• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機(jī)制

    2021-11-08 07:36:42徐榮佳崔師妍徐鵬昊夏澤魯楊洪濤
    中草藥 2021年21期
    關(guān)鍵詞:靶點(diǎn)黃芪腎病

    姜 晨,徐榮佳,崔師妍,徐鵬昊,夏澤魯,楊洪濤

    基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病作用機(jī)制

    姜 晨,徐榮佳,崔師妍,徐鵬昊,夏澤魯,楊洪濤*

    天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心 腎病科,天津 300384

    采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS/MS)挖掘益腎化濕顆粒的主要成分,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)益腎化濕顆粒主要成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性,并運(yùn)用TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分靶點(diǎn);采用GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得IgA腎病的疾病靶點(diǎn),對(duì)藥效疾病靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,進(jìn)一步運(yùn)用Cytoscape_v3.8.2構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò);應(yīng)用Atuodock軟件對(duì)篩選靶點(diǎn)及主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接,進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)模擬驗(yàn)證。共鑒定出益腎化濕顆粒主要成分68個(gè),包括香豆素類、三萜類和黃酮類等化合物;共獲得益腎化濕顆粒治療IgA腎病活性成分43個(gè),活性成分與疾病交集靶點(diǎn)74個(gè),其中包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ、皮質(zhì)醇受體基因等;涉及通路包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路等。分子對(duì)接結(jié)果顯示,柴胡皂苷A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、澤瀉醇A與IgA腎病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)有良好的結(jié)合活性。益腎化濕顆粒能夠通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善類固醇效應(yīng)等治療IgA腎病,具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

    益腎化濕顆粒;IgA腎??;HPLC-Q-TOF-MS/MS;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);柴胡皂苷A;黃芪甲苷III;黃芪甲苷IV;澤瀉醇A

    IgA腎病是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)最常見的慢性進(jìn)展性原發(fā)性腎小球疾病。盡管大部分患者呈良性進(jìn)展,但仍有10%~25%的患者于10年后進(jìn)展至終末期腎臟病,因其難治性及發(fā)展迅速的特點(diǎn),嚴(yán)重影響著公眾健康。目前其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,有效的治療方法(如糖皮質(zhì)激素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷劑等)仍存在爭(zhēng)議。近30年,中醫(yī)藥治療IgA腎病療效顯著,并在藥理學(xué)、多系統(tǒng)組學(xué)研究等方面取得重大進(jìn)展。因此,在難治性慢性腎臟病領(lǐng)域發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì),深入探索中醫(yī)藥治療IgA腎病的有效方法及藥物確切作用機(jī)制意義重大。

    益腎化濕顆粒的主要藥效物質(zhì)包含香豆素類、三萜類和黃酮類等成分。目前文獻(xiàn)報(bào)道了以現(xiàn)代色譜技術(shù)鑒定益腎化濕顆粒中重要藥味的化學(xué)成分,如盧秋梅等[1]以薄層色譜法定性和高效液相色譜法測(cè)定處方中人參、黃芪、甘草、黃連、陳皮、獨(dú)活、白芍的主要化學(xué)成分。但由于鑒定的藥物數(shù)目不全、藥物化學(xué)成分?jǐn)?shù)目較少等原因,尚不能較系統(tǒng)地反映益腎化濕顆粒的整體化學(xué)成分特征。目前,由于中藥復(fù)雜體系的科學(xué)內(nèi)涵與中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方優(yōu)化、中藥活性成分篩選及辨識(shí)等方面表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢(shì),為進(jìn)一步研究提供了重要手段。

    基于此,本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-Q-TOF-MS/MS),并以鑒定得到的化學(xué)成分為切入點(diǎn),利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其預(yù)防或治療IgA腎病的活性成分和作用靶點(diǎn),通過基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)分析其作用特點(diǎn),進(jìn)一步采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,為深入研究益腎化濕顆粒主要活性成分治療IgA腎病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料

    1.1 藥品與試劑

    益腎化濕顆粒(10 g/袋,批號(hào)20201118)購(gòu)自廣州康臣藥業(yè)有限公司;色譜級(jí)甲酸購(gòu)自阿拉丁公司;乙醇(分析純)購(gòu)自購(gòu)自北京化工廠;純水使用Mill-Q純水機(jī)制備。

    1.2 儀器

    HPLC-Q-TOF-MS/MS(美國(guó)Waters公司);萬分之一電子天平(海精密科學(xué)儀器有限公司);渦旋儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司);離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);移液槍(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);SHIZ-95B型循環(huán)式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

    1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

    中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/);ETCM網(wǎng)站(www.tcmip.cn/ etcm/index.php/ home/index/index.html);SymMAP網(wǎng)站(http://www.symmap.org/);Meatascape網(wǎng)站(https://metascape.org/gp/index.html);Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org);OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org);Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.pharmgkb.org);TID數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab. net/ttd);DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank. ca);Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org);RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/);PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov);Cytoscape 3.7.2軟件;Autodock Vina 1.5.6軟件;MassLynx V4.2軟件;Pymol 2.5.1軟件。

    2 方法

    2.1 供試品的制備

    取益腎化濕顆粒(碾成粉末)100 mg,置于10 mL量瓶?jī)?nèi),加入水適量,超聲溶解,放冷至室溫后定容,得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液,過0.22 μm微孔濾膜,濾液于4 ℃保存。

