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    大薊抗結(jié)核桿菌的活性成分及作用機(jī)制研究

    2021-11-08 07:38:24萬成杰張春菁謝宗會楊再昌
    中草藥 2021年21期

    萬成杰,張春菁,謝宗會,楊再昌, 2*

    大薊抗結(jié)核桿菌的活性成分及作用機(jī)制研究

    萬成杰1,張春菁1,謝宗會1,楊再昌1, 2*

    1. 貴州大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽 550025 2. 貴州醫(yī)科大學(xué),省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550014

    從大薊根中分離抗結(jié)核桿菌活性成分,并初步探討其抗結(jié)核桿菌的作用機(jī)制。采用活性跟蹤分離方法,從大薊根中分離抗結(jié)核桿菌活性成分,運(yùn)用棋盤試驗(yàn)法研究大薊活性成分與異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的聯(lián)合抗菌作用,運(yùn)用分子對接軟件初步探討活性單體成分與KatG酶的親和力,采用qRT-PCR法考察活性化合物干預(yù)結(jié)核分枝桿菌后KatG酶基因的相對轉(zhuǎn)錄量,采用紫外分光光度法測定KatG酶的活力,采用掃描電鏡觀察結(jié)核桿菌的形態(tài)。從大薊根分離得到具有抗結(jié)核桿菌活性的化合物HP01,鑒定為槲皮素。槲皮素抑制結(jié)核桿菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值為160 μg/mL。槲皮素與吡嗪酰胺存在相加作用,與異煙肼、利福平無拮抗作用。分子對接顯示,槲皮素與KatG酶具有較強(qiáng)的親和力。酶活力測試結(jié)果表明槲皮素對結(jié)核桿菌KatG酶具有抑制作用。結(jié)核桿菌被槲皮素處理后其基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)明顯的補(bǔ)償上調(diào)。掃描電鏡結(jié)果顯示,槲皮素能破壞結(jié)核桿菌細(xì)胞壁。大薊抗結(jié)核桿菌的活性成分為槲皮素,槲皮素能夠抑制結(jié)核桿菌KatG酶活性,導(dǎo)致結(jié)核桿菌結(jié)構(gòu)破壞,從而殺死結(jié)核桿菌。在設(shè)計(jì)新的抗結(jié)核組合用藥方案時(shí),可以考慮加入槲皮素。

    大薊;結(jié)核桿菌;活性成分;作用機(jī)制;KatG酶;槲皮素

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的重大傳染病之一,以潛伏期長、易復(fù)發(fā)為主要特征,主要通過呼吸道進(jìn)行傳播,可侵犯全身各器官,以肺結(jié)核最為常見。據(jù)2020年WHO《全球結(jié)核病報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示,2019年全球結(jié)核潛伏感染人群約為20億,約有1000萬人罹患結(jié)核病。中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,耐利福平結(jié)核病患者數(shù)量居全球第2位(6.5萬,占全球14%),耐藥菌流行使我國結(jié)核病的防控變得更為復(fù)雜。發(fā)現(xiàn)新藥是控制結(jié)核病的有效手段之一。

    大薊為菊科植物大薊Fisch. DC.的干燥地上部分或根,在我國大部分地區(qū)均有分布[1-2]。據(jù)報(bào)道,大薊具有抗菌、降血壓、抗腫瘤、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、殺線蟲等多種藥理活性[3-8],在《唐本草》《本草新編》《滇南本草》《本草通玄》等中醫(yī)藥古籍中均有記載?!妒幧駮肥俏覈F(xiàn)存最早的結(jié)核病治療專著,作者為元代的葛可久,結(jié)核在中國古代稱為癆瘵、鬼疰、尸疰、癆病等?!妒幧駮方榻B了10個(gè)治療結(jié)核的方劑,第1個(gè)叫“十灰散”,該方由大薊、小薊、荷葉、扁柏葉、茅根、茜草根、山梔、大黃、牡丹皮、棕櫚皮10味藥組成。此外《滇南本草》記載,大薊“散瘰疬結(jié)核,治結(jié)核于項(xiàng)左右”。基于古代典籍、現(xiàn)代研究報(bào)道[9]和本課題組的前期研究結(jié)果[10],對大薊根的抗結(jié)核桿菌活性進(jìn)行了體外研究。

