IgA腎病進(jìn)展關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。RXRA則是PPAR家族通路激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26]，抑制PPARa/RXRA通路，氧化脂肪酸水平下調(diào)繼而血清三酰甘油水平升高，促進(jìn)IgA腎病腎小球硬化進(jìn)展[27-28]。本研究顯示益腎化濕顆粒中的茯苓酸、黃芪皂苷、澤瀉醇A、川陳皮素等均能與PPARγ對(duì)接，發(fā)揮調(diào)控免疫炎癥及維持細(xì)胞脂代謝穩(wěn)態(tài)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆?？赏ㄟ^調(diào)控TNF信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等發(fā)揮治療作用。其中TNF、IL-6、IL-1β、NF-κB均為重要的免疫、炎癥因子，PPARγ、RXRA、GSTP1為介導(dǎo)代謝環(huán)節(jié)的效應(yīng)因子，RXRA為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，介導(dǎo)的信號(hào)通路與IgA腎病的炎癥反應(yīng)和脂代謝過程密切相關(guān)。免疫、炎癥與代謝三方失調(diào)參與IgA腎病病理?yè)p傷的全過程，本研究發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵蛋白也均顯著富集在TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等5條信號(hào)通路上，從一定程度上展示了益腎化濕顆粒能夠多靶點(diǎn)、多通路預(yù)防或治療IgA腎病。

綜上所述，益腎化濕顆粒中的活性成分與炎癥、代謝、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)蛋白成功對(duì)接，可調(diào)控TNF、PI3K/Akt、IL-17、AGE-RAGE等多條關(guān)鍵信號(hào)通路，通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、代謝、改善類固醇效應(yīng)等過程協(xié)同治療IgA腎病。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)結(jié)果較為接近，體現(xiàn)出本研究結(jié)論的科學(xué)性，可為深入闡釋益腎化濕顆粒治療IgA腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供依據(jù)。本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步明確益腎化濕顆粒治療IgA腎病提供了理論依據(jù)和研究方向，益腎化濕顆粒具體作用靶點(diǎn)將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy based on HPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

JIANG Chen, XU Rong-jia, CUI Shi-yan, XU Peng-hao, XIA Ze-lu, YANG Hong-tao

National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Department of Nephrology, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300384, China

To discover the main components of Yishen Huashi Granules (益腎化濕顆粒) by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS/MS), and explore the target and mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy by network pharmacology.Mass spectrometry was used to accurately characterize the main components of Yishen Huashi Granules, and the active component targets were obtained by TCMSP, ETCM, and SymMAP databases; Disease targets of IgA nephropathy were obtained by GeneCards, OMIM and other databases, gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on drug-effective disease targets, and “active ingredients-targets-pathway” network was further constructed by Cytoscape_v3.8.2; Atuodock software was used for molecular docking of screening target and main active ingredients, and binding site simulation verification was carried out.A total of 68 main components of Yishen Huashi Granules were identified, including coumarins, triterpenoids, and flavonoids. A total of 43 active components of Yishen Huashi Granules for treating IgA nephropathy were obtained, 74 targets were obtained at the intersection of active ingredients and diseases, including peroxisome proliferator-activated receptor γ, cortisol receptor genes, etc.; Tumor necrosis factor signaling pathway, phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway, advanced glucose glycation products-advanced glycation end products receptor signaling pathway were involved. Molecular docking results showed that saikosaponin A, astragaloside III, astragaloside IV, alisol A had good binding activity with the predicted targets of IgA nephropathy.Yishen Huashi Granules can treat IgA nephropathy through anti-inflammatory, immune regulation and steroid effects. It has the characteristics of multiple components, multiple targets and multiple pathways.

Yishen Huashi Granules; IgA nephropathy; HPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; saikosaponin A; astragaloside III; astragaloside IV; alisol A

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6576 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.016

2021-09-23

益腎化濕顆粒臨床應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究開放課題（康藥合字2020336）

姜 晨（1982—），女，博士，副主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腎臟病。Tel: 18622662919 E-mail: jcdoctor_tcm@163.com

楊洪濤（1963—），男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腎臟病。Tel: (022)27986565 E-mail: tjtcmht@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]