    2.2 色譜條件

    Waters X select HSS T3 C18色譜柱(210 mm×1.8 mm,1.8 μm);柱溫為45 ℃;樣品室溫度為4 ℃;進(jìn)樣體積為5 μL;載氣體積流量為3.0 L/min;流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),洗脫程序:0~11 min,16% B;11~22 min:6%~28% B;22~32 min,28%~47% B;32~40 min,7%~63% B;40~42 min,63%~85% B;42~48 min,85%~100% B;48~50 min,1% B。

    2.3 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源,V模式;正、負(fù)離子模式;負(fù)離子模式:Lockmass采用LEA([M-H]?553.277 5);正離子模式:Lockmass采用LEA([M+H]+555.293 1)。毛細(xì)管電壓為2.5 kV;錐孔電壓為45 V;離子源溫度為100 ℃;脫溶劑氣溫度為300 ℃;脫溶劑氮?dú)怏w積流量為600 L/h;錐孔氣體積流量為50 L/h;采樣頻率0.1 s,間隔0.02 s;/50~1700;碰撞能為21 eV。

    2.4 益腎化濕顆?;钚猿煞趾桶悬c(diǎn)篩選

    以類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%為篩選條件,利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得成分的分子式,在TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù)搜集益腎化濕顆?;钚猿煞?,通過挖掘文獻(xiàn)補(bǔ)充靶點(diǎn)。

    2.5 IgA腎病疾病靶點(diǎn)篩選

    IgA腎病疾病靶點(diǎn)的搜集以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞,檢索5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、DrugBank),通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白信息轉(zhuǎn)化為Uniprot ID,合并重復(fù)靶點(diǎn)基因,與獲得的成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對(duì)獲取交集靶點(diǎn)。

    2.6 互作關(guān)系靶點(diǎn)關(guān)系與信號(hào)通路分析

    將IgA腎病、益腎化濕顆粒主成分交集靶點(diǎn)經(jīng)metascape平臺(tái)注釋進(jìn)行蛋白互作(protein protein interaction,PPI)分析,應(yīng)用MCODE算法識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的模塊。對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行通路和過程富集分析,對(duì)其進(jìn)行功能進(jìn)行描述。并通過metascape平臺(tái)輸出的KEGG及GO分析結(jié)果輸入cytoscape軟件進(jìn)行可視化。

    2.7 活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

    利用Atuodock軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。選擇度值≥5、OB≥30%,從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載候選蛋白的晶體結(jié)構(gòu),從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的二維結(jié)構(gòu)文件,通過去水、加氫、轉(zhuǎn)換格式,對(duì)接結(jié)果參考結(jié)合能大小,對(duì)接能量值≤?25.10 kJ/mol表示有較好的結(jié)合活性,利用Pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出優(yōu)化。

    3 結(jié)果

    3.1 益腎化濕顆粒成分鑒定

    益腎化濕顆粒的提取總離子流圖(total ion chromatography,TIC)見圖1,通過對(duì)負(fù)離子模式的成分解析,MassLynxV4.2工作站得到可能的元素組成,對(duì)誤差小于10以內(nèi)的分子式進(jìn)行文獻(xiàn)匹配,共獲得68個(gè)主峰化合物,包括香豆素類化合物(A)、三萜類化合物(B)、黃酮類化合物(C)、苷類化合物(D)、異喹啉類生物堿(E)、內(nèi)酯類化合物(F)、醇類化合物(G)、酚類化合物(H)、有機(jī)酸類化合物(I),結(jié)合出峰先后進(jìn)行順序標(biāo)號(hào)見表1,與文獻(xiàn)報(bào)道益腎化濕顆粒的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一致[1]。

    圖1 正離子模式下益腎化濕顆??傠x子流圖

    表1 益腎化濕顆粒成分鑒定

    續(xù)表1

    峰號(hào)來源化合物tR/min分子式相對(duì)分子質(zhì)量m/zMS/MS編號(hào) 理論值實(shí)際值 57羌活香豆酸39.81C6H4O4140.092 3141.093 3141.092 675.443 9, 53.240 3F3 58生姜10-姜辣醇40.28C21H34O4350.490 8351.492 0351.491 8213.368 9, 138.089 9G1 59陳皮檸檬苦素40.41C26H30O8470.511 6471.513 3471.513 8369.454 9, 287.080 5B18 60人參人參皂苷Rb243.56C53H90O221 079.262 11 080.263 61 080.263 9433.188 9, 369.488 5, 263.194 5B3 61生姜6-姜烯酚43.60C17H24O3276.372 6277.373 6277.373 7124.736 7, 64.723 4G3 62黃芪黃芪皂苷II43.82C43H70O15827.002 4828.003 6828.003 9385.601 3, 68.367 9B12 63黃芪黃芪甲苷44.12C41H68O14784.971 6785.973 7785.973 2204.458 5, 148.422 6B14 64黃連藥根堿44.52C20H20NO4338.382 1339.383 9339.383 9243.499 4, 130.822 7E2 65黃芪黃芪皂苷III44.55C43H70O15827.002 4828.002 4828.003 0468.041 9, 268.200 0B13 66甘草異甘草苷45.28C21H22O9418.392 6419.394 2419.393 8366.681 1, 109.463 8C9 67人參人參皂苷Re45.70C48H82O18947.151 0948.151 4948.151 3498.586 3, 420.388 4, 197.679 9B4 68茯苓茯苓酸49.10C33H52O5528.761 3529.761 7529.761 9434.552 7, 248.597 9B6