    采用活性跟蹤分離法,從大薊根分離純化活性化合物,并鑒定活性單體成分的結(jié)構(gòu)為槲皮素;研究活性單體成分與異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的聯(lián)合抗菌作用;通過掃描電鏡、分子對接、qRT-PCR、酶活力測定等,初步揭示活性單體成分的抗結(jié)核桿菌機(jī)制。本研究為大薊的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù),為研發(fā)新型抗結(jié)核桿菌藥物提供了新的思路。

    1 材料

    1.1 藥材

    大薊根挖采自貴陽市南明區(qū)永樂鄉(xiāng)魚梁河谷,經(jīng)貴州大學(xué)藥學(xué)院楊再昌教授鑒定為菊科植物大薊Fisch. DC.的根。

    1.2 藥品與試劑

    Middle brook 7H9培養(yǎng)基購自美國Sigma公司;薄層硅膠板GF254和200~300目硅膠購自青島海洋化工集團(tuán)公司;改良羅氏培養(yǎng)基基礎(chǔ)夠自上海博微生物科技有限公司;甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、石油醚等均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 儀器

    StepOne型qRT-PCR儀(美國ABI公司);微量分光光度計(jì)(美林恒通儀器有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司);電泳儀(北京六一生物科技有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)。

    2 方法

    2.1 大薊根抗結(jié)核桿菌成分的活性跟蹤分離

    2.1.1 大薊根的提取與萃取分段 將大薊根(10 kg)洗凈切碎后,自然晾干,粉碎。分批用80%乙醇回流提取3次,每次1 h,濾過,合并提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮,將濃縮液水浴蒸干,得到乙醇提取物浸膏。將乙醇提取物浸膏溶于適量10%乙醇溶液中,依次用石油醚、醋酸乙酯反復(fù)萃取至無色,濃縮得到石油醚萃取物(92 g)、醋酸乙酯萃取物(110 g)和水相剩余部分(245 g)。采用刃天青顯色法[11],對大薊提取物的不同萃取部位進(jìn)行活性跟蹤,發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯萃取物抗結(jié)核桿菌活性最強(qiáng),因此將醋酸乙酯萃取部位視為有效部位。

    2.1.2 大薊醋酸乙酯部位抗結(jié)核桿菌的活性跟蹤分離 采用正相硅膠柱色譜對醋酸乙酯萃取物進(jìn)行分離,流動(dòng)相為石油醚-醋酸乙酯(10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1),梯度洗脫,得到6個(gè)組分,分別為F1(3.5 g)、F2(4.6 g)、F3(7.2 g)、F4(8.6 g)、F5(7.4 g)和F6(12.2 g),活性跟蹤發(fā)現(xiàn)有效組分為F5。將F5經(jīng)硅膠柱色譜繼續(xù)梯度洗脫,洗脫劑為石油醚-醋酸乙酯,洗脫液按薄層色譜結(jié)果進(jìn)行合并,最終共得到4個(gè)亞組分,分別為Fr1(1.4 g)、Fr2(1.7 g)、Fr3(1.2 g)、Fr4(0.7 g)?;钚愿櫛砻饔行ЫM分為Fr2,F(xiàn)r2經(jīng)硅膠柱色譜及制備薄層色譜分離純化,得到單體化合物HP01(200 mg)。

    2.2 抗結(jié)核桿菌活性測試

    2.2.1 H37Rv菌懸液的制備 從改良羅氏培養(yǎng)基中取新鮮分枝桿菌(H37Rv)培養(yǎng)物約10 mg,加入到4 mL 7H9培養(yǎng)基中研磨,菌懸液調(diào)整至麥?zhǔn)瞎?.0的濁度,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.2 Middle brook 7H9培養(yǎng)基的制備 精確稱定Middle brook 7H9培養(yǎng)基4.7 g,加入1 L水、2 mL甘油,攪拌溶解,混合均勻,分裝于150 mm×15 mm的玻璃試管中,每管總體積2 mL。

