腦泰方調(diào)控細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)抑制鐵死亡保護(hù)腦卒中缺血損傷的機(jī)制研究

饒政清，梅志剛，葛金文，楊 梅，米招娣，蘭 斌，楊 彤，王國佐

腦泰方調(diào)控細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)抑制鐵死亡保護(hù)腦卒中缺血損傷的機(jī)制研究

饒政清，梅志剛，葛金文，楊 梅，米招娣，蘭 斌，楊 彤，王國佐*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208

探討腦泰方是否通過調(diào)控?zé)嵝菘宿D(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1，HSF1）/熱休克蛋白B1（heat shock proteins B1，HSPB1）通路降低腦鐵沉積、抑制活性氧沉積及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生、減輕神經(jīng)元鐵死亡，從而發(fā)揮腦卒中缺血損傷保護(hù)作用。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦泰方（27 g/kg）組和去鐵酮（125 mg/kg）組，給予藥物干預(yù)。通過大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法制備腦缺血大鼠模型，術(shù)后2 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分及取材。TTC染色法檢測腦梗死體積；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及損傷情況；尼氏染色觀察腦組織尼氏體數(shù)目；普魯士藍(lán)染色觀察腦組織神經(jīng)元內(nèi)鐵聚集水平；免疫組化及Western blotting法檢測腦組織HSF1、HSPB1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）和鐵蛋白重鏈多肽（ferritin heavy polypeptide1，F(xiàn)TH1）蛋白表達(dá)；鐵離子檢測試劑盒與丙二醛檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒檢測腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量。與模型組比較，腦泰方組大鼠腦梗死體積減少，神經(jīng)功能評分降低（＜0.01）；腦缺血區(qū)尼氏體增多，細(xì)胞損傷程度降低；含鐵聚集顆粒細(xì)胞的數(shù)目減少；腦鐵、丙二醛及活性氧含量降低（＜0.05、0.01）；腦組織HSF1、HSPB1及FTH1蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.05、0.01），TFR1蛋白表達(dá)下調(diào)（＜0.05）。腦泰方可能通過上調(diào)HSF1/HSPB1通路，抑制TFR1的表達(dá)以減少神經(jīng)元鐵的吸收，上調(diào)FTH1的表達(dá)以增加鐵蛋白的鐵存儲，以此調(diào)控鐵代謝穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)而抑制因過量的鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧及隨后脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物引起的缺血性腦卒中神經(jīng)元鐵死亡。

腦卒中；鐵死亡；HSF1/HSPB1通路；細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)；腦泰方

腦卒中是目前世界上排名第2的致死性疾病，每年約有79.5萬人新發(fā)或復(fù)發(fā)腦卒中，其中87%為缺血性腦卒中，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)[1]。鐵是體內(nèi)重要的微量元素，鐵在體內(nèi)的分布及含量異常會(huì)影響正常的生理過程，鐵的生物毒性最重要的機(jī)制在于這種金屬催化的芬頓反應(yīng)中，過量的鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧促進(jìn)了脂質(zhì)的過氧化作用從而導(dǎo)致鐵死亡[2-3]。由于鐵在脂質(zhì)過氧化生物學(xué)過程中介導(dǎo)活性氧產(chǎn)生及酶活性發(fā)揮著重要作用，因此鐵死亡受鐵代謝生物學(xué)過程中鐵的吸收、出口、利用、儲存共同調(diào)節(jié)[4-5]。研究表明，鐵代謝紊亂及鐵死亡與缺血性腦卒中密切相關(guān)，鐵代謝紊亂是缺血性腦卒中后神經(jīng)元損傷的重要病理過程，而鐵死亡是其病理結(jié)局之一[6-7]。腦泰方是本課題組研發(fā)的治療缺血性腦卒中的有效中藥方劑，具有較好的防治急性缺血性腦卒中的療效[8]，可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵代謝及降低鐵沉積水平達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)的作用[9-10]。然而，目前腦泰方對神經(jīng)元鐵死亡的調(diào)控機(jī)制仍尚不明了。