    3.2 益腎化濕顆?;钚猿煞趾妥饔冒悬c(diǎn)篩選

    由表1可知,益腎化濕顆粒主要成分包括芍藥苷、柴胡皂苷A、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III、人參皂苷Rg1、黃芪皂苷、茯苓酸等,基本反映了益腎化濕顆粒的化學(xué)物質(zhì)組成。選取鑒定的全部益腎化濕顆?;钚猿煞肿鳛槟繕?biāo)成分,其中61個(gè)成分被PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)收錄,利用TCMSP、ETCM、SymMAP數(shù)據(jù)庫(kù),獲取235個(gè)成分的相關(guān)靶點(diǎn)。另外7個(gè)成分如紫花前胡苷元、去甲升麻素、5-去甲川陳皮素等由于相關(guān)研究不多,未找到作用靶點(diǎn)。構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò),結(jié)果表明有43個(gè)成分參與調(diào)控IgA腎病的分子網(wǎng)絡(luò),其中茯苓酸、川陳皮素等在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中影響程度較大,同時(shí)具有良好的OB,可為益腎化濕顆粒預(yù)防或治療IgA腎病提供新的活性成分。

    3.3 IgA腎病疾病靶點(diǎn)篩選

    以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞,檢索5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genecards、OMIM、Pharmgkb、TID、Drug Bank),得到1415個(gè)與IgA腎病相關(guān)的作用靶點(diǎn),通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白信息轉(zhuǎn)化為Uniprot ID,合并重復(fù)靶點(diǎn)基因,與獲得的成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對(duì),最終獲得74個(gè)治療IgA腎病潛在的靶點(diǎn)基因(圖2),并經(jīng)metascape平臺(tái)注釋進(jìn)行PPI分析,應(yīng)用MCODE算法識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的模塊。對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行通路和過程富集分析,對(duì)其進(jìn)行功能進(jìn)行描述。根據(jù)值,保留3個(gè)最佳評(píng)分項(xiàng)描述相應(yīng)模塊的功能(圖3),主要與急性炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子正向調(diào)節(jié)、CD4+T細(xì)胞因子產(chǎn)生、生長(zhǎng)發(fā)育、白細(xì)胞分化等過程相關(guān),其中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)、IL-1β、核受體亞家族3C組成員2(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1,NR3C1)、核受體視黃酸X受體α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、原癌基因(JUN)、核因子-κB(nuclear factor kappa B subunit,NF-κB)為篩選的核心靶點(diǎn)。

    圖2 藥物與疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

    圖3 藥物與疾病交集靶點(diǎn)PPI分析

    3.4 互作靶點(diǎn)及通路分析

    GO功能注釋是通過生物過程(cellular component,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。如圖4所示,交集靶點(diǎn)涉及藥物反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)及結(jié)合、急性炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)反應(yīng)、氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞增殖、白細(xì)胞分化等20個(gè)BP條目;膜筏、薄膜側(cè)面、無花果酶1顆粒、細(xì)胞質(zhì)小泡腔、囊泡腔等9個(gè)CC條目;轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、類固醇激素受體活性等13個(gè)CC條目。

    圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

    對(duì)BP富集條目展示對(duì)應(yīng)藥效靶點(diǎn),其中GSTP1與炎癥、脂代謝、營(yíng)養(yǎng)及藥物反應(yīng)密切相關(guān)(圖5)。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶家族在解毒和抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)、NF-κB、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路的相互作用參與抗炎、促凋亡過程,在以系膜細(xì)胞增殖為主的IgA腎病中提供潛在的治療機(jī)制。

    圖5 BP富集條目對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

    如圖6所示,益腎化濕顆??赡芡ㄟ^作用于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等治療IgA腎病。

    圖6 交集靶點(diǎn)KECG富集分析

    3.5 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    選擇KEGG通路富集結(jié)果前20條中的與IgA腎病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的14條信號(hào)通路,集中展示活性成分對(duì)作用靶點(diǎn)的所在通路。43個(gè)主要活性成分可能通過作用于74個(gè)靶點(diǎn),在14條信號(hào)通路中發(fā)揮作用,繪制益腎化濕顆?!盎钚猿煞?疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)交互機(jī)制圖(圖7)。

    3.6 益腎化濕顆粒活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接

    利用Atuodock軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果表明活性成分中均與8個(gè)核心蛋白結(jié)合能均≤?25.10 kJ/mol,柴胡皂苷A與TNF結(jié)合能最高為?39.71 kJ/mol,澤瀉醇A、黃芪甲苷III、黃芪甲苷Ⅳ、柴胡皂苷A、人參皂苷結(jié)合能較高(表2),部分蛋白和化合物的分子對(duì)接情況見圖8。