    2.2.3 樣本溶液的制備 樣本均用二甲基亞砜(DMSO)制成母液,采用二倍稀釋法,用Middle brook 7H9培養(yǎng)基配制成系列濃度(DMSO的終濃度<5%),每個(gè)濃度平行制備3管,陽性對照組為含有1 μg/mL異煙肼的培養(yǎng)基,陰性對照組為不加藥物但含5% DMSO的培養(yǎng)基。

    2.2.4 活性測試 將制備好的含藥試管置于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌30 min,冷卻至25 ℃,每管分別接種20 μL H37Rv菌懸液,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,然后加入15 μL 0.01%刃天青染色液,搖勻后將其置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)期間每半小時(shí)觀察1次,并做好相應(yīng)的記錄,當(dāng)發(fā)現(xiàn)陰性對照組溶液變紅,而陽性對照組未變色時(shí),培養(yǎng)結(jié)束,觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣本的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值定義為培養(yǎng)基保持藍(lán)色的最小濃度。

    2.3 HP01與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)

    采用棋盤試驗(yàn)法,按照文獻(xiàn)方法[12]操作,采用聯(lián)合抑菌指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,F(xiàn)ICI)判斷結(jié)果:FICI≤0.5,協(xié)同作用;0.5<FICI≤1,相加作用;1<FICI≤2,無關(guān)作用;FICI>2,拮抗作用。

    2.4 HP01與結(jié)核桿菌KatG酶的分子對接

    2.4.1 小分子配體的準(zhǔn)備 預(yù)試驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)HP01對結(jié)核桿菌KatG具有抑制作用,因此,進(jìn)行分子對接研究。使用ChemDraw Professional 15.0軟件繪制配體小分子HP01的結(jié)構(gòu)式,然后將其二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu),將三維結(jié)構(gòu)拷貝到Discovery Studio 2016軟件中,通過該軟件進(jìn)行加氫、去除重復(fù)鏈、產(chǎn)生異構(gòu)體、互變異構(gòu)體和三維構(gòu)象,最后加CHARMm力場進(jìn)行能量最優(yōu)化。

    2.4.2 KatG蛋白的準(zhǔn)備 從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中檢索并下載結(jié)核桿菌KatG蛋白晶體結(jié)構(gòu),并對其進(jìn)行刪除水分子、去除原配體、加氫等預(yù)處理。

    2.4.3 分子對接 將準(zhǔn)備好的受體蛋白與小分子配體導(dǎo)入到Discovery Studio 2016軟件中,點(diǎn)擊Receptor-Ligand Interaction/Dock Ligands,點(diǎn)擊Lib Dock進(jìn)行分子對接,設(shè)置對接參數(shù)為Conformation Method:BEST,Docking Preferences:High Quality,其余參數(shù)均為默認(rèn)值,參數(shù)設(shè)置完成后點(diǎn)擊Run進(jìn)行分子對接,對接完成后,LibDock Score由高到低依次排列,對打分結(jié)果進(jìn)行分析。

    2.5 HP01對結(jié)核桿菌KatG酶的抑制活性

    取新鮮培養(yǎng)的結(jié)核桿菌約100 mg加入離心管中,向其中加入4 mL溶菌酶溶液(用0.05 mol/L PBS液配制,pH 7.2),混勻,多次攪拌后離心,上清液即為粗酶液。實(shí)驗(yàn)在試管中進(jìn)行,調(diào)整酶液吸光度(240)至0.5,用酶液調(diào)零。對照組:酶液3 mL,PBS溶液1 mL;加藥組:酶液3 mL,含藥(HP01)PBS溶液1 mL,HP01的終質(zhì)量濃度為160 μg/mL(MIC)。對照組、加藥組均放置于25 ℃水浴中,2 h后,同時(shí)加入過氧化氫溶液(終濃度為20 μmol/L),2 min后,立即測定240值,計(jì)算抑制率。