熱休克蛋白B1（heat shock proteins B1，HSPB1）是分布最廣和研究最多的小熱休克蛋白，其水平以熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1，HSF1）依賴性方式上調(diào)[11-12]。HSPB1能在大腦缺血及梗塞周圍區(qū)域上調(diào)，其過度表達(dá)可減少梗塞面積，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用[13-14]。近來研究發(fā)現(xiàn)，HSF1/HSPB1通路調(diào)控的細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)與鐵死亡密切相關(guān)，HSF1/HSPB1通路對鐵死亡的負(fù)向調(diào)控作用為鐵死亡的分子機(jī)制提供了新的見解[11]。本研究通過制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，以HSF1/HSPB1通路調(diào)控細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)抑制鐵死亡為切入點(diǎn)，探討腦泰方是否可通過調(diào)控HSF1/HSPB1通路以降低鐵沉積、活性氧沉積及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而抑制神經(jīng)元鐵死亡并發(fā)揮對MCAO大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠68只，8周齡，體質(zhì)量220～240 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號430727211100162143。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)號LLBH-202006050001）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.2 藥物

腦泰方由黃芪40 g、川芎10 g、地龍15 g、僵蠶15 g組成，黃芪（批號CK20092801）、川芎（批號TH20112403）、地龍（批號2020120403）、僵蠶（批號HH20081903）購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室劉林副教授鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、傘形科植物川芎Hort.的根莖、鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓(E. Perrier)的去內(nèi)臟全體、蠶蛾科昆蟲家蠶Linnaeus 4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵蠶(Bals.) Vuilknt而致死的干燥體。

去鐵酮片（deferiprone，DFP）是一種FDA批準(zhǔn)的口服鐵螯合劑，經(jīng)口服能有效降低鐵沉積的臨床藥物（加拿大奧貝泰克制藥有限公司，注冊證號H20140379）。

1.3 試劑

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1，HSF1）多克隆抗體（批號bs-3757R）購自博奧森生物技術(shù)有限公司，用于Western blotting及免疫組化檢測；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）多克隆抗體（批號BA0462）購自博士德生物工程有限公司，熱休克蛋白B1（heat shock proteins B1，HSPB1）多克隆抗體（批號bs-0730R）及鐵蛋白重鏈多肽1（ferritin heavypoly peptide1，F(xiàn)TH1）多克隆抗體（批號bs-5907R）購自博奧森生物技術(shù)有限公司，用于免疫組化檢測；熱休克蛋白B1單克隆抗體（批號M00676-5）、羊抗小鼠IgG（H＋L）（批號BA1050）購自博士德生物工程有限公司，F(xiàn)TH1單克隆抗體（批號A19544）、TFR1多克隆抗體（批號A5865）購自愛博泰克生物科技有限公司，β-actin多克隆抗體（批號bs-0061R）購自博奧森生物技術(shù)有限公司，羊抗兔IgG（H＋L）（批號SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，均用于Western blotting檢測；尼氏染色液（批號C0117）及活性氧檢測試劑盒（批號S0033）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒（批號G1428）、伊紅染色液（批號G1108）、Mayer蘇木素染液（批號G1080）、組織鐵含量檢測試劑盒（批號BC4350）、丙二醛含量檢測試劑盒（批號BC0025）、2% TTC染色液（批號G3005）均購自索萊寶科技有限公司；通用二步法檢測試劑盒（批號PV9000）及DAB試劑盒（批號ZLI-9018）均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

凝膠成像分析儀、多功能酶標(biāo)儀、光學(xué)顯微鏡（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)及石蠟切片機(jī)（英國Dynamica公司）；可見分光光度計(jì)（舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 腦泰方提取物的制備

黃芪、川芎、地龍、僵蠶4味中藥按4∶1∶1.5∶1.5比例組成，加入10倍量蒸餾水，浸泡1 h，沸水煎煮1 h，經(jīng)紗布濾過，重復(fù)以上步驟1次，合并2次濾液，經(jīng)加熱濃縮制成浸膏，于真空干燥箱中干燥成粉末，于干燥器中存儲（1 g浸膏粉含4 g生藥，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備)，臨用前加入蒸餾水溶解。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對粉末進(jìn)行定量分析，其中黃芪甲苷171.5 μg/g、阿魏酸31.5 μg/g。

2.2 分組及給藥途徑

參考課題組前期研究[10,15]，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦泰方組（27 g/kg）和去鐵酮（125 mg/kg）組，每組17只。腦泰方浸膏粉溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為2.7 g/mL的溶液，腦泰方組ig藥物，假手術(shù)組及模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d；去鐵酮組ig去鐵酮，1次/d，連續(xù)3 d，于MCAO術(shù)后2 h取材。