    圖7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

    表2 核心活性成分與核心蛋白結(jié)合能

    圖8 部分蛋白和化合物的分子對(duì)接圖

    4 討論

    益腎化濕顆粒為李杲《脾胃論》之名方“升陽(yáng)益胃湯”化裁而來,此方乃東垣治所生受病肺經(jīng)之方,后世在臨床實(shí)踐中逐漸擴(kuò)大了此方的應(yīng)用范圍,將此方用于治療IgA腎病便是其中之一。IgA腎病在中醫(yī)學(xué)屬“尿血”“水腫”“腎風(fēng)”“尿濁”等范疇,以本虛標(biāo)實(shí)為基本病機(jī)特點(diǎn),本虛以脾腎氣虛為主,標(biāo)實(shí)以濕熱及水濕之邪為常。國(guó)醫(yī)大師張琪教授強(qiáng)調(diào)脾胃失調(diào)是慢性腎病的病機(jī)關(guān)鍵,善于以脾論治慢性腎臟病[2]。楊洪濤教授傳承發(fā)展了張琪教授從脾治腎思想,探索以益腎化濕顆粒治療IgA腎病[3]。益腎化濕顆粒中重用黃芪為君,以升陽(yáng)固表、益氣利水;配伍人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草補(bǔ)氣養(yǎng)胃;柴胡、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)為升舉清陽(yáng)、祛風(fēng)除濕;半夏、陳皮、澤瀉、黃連除濕清熱;白芍固護(hù)陰液,防升陽(yáng)祛風(fēng)燥濕太過;全方共奏益腎健脾、升陽(yáng)化濕、祛風(fēng)利水之功效。既往臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,益腎化濕顆??烧{(diào)節(jié)慢性微炎癥狀態(tài)、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、減輕氧化應(yīng)激損傷,從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[4-8]。本研究發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆粒的43個(gè)活性成分與74個(gè)IgA腎病疾病靶點(diǎn)密切相關(guān),并通過14條信號(hào)通路發(fā)揮作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示,黃芪甲苷III、黃芪甲苷IV、柴胡皂苷A、人參皂苷、澤瀉醇A等活性成分與IgA腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接分?jǐn)?shù)較高,表明有良好的的結(jié)合活性。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)合PPI分析,得到益腎化濕顆粒可通過TNF、IL-6、IL-1β、PPARγ、GSTP1、NF-κB、NR3C1、RXRA、JUN等9個(gè)核心基因調(diào)控IgA腎病。

    脾虛證是IgA腎病中醫(yī)病機(jī)本虛證的主要體現(xiàn),脾虛運(yùn)化障礙下,水谷精微轉(zhuǎn)運(yùn)異常,引發(fā)能量代謝障礙,可促使線粒體功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,健脾益氣之法可調(diào)控線粒體自噬水平,在修復(fù)IgA腎病損傷組織中起調(diào)節(jié)作用[9]。PI3K/Akt通路是參與細(xì)胞自噬與調(diào)亡的關(guān)鍵通路,過度激活進(jìn)而促進(jìn)β-鏈蛋白核移位介導(dǎo)細(xì)胞增殖,在IgA腎病患者B淋巴細(xì)胞、系膜細(xì)胞及單核細(xì)胞增殖發(fā)揮作用[10]。PI3K亦可激活單核細(xì)胞其表面受體CD89,變體后與聚合性IgA形成IgA1-CD89免疫復(fù)合物,影響IgA腎病疾病進(jìn)展[11]。PI3K/Akt通路的下游分子腫瘤蛋白53(tumor protein 53,p53)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/酪氨酸激酶(janus kinase,JAK)/STAT3通路促進(jìn)IgA腎病腎間質(zhì)纖維化[12]。黃芪甲苷可通過調(diào)控PI3K/Akt/p53信號(hào)通路抑制IgA腎病腎小球系膜細(xì)胞增生[13]。GSTP1可抑制PI3K/Akt誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的激活而促進(jìn)自噬下調(diào)炎癥小體水平,保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損害[14],本研究發(fā)現(xiàn)GSTP1是益腎化濕顆粒作用的關(guān)鍵基因之一,體現(xiàn)了健脾益氣藥物用以治療IgA腎病的重要靶點(diǎn)。此外,脾虛證影響B(tài)細(xì)胞抗體表達(dá)使體液免疫功能異常,表現(xiàn)為免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)和補(bǔ)體的含量異常[15-16]。糖皮質(zhì)激素通常作為IgA腎病有效的治療方式來調(diào)控免疫。皮質(zhì)醇受體基因NR3C1不僅反饋糖皮質(zhì)激素功能,并作為其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)器,影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和目標(biāo)組織的分化[17]。在IgA腎病患者中,NR3C1影響IgA腎病異常表達(dá)的各種下游分子[18],本研究發(fā)現(xiàn),益腎化濕顆粒中人參皂苷、茯苓酸、澤瀉醇A等多種成分均可與皮質(zhì)醇受體基因NR3C1有效對(duì)接,提示益腎化濕顆粒有助于發(fā)揮糖皮質(zhì)激素效能。

    “風(fēng)濕擾腎”是IgA腎病中免疫炎癥啟動(dòng)系膜細(xì)胞活化的病機(jī)關(guān)鍵,該環(huán)節(jié)與活動(dòng)期/進(jìn)展期IgA腎病病理?yè)p傷密切相關(guān)?!帮L(fēng)”“濕”等致病因素在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的重要因素。本研究中黃芪主要成分黃芪皂苷可通過調(diào)控TGF-β1/Smad通路激活,調(diào)控p38活化和NF-κB的表達(dá),從而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)[19]。白術(shù)所含的白術(shù)內(nèi)酯I調(diào)控CD14、TLR4和MyD88的表達(dá),抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子水平,減弱NF-κB的活性和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)和p38 MAPK的磷酸化,并通過抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用。柴胡皂苷A可抑制c-Jun/MAPK、NF-κB的通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)繼而減輕炎癥反應(yīng)[20-22]。黃芪甲苷作為經(jīng)典抗炎、調(diào)節(jié)免疫單體可以減輕IL-1β及NF-κB的釋放,發(fā)揮腎保護(hù)作用[23]。以上結(jié)果闡述為益腎化濕治療IgA腎病關(guān)鍵靶點(diǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的藥效基礎(chǔ)。