    抑制率=(加藥-對照)/對照

    2.6 HP01對KatG基因轉(zhuǎn)錄的影響

    2.6.1 樣品制備 分別用80、160 μg/mL HP01處理結(jié)核桿菌,陰性對照組為不含藥的7H9培養(yǎng)基,相同條件下培養(yǎng)48 h,離心后取沉淀部分提取RNA。

    2.6.2 設(shè)計(jì)與合成引物 在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中查找有關(guān)結(jié)核桿菌H37Rv菌株中基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所需要的引物,并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,內(nèi)參基因?yàn)椤R镄蛄校荷嫌我?38F-5’ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’,下游引物518R-5’ATTACCGCGGCTGCTGG-3’;上游引物5’-GAGCAACACCCACCCATTACA-3’,下游引物5’-GTTTTGGTGCAGTACCTTCAGATT-3’。

    2.6.3 RNA抽取及檢測 按UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(B511321)說明書提取總RNA,用微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度。

    2.6.4 cDNA模板的合成 按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(6210A)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成,?20 ℃保存。

    2.6.5 qRT-PCR檢測 qRT-PCR反應(yīng)按照UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(B511321)說明書進(jìn)行。采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

    2.7 HP01對結(jié)核桿菌的形態(tài)學(xué)干預(yù)

    結(jié)核桿菌分別培養(yǎng)在HP01質(zhì)量濃度為160、320、640 μg/mL的7H9培養(yǎng)基中,并設(shè)置陰性對照組,37 ℃培養(yǎng)48 h后離心,取沉渣制樣,用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

    3 結(jié)果

    3.1 不同萃取部位的活性跟蹤

    采用刃天青顯色法,對大薊乙醇提取物的不同萃取部位進(jìn)行活性測試,醋酸乙酯萃取物的MIC值為320 μg/mL,其余部位MIC值應(yīng)大于640 μg/mL(表1)??梢姶姿嵋阴ポ腿∥锸强菇Y(jié)核桿菌的有效部位。醋酸乙酯萃取部位通過硅膠柱色譜分離,得到6個(gè)組分F1~F6,活性測試結(jié)果見表2,可以確定F5為有效組分。對F5的4個(gè)亞組分Fr1~Fr4進(jìn)行活性跟蹤,確定Fr2為活性亞組分,對Fr2進(jìn)一步純化,得到化合物HP01,化合物HP01抗結(jié)核桿菌的MIC值為160 μg/mL。

    表1 大薊不同萃取部位的抗結(jié)核桿菌活性

    “+”表示有活性,“—”表示無活性,表2同

    “+” means active, “—” means inactive, same as table 2

    表2 大薊醋酸乙酯萃取部位的活性跟蹤

    3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物HP01:黃色粉末。1H-NMR (400 MHz,MeOD): 6.89 (1H, s, H-2′), 7.62 (1H, d,= 44 Hz, H-6′), 7.73 (1H, d,= 44 Hz, H-5′), 6.38 (1H, s, H-8), 6.18 (1H, s, H-6), 12.26 (1H, s, OH-5), 10.26 (1H, s, OH-7), 9.32 (1H, s, OH-3), 9.09 (1H, s, OH-4′), 8.63 (1H, s, OH-3′);13C-NMR (100 MHz, MeOD): 175.9 (C-4), 164.2 (C-7), 161.1 (C-5), 156.8 (C-9), 147.4 (C-2), 146.6 (C-4′), 144.8 (C-3′), 135.8 (C-3), 122.8 (C-1′), 120.3 (C-6′), 114.8 (C-5′), 114.6 (C-2′), 103.1 (C-10), 97.8 (C-6), 93.0 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13],故鑒定HP01為槲皮素(圖1)。

    3.3 HP01與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    按照棋盤實(shí)驗(yàn)方法,評價(jià)HP01與一線抗結(jié)核藥物的協(xié)同作用,結(jié)果見表3。HP01與吡嗪酰胺存在相加作用,可以降低吡嗪酰胺的MIC值4倍,HP01不影響異煙肼、利福平的抗結(jié)核桿菌活性??梢奌P01與異煙肼、利福平不存在拮抗作用,能增強(qiáng)吡嗪酰胺的抗結(jié)核桿菌作用,具有與一線藥物組合治療結(jié)核病的潛質(zhì)。