2.3 MCAO模型的制備

大鼠ip 10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照Longa法制備MCAO模型[16]，假手術(shù)組只行麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎血管及導(dǎo)入栓線。

2.4 神經(jīng)功能評分

參考Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分[16]：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀且活動(dòng)正常；1分：提住大鼠的尾巴時(shí)，病灶對側(cè)前肢不能完全伸直；2分：大鼠爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠爬行時(shí)肢體向?qū)?cè)傾倒；4分：大鼠不能自發(fā)行走且意識喪失。分值越高說明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重，1～3分為造模成功。

2.5 TTC染色檢測

大鼠MCAO術(shù)后2 h，ip 10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉，取全腦，用0.9%氯化鈉溶液洗滌并于?20 ℃速凍30 min，沿大鼠大腦冠狀面將大腦切成5片，每片厚約2 mm；放入2% TTC染色液中，37 ℃避光染色30 min，每10分鐘輕微振蕩數(shù)次；染色后用4%多聚甲醛固定并拍照，腦正常區(qū)為紅色，腦缺血梗死區(qū)為白色。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色

石蠟切片烘烤、脫蠟和水化，進(jìn)行HE染色，脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.7 尼氏染色

石蠟切片烘烤、脫蠟和水化、尼氏染色液染色、脫水、透明、封片等具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照尼氏染色液試劑說明書進(jìn)行操作，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 普魯士藍(lán)染色

石蠟切片烘烤、脫蠟和水化、Perl’s染色工作液反應(yīng)、孵育工作液孵育、增強(qiáng)工作液反應(yīng)、復(fù)染染色液反應(yīng)、脫水、透明、封片等具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照普魯士藍(lán)染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，于顯微鏡下觀察并拍照。

5. 大數(shù)據(jù)時(shí)代的政府審計(jì)數(shù)據(jù)安全性與保密性問題突出。大數(shù)據(jù)技術(shù)能夠把不同來源的、單一價(jià)值低的信息進(jìn)行綜合分析，從而得到有價(jià)值的信息，對信息的保密性與安全性提出較高要求。與此同時(shí)，政府審計(jì)過程中會(huì)接觸和利用各種涉密資料和數(shù)據(jù)，無論是單位層面的財(cái)務(wù)和內(nèi)部管理資料，還是國家層面密級較高的信息和數(shù)據(jù)，其泄露都可能給國家和被審計(jì)單位造成難以彌補(bǔ)的損失。大數(shù)據(jù)時(shí)代快速的數(shù)據(jù)處理、傳播速度，要求每一個(gè)審計(jì)人員都應(yīng)該加強(qiáng)安全意識，時(shí)刻將信息安全控制作為審計(jì)項(xiàng)目控制的重要環(huán)節(jié)來抓；審計(jì)機(jī)關(guān)需要不斷加強(qiáng)授權(quán)和保密工作，確保數(shù)據(jù)的安全性，尤其是國家機(jī)密、企業(yè)商業(yè)秘密與個(gè)人隱私的安全性。

2.9 免疫組化法檢測大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1和FTH1蛋白表達(dá)

石蠟切片烘烤、脫蠟和水化、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，分別加入HSF1、HSPB1、FTH1（1∶100）及TFR1抗體（1∶300）孵育，加入反應(yīng)增強(qiáng)液反應(yīng)、二抗孵育，進(jìn)行DAB顯色、復(fù)染、分色、返藍(lán)、脫水、透明、封片，切片于光鏡下放大400倍觀察顯色結(jié)果，陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色呈棕黃色，采用Image J軟件分析圖片平均吸光度（）值，平均值為圖片上各點(diǎn)的值之和除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積。

2.10 Western blotting檢測大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1和FTH1蛋白表達(dá)

取各組大鼠腦組織50 mg，按50∶1比例加入RAPI裂解液（400 μL）和蛋白酶抑制劑（80 μL），提取組織蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉，分別加入HSF1（1∶1500）、HSPB1（1∶1500）、TFR1（1∶5000）、FTH1（1∶2500）抗體， 4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶8000），37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩孵育1 h；加入ECL發(fā)光液，采用凝膠成像分析儀顯影曝光，Image Lab軟件對蛋白灰度值進(jìn)行分析。

2.11 大鼠腦組織鐵和丙二醛及活性氧含量檢測

各組大鼠腦組織鐵與丙二醛及活性氧含量均通過試劑盒進(jìn)行檢測，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照各試劑說明書進(jìn)行操作。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 腦泰方對腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分的影響