    PPAR家族調(diào)控參與細(xì)胞增殖、分化以及炎癥和免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)。PPARγ主要在脂肪組織、腸、腎上皮和免疫系統(tǒng)中表達(dá),其編碼蛋白PPARγ可抑制p65的磷酸化和核易位從而調(diào)控NF-κB表達(dá),進(jìn)一步降低TNF-α水平,在炎癥反應(yīng)及IgA腎病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[24]。PPAR家族(PPARα、PPARβ及PPARγ)同時(shí)也是參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵細(xì)胞因子[25]。脂代謝紊亂常與腎功能及腎間質(zhì)纖維化有直接關(guān)系,是IgA腎病進(jìn)展關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。RXRA則是PPAR家族通路激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26],抑制PPARa/RXRA通路,氧化脂肪酸水平下調(diào)繼而血清三酰甘油水平升高,促進(jìn)IgA腎病腎小球硬化進(jìn)展[27-28]。本研究顯示益腎化濕顆粒中的茯苓酸、黃芪皂苷、澤瀉醇A、川陳皮素等均能與PPARγ對(duì)接,發(fā)揮調(diào)控免疫炎癥及維持細(xì)胞脂代謝穩(wěn)態(tài)作用。

    本研究還發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆??赏ㄟ^調(diào)控TNF信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等發(fā)揮治療作用。其中TNF、IL-6、IL-1β、NF-κB均為重要的免疫、炎癥因子,PPARγ、RXRA、GSTP1為介導(dǎo)代謝環(huán)節(jié)的效應(yīng)因子,RXRA為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn),介導(dǎo)的信號(hào)通路與IgA腎病的炎癥反應(yīng)和脂代謝過程密切相關(guān)。免疫、炎癥與代謝三方失調(diào)參與IgA腎病病理?yè)p傷的全過程,本研究發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵蛋白也均顯著富集在TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等5條信號(hào)通路上,從一定程度上展示了益腎化濕顆粒能夠多靶點(diǎn)、多通路預(yù)防或治療IgA腎病。

    綜上所述,益腎化濕顆粒中的活性成分與炎癥、代謝、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)蛋白成功對(duì)接,可調(diào)控TNF、PI3K/Akt、IL-17、AGE-RAGE等多條關(guān)鍵信號(hào)通路,通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、代謝、改善類固醇效應(yīng)等過程協(xié)同治療IgA腎病。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)結(jié)果較為接近,體現(xiàn)出本研究結(jié)論的科學(xué)性,可為深入闡釋益腎化濕顆粒治療IgA腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供依據(jù)。本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究益腎化濕顆粒治療IgA腎病的潛在機(jī)制,為進(jìn)一步明確益腎化濕顆粒治療IgA腎病提供了理論依據(jù)和研究方向,益腎化濕顆粒具體作用靶點(diǎn)將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] 盧秋梅, 黎倩, 黃艷霞, 等. 益腎化濕顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2020, 29(13): 80-84.

    [2] 李蓮花, 張佩青. 張琪教授從脾胃治療慢性腎臟病的經(jīng)驗(yàn) [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2016, 17(5): 386-387.

    [3] 王耀獻(xiàn), 楊洪濤, 裴明. 益腎化濕顆粒治療腎臟病臨床應(yīng)用專家共識(shí) [J]. 中華腎病研究電子雜志, 2020, 9(3): 97-101.

    [4] 胡漪玲, 關(guān)文明, 徐偉芹. 益腎化濕顆粒聯(lián)合舒洛地特對(duì)早期老年糖尿病腎病氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能的影響 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2016, 22(5): 211-214.

    [5] 張國(guó)勝, 侯小靜, 朱廣領(lǐng). 益腎化濕顆粒和舒洛地特軟膠囊聯(lián)合治療糖尿病腎病的療效 [J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2014, 34(24): 6910-6912.

    [6] 劉秀艷. 益腎化濕顆粒聯(lián)合纈沙坦對(duì)尿毒癥患者微炎癥狀態(tài)及殘存腎功能的影響 [J]. 河北醫(yī)藥, 2017, 39(14): 2143-2145.

    [7] 張玥. 益腎化濕顆粒聯(lián)合纈沙坦治療慢性腎小球腎炎的臨床研究 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2017, 12(1): 68-70.

    [8] 傅奕, 陳幫明, 李鑫, 等.益腎化濕顆粒聯(lián)合雷公藤多苷片治療糖尿病腎病的療效研究[J]. 中草藥, 2020, 51(23): 6045-6049.

    [9] Wu C Y, Hua K F, Yang S R,. Tris DBA ameliorates IgA nephropathy by blunting the activating signal of NLRP3 inflammasome through SIRT1- and SIRT3- mediated autophagy induction [J]., 2020, 24(23): 13609-13622.

    [10] Cox S N, Sallustio F, Serino G,. Altered modulation of WNT-beta-catenin and PI3K/Akt pathways in IgA nephropathy [J]., 2010, 78(4): 396-407.

    [11] 方心縈, 金善善, 王小琴. IgA腎病分子機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 臨床腎臟病雜志, 2018, 18(12): 784-787.

    [12] Yang R H, Xu X, Li H L,. p53 induces miR199a-3p to suppress SOCS7 for STAT3 activation and renal fibrosis in UUO [J]., 2017, 7: 43409.

    [13] 龐爽, 趙栓, 徐夏蓮, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析黃芪治療IgA腎病的作用機(jī)制 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(15): 139-147.