    圖1 HP01的結(jié)構(gòu)

    3.4 分子對接結(jié)果

    從化合物HP01與受體蛋白KatG對接后的二維圖(圖2)可以看到,化合物HP01能夠與KatG很好地結(jié)合,化合物HP01與KatG的氨基酸殘基GLY32、GLU195、GLN36形成氫鍵,與LYS46形成Pi-Cation相互作用,與GLN36形成1個(gè)Pi-Sigma吸引作用(圖3),打分結(jié)果為107.93,這些作用力穩(wěn)定了復(fù)合物構(gòu)象,推測受體蛋白KatG可能是化合物HP01的作用靶點(diǎn)。

    3.5 化合物HP01對結(jié)核桿菌KatG酶的干預(yù)作用

    對照組240為0.517±0.014,HP01組240為0.554±0.012,表明化合物HP01對結(jié)核桿菌KatG酶存在抑制作用。盡管抑制率僅為7.2%,但是足以導(dǎo)致結(jié)核桿菌內(nèi)的H2O2大量累積,從而對結(jié)核桿菌生命力產(chǎn)生影響,并最終導(dǎo)致結(jié)核桿菌死亡。

    表3 HP01與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺的聯(lián)合抗菌試驗(yàn)

    圖2 化合物HP01與KatG的相互作用二維圖

    3.6 KatG基因相對定量結(jié)果

    如圖4所示,與對照組相比,經(jīng)化合物HP01(160 μg/mL)處理后基因相對表達(dá)量明顯上調(diào)(<0.01),呈劑量相關(guān)性??梢奌P01抑制結(jié)核桿菌KatG后,結(jié)核桿菌基因出現(xiàn)明顯的補(bǔ)償表達(dá)。

    3.7 HP01對結(jié)核桿菌形態(tài)學(xué)的影響

    如圖5所示,陰性對照組結(jié)核桿菌形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,呈短棒狀、細(xì)長略帶彎曲。經(jīng)HP01處理后,結(jié)核桿菌菌體變成球狀、變形、菌體破裂??梢娀衔颒P01能破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致結(jié)核桿菌死亡。

    圖3 化合物HP01與KatG的相互作用三維圖

    與對照組比較:**P<0.01

    4 討論

    結(jié)核病至今仍是全球十大致死原因之一,尤其是耐藥結(jié)核桿菌逐漸增多,使結(jié)核病的防控形勢更加嚴(yán)峻。吡嗪酰胺是縮短結(jié)核治療時(shí)間、降低結(jié)核病復(fù)發(fā)率的關(guān)鍵藥物,但是吡嗪酰胺肝毒性大,由于耐吡嗪酰胺菌株較多,臨床上普遍大劑量使用吡嗪酰胺,這使得吡嗪酰胺的毒性問題更加突出[14-15]。因此,尋找能增強(qiáng)吡嗪酰胺藥效、減少其用量的藥物對結(jié)核病治療具有重大意義[16]。

    本研究從大薊跟蹤分離出抗結(jié)核桿菌活性分子,鑒定為槲皮素,槲皮素單獨(dú)使用,在體外抑制結(jié)核桿菌的MIC值較高(160 μg/mL),但是聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí),槲皮素能增強(qiáng)吡嗪酰胺的抗結(jié)核桿菌作用,并且與異煙肼、利福平無拮抗作用,槲皮素的這一特征為設(shè)計(jì)新型抗結(jié)核聯(lián)合用藥方案提供了參考。