各組大鼠在術(shù)后2 h行神經(jīng)功能評分，如圖1所示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.2 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織TTC染色的影響

如圖2所示，假手術(shù)組大鼠腦片為紅色，未見白色梗死區(qū)域；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦片出現(xiàn)白色梗死區(qū)域；與模型組比較，各給藥組大鼠腦片白色梗死區(qū)域較少。

3.3 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織HE染色的影響

如圖3所示，假手術(shù)組大鼠海馬CA2區(qū)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常且輪廓較為清晰，未見明顯細(xì)胞核固縮、空泡樣改變、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞腫脹等細(xì)胞損傷的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA2區(qū)部分細(xì)胞可見細(xì)胞間隙增寬及腫脹，且細(xì)胞輪廓欠清晰。與模型組比較，各給藥組大鼠正常細(xì)胞增多，細(xì)胞損傷程度較低，細(xì)胞輪廓大致正常。

與假手術(shù)組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，圖6～9同

圖2 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織TTC染色的影響

圖3 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織HE染色的影響(×400)

3.4 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織普魯士藍(lán)染色的影響

如圖4所示，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)及海馬CA2區(qū)含鐵聚集顆粒細(xì)胞（呈黃棕色到黃褐色）聚集不明顯。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠含鐵聚集顆粒細(xì)胞的數(shù)目增加，且皮質(zhì)區(qū)含鐵聚集顆粒細(xì)胞數(shù)目多于海馬CA2區(qū)（海馬CA2區(qū)含鐵聚集顆粒細(xì)胞數(shù)目變化不顯著）。與模型組比較，各給藥組大鼠含鐵聚集顆粒細(xì)胞的數(shù)目減少，且海馬CA2區(qū)含鐵聚集顆粒細(xì)胞數(shù)目少于皮質(zhì)區(qū)（海馬CA2區(qū)含鐵聚集顆粒細(xì)胞數(shù)目變化不顯著）。

3.5 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織尼氏染色的影響

如圖5所示，假手術(shù)組大鼠海馬CA2區(qū)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常且輪廓較清晰，尼氏體和胞核及胞仁均清晰可辨；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA2區(qū)尼氏體減少，細(xì)胞間隙增寬及腫脹，且細(xì)胞輪廓欠清晰；與模型組比較，各給藥組大鼠海馬CA2區(qū)尼氏體增多，細(xì)胞損傷程度較低。

圖4 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織普魯士藍(lán)染色的影響(×400)

圖5 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織尼氏染色的影響(×400)

3.6 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1和FTH1蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果如圖6、7所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），腦組織FTH1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織HSF1、HSPB1、FTH1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），腦組織TFR1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05）。

Western blotting結(jié)果如圖8所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），F(xiàn)TH1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織HSF1、HSPB1、FTH1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01），TFR1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.7 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量的影響

如圖9所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖6 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織HSF1和HSPB1蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

圖7 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織TFR1和FTH1蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

圖8 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織HSF1、HSPB1、TFR1和FTH1蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

圖9 腦泰方對腦缺血大鼠腦組織腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量的影響(, n = 5)

4 討論

缺血性腦卒中是由于頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈或椎/基底動(dòng)脈阻塞等各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙、氧氣和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）及葡萄糖減少、膜離子泵功能喪失、血腦屏障破壞、線粒體膜完整性破裂等，最終導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死及神經(jīng)功能缺失的一種疾病[1,17-18]。既往研究表明，壞死、凋亡、自噬、程序性壞死、Parthanatos（基于PARP-1的激活的一種程序性細(xì)胞壞死）、焦亡等細(xì)胞死亡形式在缺血性腦卒中的腦損傷機(jī)制中扮演著重要角色[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡作為一種新定義的細(xì)胞死亡形式與缺血性腦卒中密切相關(guān)，鐵超載及鐵依賴性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的堆積可加劇缺血性腦卒中臨床患者或動(dòng)物模型的神經(jīng)元損傷，而鐵死亡抑制劑則可減輕上述損傷[6,19]。