    [14] Dong X, Yang Y, Zhou Y,. Glutathione S-transferases P1 protects breast cancer cell from adriamycin-induced cell death through promoting autophagy [J]., 2019, 26(10): 2086-2099.

    [15] 朱萱萱, 嚴(yán)士海, 顧和亞, 等. 溫脾實(shí)腸法治療脾陽(yáng)虛證實(shí)驗(yàn)研究: 兼論對(duì)免疫系統(tǒng)功能的影響 [J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2007, 21(9): 27-29.

    [16] 聶建華, 歐陽(yáng)文娟, 阮時(shí)寶, 等. 土人參根健脾益氣功效及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2009, 16(3): 200-201.

    [17] Cartwright T, Perkins N D, L Wilson C. NFKB1: A suppressor of inflammation, ageing and cancer [J]., 2016, 283(10): 1812-1822.

    [18] Cox S N, Pesce F, El-Sayed Moustafa J S,. Multiple rare genetic variants co-segregating with familial IgA nephropathy all act within a single immune-related network [J]., 2017, 281(2): 189-205.

    [19] 趙夏, 許傳文, 徐艷梅. 黃芪皂苷調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2019, 35(4): 24-28.

    [20] Lai K N, Leung J C, Chan L Y,. Activation of podocytes by mesangial-derived TNF-alpha: Glomerulo- podocytic communication in IgA nephropathy [J]., 2008, 294(4): F945-F955.

    [21] Qui?ones M, Al-Massadi O, Folgueira C,. p53 in AgRP neurons is required for protection against diet-induced obesity via JNK1[J]., 2018, 9(1): 3432.

    [22] Tolstonog G V, Deppert W. Metabolic sensing by p53: Keeping the balance between life and death [J]., 2010, 107(30): 13193-13194.

    [23] 韓海燕. 黃芪甲苷治療慢性腎臟疾病研究進(jìn)展 [J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 33(4): 678-680.

    [24] Liu B, He Y, Lu R,. Zhen-wu-tang protects against podocyte injury in rats with IgA nephropathy via PPARγ/NF-κB pathway [J]., 2018, 101: 635-647.

    [25] Wang J, He L, Yan W,. The role of hypertriglyceridemia and treatment patterns in the progression of IgA nephropathy with a high proportion of global glomerulosclerosis [J]., 2020, 52(2): 325-335.

    [26] Gorla-Bajszczak A, Juge-Aubry C, Pernin A,. Conserved amino acids in the ligand-binding and tau(i) domains of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha are necessary for heterodimerization with RXR [J]., 1999, 147(1/2): 37-47.

    [27] Zuo N, Suzuki Y, Sugaya T,. Protective effects of tubular liver-type fatty acid-binding protein against glomerular damage in murine IgA nephropathy [J]., 2011, 26(7): 2127-2137.

    [28] Xue Y F, Guo C Z, Hu F,. PPARA/RXRA signaling regulates the fate of hepatic non-esterified fatty acids in a sheep model of maternal undernutrition [J]., 2020, 1865(2): 158548.

    Mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy based on HPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

    JIANG Chen, XU Rong-jia, CUI Shi-yan, XU Peng-hao, XIA Ze-lu, YANG Hong-tao

    National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Department of Nephrology, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300384, China

    To discover the main components of Yishen Huashi Granules (益腎化濕顆粒) by high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS/MS), and explore the target and mechanism of Yishen Huashi Granules in treatment of IgA nephropathy by network pharmacology.Mass spectrometry was used to accurately characterize the main components of Yishen Huashi Granules, and the active component targets were obtained by TCMSP, ETCM, and SymMAP databases; Disease targets of IgA nephropathy were obtained by GeneCards, OMIM and other databases, gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on drug-effective disease targets, and “active ingredients-targets-pathway” network was further constructed by Cytoscape_v3.8.2; Atuodock software was used for molecular docking of screening target and main active ingredients, and binding site simulation verification was carried out.A total of 68 main components of Yishen Huashi Granules were identified, including coumarins, triterpenoids, and flavonoids. A total of 43 active components of Yishen Huashi Granules for treating IgA nephropathy were obtained, 74 targets were obtained at the intersection of active ingredients and diseases, including peroxisome proliferator-activated receptor γ, cortisol receptor genes, etc.; Tumor necrosis factor signaling pathway, phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway, advanced glucose glycation products-advanced glycation end products receptor signaling pathway were involved. Molecular docking results showed that saikosaponin A, astragaloside III, astragaloside IV, alisol A had good binding activity with the predicted targets of IgA nephropathy.Yishen Huashi Granules can treat IgA nephropathy through anti-inflammatory, immune regulation and steroid effects. It has the characteristics of multiple components, multiple targets and multiple pathways.

    Yishen Huashi Granules; IgA nephropathy; HPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; saikosaponin A; astragaloside III; astragaloside IV; alisol A

    R285.5

    A

    0253 - 2670(2021)21 - 6576 - 10

    10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.016

    2021-09-23

    益腎化濕顆粒臨床應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究開放課題(康藥合字2020336)

    姜 晨(1982—),女,博士,副主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腎臟病。Tel: 18622662919 E-mail: jcdoctor_tcm@163.com

    楊洪濤(1963—),男,主任醫(yī)師,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腎臟病。Tel: (022)27986565 E-mail: tjtcmht@126.com

    [責(zé)任編輯 李亞楠]