    圖5 結(jié)核桿菌的掃描電鏡結(jié)果

    槲皮素能夠抑制結(jié)核桿菌KatG酶,該酶主要負(fù)責(zé)清除菌體內(nèi)的H2O2,H2O2是重要的氧自由基,可破壞結(jié)核桿菌的大分子[17],抑制KatG酶將導(dǎo)致結(jié)核桿菌細(xì)胞內(nèi)H2O2過度累積,使結(jié)核桿菌的重要結(jié)構(gòu)比如細(xì)胞壁被破壞,產(chǎn)生殺菌作用。為了進(jìn)一步證實(shí)槲皮素的抗菌機(jī)制,采用分子對接模擬發(fā)現(xiàn)槲皮素與KatG酶存在較強(qiáng)的親和力。用槲皮素處理結(jié)核桿菌后,基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)補(bǔ)償性上調(diào),呈劑量相關(guān)性。這些結(jié)果提示,槲皮素通過抑制結(jié)核桿菌KatG酶,造成細(xì)胞內(nèi)H2O2累積,產(chǎn)生結(jié)構(gòu)破壞,從而殺死結(jié)核桿菌。掃描電鏡結(jié)果顯示,經(jīng)槲皮素處理后,結(jié)核桿菌出現(xiàn)體積膨大、形狀變化和菌體破裂等變化,表明細(xì)胞壁被破壞,這些變化可能是由于細(xì)胞內(nèi)H2O2過度累積引起。有待采用X射線衍射技術(shù),證實(shí)槲皮素與KatG酶形成復(fù)合物。

    大薊是常用中草藥,《十藥神書》明確大薊可用于癆病治療,本研究證實(shí),大薊的槲皮素成分具有抗結(jié)核桿菌活性。槲皮素是存在于多種植物中的一種黃酮類化合物,具有廣泛的生物學(xué)活性[18-20],本研究提示槲皮素抗結(jié)核桿菌的活性不算很強(qiáng),使用槲皮素分子原型用于結(jié)核病治療缺乏臨床可行性,但是槲皮素可能是通過抑制KatG酶而發(fā)揮抗結(jié)核桿菌作用,其作用機(jī)制較為新穎,因此,下一步擬對槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,合成抗結(jié)核桿菌活性更強(qiáng)、具有成藥性的分子,并結(jié)合動(dòng)物感染模型進(jìn)行體內(nèi)藥效驗(yàn)證。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] 植飛, 孔令義, 彭司勛. 中藥大薊的化學(xué)及藥理研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2001, 32(7): 664-667.

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    Component with activity againstfromand its anti-mechanism

    WAN Cheng-jie1, ZHANG Chun-jing1, XIE Zong-hui1, YANG Zai-chang1, 2

    1. School of Pharmaceutical Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China 2. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Medical University, Guiyang 550014, China

    To isolate the anti-active components from roots of,and preliminarily explore the anti-mechanism.Using bioassay-guided isolation method to isolate active molecules againstfrom roots ofThe checkerboard test was used to study the synergic effects of active ingredients with isoniazid, rifampicin and pyrazinamide. Using molecular docking software to preliminarily explore the affinity between active monomer and KatG. qRT-PCR was used to study the relative transcription ofgene after the active compound interfered with. KatG activity was determined by ultraviolet spectrophotometry. Scanning electron microscope was used to observe the morphology of.Compound HP01 with anti-activity was isolated from roots of,and was identified as quercetin. Quercetin inhibitedwith a MIC value of 160 μg/mL. Quercetin had an additive effect with pyrazinamide, but had no antagonistic effect with isoniazid and rifampicin. Molecular docking showed that quercetin had a strong affinity with KatG. The enzyme activity test showed that quercetin had an inhibitory effect on KatG of. Afterwas treated with quercetin, the transcription ofgene showed a compensatory up-regulation. Scanning electron microscopy showed that quercetin could destroy the cell wall oftuberculosis.The active component ofagainstwas quercetin. Quercetin could killby inhibiting KatG ofand causing structural damage. When designing a new anti-tuberculosis combination regimen, quercetin can be considered.

    DC.;; active component; mechanism of action; KatG; quercetin

    R285.5

    A

    0253 - 2670(2021)21 - 6561 - 07

    10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.014

    2021-05-25

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(82060635);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81760629);貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(SY字[2013]3058號);“國重室開放課題”及“黔科合平臺人才”([2017]5101)

    萬成杰(1994—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)榭菇Y(jié)核分枝桿菌化合物。E-mail: 1536590611@qq.com

    楊再昌,男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師。Tel: (0851)8308717 E-mail: yangzaichangzm@163.com

    [責(zé)任編輯 李亞楠]

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