鐵死亡以細(xì)胞內(nèi)鐵沉積為特征，鐵和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是鐵死亡的2個(gè)主要參與者，而發(fā)生鐵死亡的可能性由鐵離子積累誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生和避免脂質(zhì)過氧化的抗氧化系統(tǒng)之間的平衡決定[19-21]。由于鐵在脂質(zhì)過氧化生物學(xué)過程中介導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和酶活性發(fā)揮著重要作用，因此鐵死亡受鐵代謝生物學(xué)過程中鐵的吸收、出口、利用、儲存共同調(diào)節(jié)[5]。研究表明，TFR1可與TF-Fe3+形成復(fù)合物內(nèi)吞入胞體并完成鐵的吸收與釋放，而沉默TFR1編碼的基因TFRC則可抑制TFR1介導(dǎo)的鐵攝取及鐵死亡[21-22]。此外，鐵儲存蛋白復(fù)合物由鐵蛋白輕鏈多肽（ferritin light chain，F(xiàn)TL）與FTH1組成，抑制鐵代謝主要轉(zhuǎn)錄因子鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（iron responsive element binding protein 2，IRFB2）的表達(dá)則可顯著增加FTL和FTH1的表達(dá)及鐵蛋白的鐵儲存水平，從而抑制鐵死亡[23]。

HSPs是一個(gè)高度保守的分子伴侶家族，由細(xì)胞對各種應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生，在生物界普遍存在[24-25]。HSPB1也稱為HSP25（小鼠）和HSP27（人類），是分布最廣和研究最多的小熱休克蛋白，HSFs是調(diào)節(jié)應(yīng)激條件下誘導(dǎo)合成熱休克蛋白的主要轉(zhuǎn)錄因子，HSPB1的水平以HSF1依賴性方式上調(diào)[11-12]。HSPB1轉(zhuǎn)基因小鼠在永久性MCAO后能明顯降低皮質(zhì)的損傷[14]，而小鼠iv HSPB1則可減少大腦中動(dòng)脈阻塞在灌注（transient middle cerebral occlusion，tMCAO）法后的梗塞體積，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用[13]。近來研究發(fā)現(xiàn)，HSF1和HSPB1的敲低增強(qiáng)了erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而熱休克預(yù)處理和HSPB1的過表達(dá)則可抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。HSPB1介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可抑制TFR1介導(dǎo)的鐵攝取及上調(diào)FTH1的表達(dá)，這個(gè)過程抑制了內(nèi)吞作用和轉(zhuǎn)鐵蛋白的循環(huán)，從而降低了細(xì)胞內(nèi)鐵的含量，進(jìn)而抑制了因過量的鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧及隨后的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物引起的鐵死亡[11]。

缺血性腦卒中在中醫(yī)學(xué)中屬“中風(fēng)”病范疇，本病多是在內(nèi)傷積損的基礎(chǔ)上，復(fù)因勞逸失度、情志不遂、飲酒飽食或外邪侵襲等觸發(fā)，引起臟腑陰陽失調(diào)、血隨氣逆、肝陽暴漲、內(nèi)風(fēng)旋動(dòng)、夾痰夾火、橫竄經(jīng)脈、蒙蔽神竅，從而發(fā)生卒然昏仆、半身不遂諸癥。中醫(yī)藥在缺血性腦卒中臨床應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其可在抗興奮性氨基酸和自由基損傷、抑制鈣超載、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬及凋亡、促進(jìn)血管新生和神經(jīng)再生等方面發(fā)揮重要的作用[26-27]。腦泰方是本課題組研發(fā)的治療缺血性腦卒中的有效中藥方劑，方中選用黃芪為君藥，借其力專，大補(bǔ)脾胃元?dú)猓顨馔鷦t血活，血活則瘀除；川芎活血行氣，氣行則血行，是為臣藥；地龍、僵蠶具有通經(jīng)活絡(luò)、化疾熄風(fēng)的功效，兩者均為佐藥，諸味配合，共奏益氣活血通絡(luò)、祛風(fēng)化痰之效。多年來，腦泰方在防治急性腦缺血性損傷方面取得諸多研究成果，能顯著減少腦缺血所致的大鼠神經(jīng)元損傷及促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。課題組前期通過對腦泰方有效物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析，在差異蛋白中發(fā)現(xiàn)了鐵蛋白的異常改變，進(jìn)而從鐵代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)角度開創(chuàng)了中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中機(jī)制研究的新方向[28]。