    猜你喜歡
    靶點(diǎn)黃芪腎病
    Huangqi decoction (黃芪湯) attenuates renal interstitial fibrosis via transforming growth factor-β1/mitogen-activated protein kinase signaling pathways in 5/6 nephrectomy mice
    “補(bǔ)氣之王”黃芪,你吃對(duì)了嗎?
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點(diǎn)
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    預(yù)防腎病,維護(hù)自己和家人的健康
    中老年保健(2021年4期)2021-08-22 07:07:58
    中醫(yī)怎樣治腎病?
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點(diǎn)
    腎病防治莫入誤區(qū)
    黃芪是個(gè)寶
    海峽姐妹(2019年3期)2019-06-18 10:37:30
    “重女輕男”的腎病
    心力衰竭的分子重構(gòu)機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)
    老鸭窝网址在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲成国产人片在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天堂中文最新版在线下载| 国产又色又爽无遮挡免| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲欧洲日产国产| 最黄视频免费看| 2022亚洲国产成人精品| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av电影在线进入| 国产日韩欧美在线精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美国免费a级毛片| 日日爽夜夜爽网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天堂8中文在线网| 精品第一国产精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品 国内视频| 在线天堂最新版资源| 亚洲,欧美,日韩| 国产免费又黄又爽又色| 18禁观看日本| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品国产三级专区第一集| 香蕉丝袜av| 国产免费现黄频在线看| 99国产精品免费福利视频| 另类亚洲欧美激情| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 18禁观看日本| 中文字幕亚洲精品专区| 在线观看www视频免费| 秋霞在线观看毛片| 五月天丁香电影| 超碰成人久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产片内射在线| 久久久国产一区二区| 亚洲综合色惰| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久久精品久久久久真实原创| 老鸭窝网址在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜老司机福利剧场| av在线播放精品| 欧美中文综合在线视频| 久久热在线av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产高清国产精品国产三级| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费观看无遮挡的男女| 午夜福利视频精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩av免费高清视频| 久久久精品94久久精品| 精品第一国产精品| 国产精品久久久久久av不卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美日韩视频精品一区| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩中字成人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲精品视频女| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产极品天堂在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 色网站视频免费| 寂寞人妻少妇视频99o| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产av码专区亚洲av| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久影院123| 91精品国产国语对白视频| 精品少妇内射三级| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩 亚洲 欧美在线| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久国产一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 极品人妻少妇av视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人91sexporn| 日本av免费视频播放| 波多野结衣一区麻豆| 免费高清在线观看视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 制服诱惑二区| 制服诱惑二区| 国产黄频视频在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 中文天堂在线官网| 久久免费观看电影| 只有这里有精品99| 制服诱惑二区| av福利片在线| av片东京热男人的天堂| 日韩av免费高清视频| 欧美精品av麻豆av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲色图综合在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 国产1区2区3区精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| www日本在线高清视频| 女性被躁到高潮视频| 黄频高清免费视频| 国产免费现黄频在线看| 老司机影院毛片| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 在线观看一区二区三区激情| 人妻系列 视频| 人妻系列 视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 丝袜在线中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 国产免费视频播放在线视频| 性色avwww在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 飞空精品影院首页| 美女午夜性视频免费| 国产又色又爽无遮挡免| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品一区二区在线观看99| 国产福利在线免费观看视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区在线观看完整版| 欧美日韩一级在线毛片| 精品国产乱码久久久久久小说| 少妇人妻 视频| 中国三级夫妇交换| 丰满迷人的少妇在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 日本爱情动作片www.在线观看| 91精品国产国语对白视频| a级毛片黄视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 韩国高清视频一区二区三区| 黄色 视频免费看| 少妇精品久久久久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 欧美精品av麻豆av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产亚洲一区二区精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲精品自拍成人| 久久久亚洲精品成人影院| 香蕉国产在线看| 日本wwww免费看| 男女高潮啪啪啪动态图| av国产精品久久久久影院| 99九九在线精品视频| 国产片特级美女逼逼视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人av激情在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 水蜜桃什么品种好| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 午夜影院在线不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 高清视频免费观看一区二区| 免费高清在线观看日韩| 在线看a的网站| 黄片无遮挡物在线观看| 国产一区二区在线观看av| 各种免费的搞黄视频| 午夜激情久久久久久久| 人人澡人人妻人| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av男天堂| 亚洲国产色片| 少妇的逼水好多| 亚洲精品,欧美精品| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美在线黄色| 欧美最新免费一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 久久亚洲国产成人精品v| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久亚洲精品成人影院| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美中文综合在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲av福利一区| 最近中文字幕高清免费大全6| 少妇人妻精品综合一区二区| 男人舔女人的私密视频| 男女无遮挡免费网站观看| 黄色一级大片看看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲伊人久久精品综合| 国产在视频线精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品自拍成人| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 老司机影院成人| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久精品久久精品一区二区三区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费av中文字幕在线| 999精品在线视频| 亚洲国产精品999| 欧美日韩视频精品一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 高清在线视频一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 免费观看性生交大片5| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费观看在线日韩| 久久久国产一区二区| 少妇熟女欧美另类| 伦精品一区二区三区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 一本久久精品| 亚洲三区欧美一区| 久久久a久久爽久久v久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲精品美女久久av网站| 精品福利永久在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 搡老乐熟女国产| 亚洲欧美一区二区三区久久| 青春草国产在线视频| 欧美成人午夜免费资源| 人妻 亚洲 视频| 色网站视频免费| 香蕉国产在线看| 亚洲综合色网址| 免费观看无遮挡的男女| 国产黄色视频一区二区在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 99国产综合亚洲精品| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| videossex国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 天堂中文最新版在线下载| 2018国产大陆天天弄谢| 黄片播放在线免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美中文综合在线视频| 咕卡用的链子| 国产精品久久久久久久久免| 人妻 亚洲 视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲国产精品一区三区| 不卡av一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 热99久久久久精品小说推荐| 大话2 男鬼变身卡| 免费日韩欧美在线观看| 国产精品免费视频内射| 久久久a久久爽久久v久久| 91精品三级在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产成人av激情在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 91成人精品电影| 精品酒店卫生间| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品人妻久久久影院| 嫩草影院入口| 免费在线观看完整版高清| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久精品国产自在天天线| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲综合精品二区| 午夜精品国产一区二区电影| 免费看不卡的av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 天堂8中文在线网| 老司机影院毛片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美在线黄色| 免费观看在线日韩| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 丝袜喷水一区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产乱来视频区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲成人一二三区av| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜久久久在线观看| 少妇 在线观看| 免费看不卡的av| 男女啪啪激烈高潮av片| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 精品亚洲成国产av| 一级片免费观看大全| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲av在线观看美女高潮| 1024视频免费在线观看| 久久午夜福利片| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产av新网站| 一区二区三区乱码不卡18| 国产日韩欧美亚洲二区| 制服丝袜香蕉在线| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩电影二区| 1024视频免费在线观看| 久久ye,这里只有精品| 人妻系列 视频| 国产成人一区二区在线| 制服诱惑二区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 老司机影院毛片| 成人国产av品久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 男女边吃奶边做爰视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 嫩草影院入口| 一级爰片在线观看| 美女大奶头黄色视频| 中文字幕av电影在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av中文av极速乱| 热re99久久国产66热| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| a级毛片黄视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av.av天堂| 久久精品夜色国产| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 五月天丁香电影| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲国产av影院在线观看| 婷婷色综合www| 亚洲视频免费观看视频| 久热久热在线精品观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人手机av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 老司机影院毛片| 2018国产大陆天天弄谢| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产探花极品一区二区| 视频区图区小说| 99久国产av精品国产电影| 老女人水多毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品国产a三级三级三级| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲三区欧美一区| 久久久国产精品麻豆| 视频区图区小说| 欧美日韩av久久| 久久久久精品人妻al黑| 中文字幕色久视频| 9热在线视频观看99| 深夜精品福利| 女人精品久久久久毛片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 一二三四在线观看免费中文在| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩大片免费观看网站| 国产精品免费视频内射| 老司机影院毛片| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品第二区| 亚洲中文av在线| 大片电影免费在线观看免费| 成人二区视频| 欧美激情高清一区二区三区 | 日韩三级伦理在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 看免费成人av毛片| 精品久久蜜臀av无| 国产成人欧美| 亚洲一码二码三码区别大吗| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜影院在线不卡| 亚洲第一av免费看| 午夜福利视频精品| 国产野战对白在线观看| 国产精品av久久久久免费| www.精华液| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 满18在线观看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲图色成人| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜91福利影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲成人av在线免费| 久久久精品94久久精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 三上悠亚av全集在线观看| 大香蕉久久成人网| 五月天丁香电影| 亚洲精品美女久久av网站| 97在线视频观看| 韩国精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 久久午夜福利片| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| a级毛片黄视频| 成人免费观看视频高清| 中文字幕最新亚洲高清| 91成人精品电影| av免费观看日本| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 少妇人妻久久综合中文| 黄色视频在线播放观看不卡| 九草在线视频观看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产乱人偷精品视频| 一级,二级,三级黄色视频| av国产精品久久久久影院| videos熟女内射| 在线观看免费日韩欧美大片| 我要看黄色一级片免费的| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品久久久久久久性| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜影院在线不卡| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 在线天堂最新版资源| 天美传媒精品一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 少妇人妻 视频| 免费黄色在线免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久热这里只有精品99| 黑人猛操日本美女一级片| 两个人免费观看高清视频| 夫妻午夜视频| 精品人妻在线不人妻| 日韩av免费高清视频| 秋霞伦理黄片| 一边亲一边摸免费视频| 男人添女人高潮全过程视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| tube8黄色片| 成人国语在线视频| 欧美av亚洲av综合av国产av | 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品一区蜜桃| 少妇人妻久久综合中文| 伊人久久国产一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人91sexporn| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 七月丁香在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久国产一区二区| h视频一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产综合精华液| 亚洲中文av在线| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜福利,免费看| 色视频在线一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕av电影在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费日韩欧美在线观看| 一级片免费观看大全| 一区二区三区激情视频| 婷婷色综合大香蕉| 新久久久久国产一级毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 中国国产av一级| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久人妻熟女aⅴ| 久久热在线av| 三上悠亚av全集在线观看| 七月丁香在线播放| 考比视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 老鸭窝网址在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩一区二区视频免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老汉色av国产亚洲站长工具| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产色片| 人成视频在线观看免费观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美bdsm另类| 日本91视频免费播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品国产国语对白av| 男的添女的下面高潮视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲av成人精品一二三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲视频免费观看视频| 久久热在线av| 国产又色又爽无遮挡免| 日本av手机在线免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品一国产av| 老女人水多毛片| 制服人妻中文乱码| 伦理电影大哥的女人| av女优亚洲男人天堂| 婷婷色综合大香蕉| 国产日韩欧美在线精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲成色77777| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品成人在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久亚洲国产成人精品v| 高清不卡的av网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 久久久国产欧美日韩av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 丝袜喷水一区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产在线免费精品|