去鐵酮是FDA批準(zhǔn)的口服鐵螯合劑，且在分化的人類多巴胺神經(jīng)元前體細(xì)胞中，去鐵酮能夠特異性抑制由erastin和谷氨酸引起的鐵死亡[5]。本研究以鐵死亡抑制劑去鐵酮為陽性對照藥物，通過MCAO線栓法制備大鼠模型，觀察腦組織梗死體積及形態(tài)結(jié)構(gòu)、尼氏體數(shù)目、神經(jīng)元內(nèi)鐵聚集水平，并檢測腦組織HSF1、HSPB1、TFR1和FTH1蛋白表達(dá)水平及腦鐵、丙二醛、活性氧含量。結(jié)果顯示，腦泰方可上調(diào)大鼠腦組織HSF1、HSPB1、FTH1蛋白表達(dá)及下調(diào)TFR1蛋白表達(dá)，降低腦組織鐵、丙二醛及活性氧含量；增加缺血腦組織尼氏體數(shù)目；減輕腦組織病理損傷及神經(jīng)功能缺失；減少腦組織梗死體積。

綜上所述，由于細(xì)胞內(nèi)鐵離子的異常沉積，活性氧及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的過度產(chǎn)生是鐵死亡的主要的生化指標(biāo)，且鑒于HSF1/HSPB1通路對鐵死亡的負(fù)向調(diào)控作用，結(jié)合本研究的結(jié)果，推測腦泰方可能通過上調(diào)HSF1/HSPB1通路，抑制TFR1的表達(dá)以減少神經(jīng)元鐵的吸收，上調(diào)FTH1的表達(dá)以增加鐵蛋白的鐵存儲，以此調(diào)控鐵代謝穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)而抑制了因過量的鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧及隨后的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物引起的缺血性腦卒中神經(jīng)元鐵死亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Katan M, Luft A. Global burden of stroke [J]., 2018, 38(2): 208-211.

[2] Zhou B, Liu J, Kang R,. Ferroptosis is a type of autophagy-dependent cell death [J]., 2020, 66: 89-100.

[3] Toyokuni S, Ito F, Yamashita K,. Iron and thiol redox signaling in cancer: An exquisite balance to escape ferroptosis [J]., 2017, 108: 610-626.

[4] Galaris D, Barbouti A, Pantopoulos K. Iron homeostasis and oxidative stress: An intimate relationship [J]., 2019, 1866(12): 118535.

[5] Chen X, Yu C, Kang R,. Iron metabolism in ferroptosis [J]., 2020, 8: 590226.

[6] Tuo Q Z, Lei P, Jackman K A,. Tau-mediated iron export prevents ferroptotic damage after ischemic stroke [J]., 2017, 22(11): 1520-1530.

[7] Datta A, Sarmah D, Mounica L,. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy [J]., 2020, 11(6): 1185-1202.

[8] 賀運(yùn)河, 葛金文, 成戰(zhàn)鷹, 等. 腦泰方對氣虛血瘀型腦梗死患者血漿TXB2、6-Keto-PGF1α及血清TNF-α含量的影響 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2002, 9(4): 16-17.

[9] 黃娟, 廖君, 彭熙煒, 等. 腦泰方對腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)Nrf2、HO-1和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白表達(dá)的影響 [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017, 33(10): 1467-1472.

[10] 廖君, 夏興, 石詠梅, 等. 腦缺血大鼠海馬CA2區(qū)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及腦泰方提取物干預(yù)研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014, 29(5): 1406-1411.

[11] Sun X, Ou Z, Xie M,. HSPB1 as a novel regulator of ferroptotic cancer cell death [J]., 2015, 34(45): 5617-5625.

[12] Ferns G, Shams S, Shafi S. Heat shock protein 27: Its potential role in vascular disease [J]., 2006, 87(4): 253-274.

[13] Teramoto S, Shimura H, Tanaka R,. Human-derived physiological heat shock protein 27 complex protects brain after focal cerebral ischemia in mice [J]., 2013, 8(6): e66001.

[14] van der Weerd L, Tariq Akbar M, Aron Badin R,. Overexpression of heat shock protein 27 reduces cortical damage after cerebral ischemia [J]., 2010, 30(4): 849-856.

[15] Lan B, Ge J W, Cheng S W,. Extract of Naotaifang, a compound Chinese herbal medicine, protects neuron ferroptosis induced by acute cerebral ischemia in rats [J]., 2020, 18(4): 344-350.

[16] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S,. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]., 1989, 20(1): 84-91.

[17] Au A, Griffiths L R, Irene L,. The impact of APOA5, APOB, APOC3 and ABCA1 gene polymorphisms on ischemic stroke: Evidence from a meta-analysis [J]., 2017, 265: 60-70.

[18] Deb P, Sharma S, Hassan K M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis [J]., 2010, 17(3): 197-218.

[19] Tang D, Chen X, Kang R,. Ferroptosis: Molecular mechanisms and health implications [J]., 2021, 31(2): 107-125.

[20] Dixon S J, Lemberg K M, Lamprecht M R,. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death [J]., 2012, 149(5): 1060-1072.

[21] Xie Y, Hou W, Song X,. Ferroptosis: Process and function [J]., 2016, 23(3): 369-379.

[22] Kwon M Y, Park E, Lee S J,. Heme oxygenase-1 accelerates erastin-induced ferroptotic cell death [J]., 2015, 6(27): 24393-24403.

[23] Li J, Cao F, Yin H L,. Ferroptosis: Past, present and future [J]., 2020, 11(2): 88.

[24] Georgopoulos C, Welch W J. Role of the major heat shock proteins as molecular chaperones [J]., 1993, 9: 601-634.

[25] Wu C. Heat shock transcription factors: Structure and regulation [J]., 1995, 11: 441-469.

[26] 王樹林, 安芳. 中藥對腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 神經(jīng)藥理學(xué)報(bào), 2014, 4(3): 39-48.

[27] 趙薇, 李方江, 王樹. 腦缺血損傷保護(hù)作用機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 神經(jīng)藥理學(xué)報(bào), 2014, 4(6): 55-63.

[28] 王國佐, 龔盛強(qiáng), 蘭斌, 等. 腦泰方干預(yù)的MCAO模型大鼠血漿差異蛋白篩選及其生物信息學(xué)分析 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2018, 45(12): 2473-2477.

Mechanism of Naotaifang on ischemic stroke through regulating cellular iron transport and inhibiting ferroptosis

RAO Zheng-qing, MEI Zhi-gang, GE Jin-wen, YANG Mei, MI Zhao-di, LAN Bin, YANG Tong, WANG Guo-zuo

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To explore whether Naotaifang (腦泰方) reduces brain iron deposition by regulating heat shock factor 1 (HSF1)/heat shock proteins B1 (HSPB1) pathway, inhibiting the deposition of reactive oxygen species and the production of lipid peroxidation products, reducing neuronal ferroptosis, and exerting a protective effect on cerebral ischemia injury.SD rats were randomly divided into sham group, model group, Naotaifang (27 g/kg) group ang deferiprone (125 mg/kg) group, drugs were given for intervention. Cerebral ischemia rats model was prepared by middle cerebral artery occlusion (MCAO) method, and the neurological function was scored 2 h after operation. TTC staining was used to detect cerebral infarct volume; HE staining was used to observe the morphology and damage; Nissl staining was used to observe the number of Nissl bodies; Prussian blue staining was used to observe the level of iron accumulation in neurons; Western blotting and immunohistochemical experiments werre used to detect the protein expression levels of HSF1, HSPB1, transferrin receptor 1 (TFR1) and ferritin heavy polypeptide1 (FTH1); Iron ion detection kits, malondialdehyde detection kits and reactive oxygen detection kits were used to detect brain iron, malondialdehyde and reactive oxygen content.Compared with model group, the cerebral infarction volume of rats in Naotaifang group was decreased, and neurological function score was decreased (< 0.01); Nissl bodies in cerebral ischemia area was increased, and the degree of cell damage was decreased; Number of iron-containing aggregate granule cells were decreased; Brain iron, malondioxide aldehyde and reactive oxygen content were decreased (< 0.05, 0.01); HSF1, HSPB1 and FTH1 protein expressions were up-regulated (< 0.05, 0.01), and TFR1 protein expression was down-regulated (< 0.05).Naotaifang may up-regulate HSF1/HSPB1 pathway, inhibit the expression of TFR1 to reduce neuronal iron absorption, and increase the expression of FTH1 to increase the iron storage of ferritin, thereby regulating the steady-state balance of iron metabolism, inhibiting excessive ferroptosis of neurons in ischemic stroke caused by active oxygen produced by Fenton reaction and subsequent lipid peroxide.

stroke; ferroptosis; HSF/HSPB1 pathway; cellular iron transport; Naotaifang

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6552 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.013

2021-05-07

湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2020JJ4467）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（19A378）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（18C0379）

饒政清，男，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病防治研究。E-mail: 1054898967@qq.com

王國佐，男，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病防治研究。E-mail: 1586074663@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]